Financiamento para o nosso trabalho é fornecido pelo NIH, a March of Dimes, ea Sociedade Americana do Câncer.

Versões modificadas deste abordagem transgênese foram inicialmente descritas em 1 e 2. A. preparação núcleos do esperma Este método de preparação núcleos é adaptado de Murray 3, mas os inibidores da protease foram omitidos como elas interferem com o desenvolvimento subseqüente de ovos transplantado com núcleos de esperma. Alíquotas são congeladas a -80 ° C e podem ser usados ​​para transplantes por aproximadamente 6 meses. Todas as soluções devem ser preparadas e colocadas no gelo antes de começar a preparação. <ol><li> Anestesiar 1-2 adultos do sexo masculino X. laevis por imersão em tricaina por pelo menos 20 min seguido por mielotomia; remover os testículos. </li><li> Rolar os testículos em uma toalha de papel para remover o sangue, vasos sangüíneos e gordura corporal, lavá-los brevemente em uma placa de Petri contendo 60 milímetros 1XMMR, e remover quaisquer peças adicionais de gordura corporal. Tome cuidado para não furar os testículos, já que este libera o esperma. </li><li> Transferência testículos a uma placa de Petri e seco de 60 mm e testículos macerar com uma pinça até que não haja pedaços visíveis. Maceração deve ser feito tanto quanto possível para obter altos rendimentos de núcleos. </li><li> Adicionar tampão preparação 2mls frio nuclear (NPB; 1X de ações) para o macerado e gentilmente pipeta cima e para baixo. </li><li> Squirt macerar por cerca de quatro espessuras de gaze em um funil, a coleta em um tubo de 15 mL (Falcon por exemplo, 2059); Lavar prato com 8mLs do NPB e colocar este lavar através da gaze, recolhendo-a do tubo. Com as mãos enluvadas espremer a gaze para coletar líquido restante no tubo. </li><li> Pellet o esperma a 3.000 rpm por 10 min. a 4 ° C em um rotor de caçamba móvel (1480g por exemplo, em um rotor Sorvall HB-4 ou equivalente) com os adaptadores de tubo apropriada. NPB 8ml adicionar a este tubo e pipetar cima e para baixo com uma pipeta de 10 mL para ressuspender pellet;; sobrenadante decantar girar novamente como sobrenadante acima e decantar. Equilibrar 1mL de NPB à temperatura ambiente durante o spin. </li><li> Ressuspender pellet em 1mL NPB temperatura ambiente usando a 1 mL pipetteman ponta, adicionar 50μl de 10mg/mL lysolecithin preparados na hora, misture delicadamente e incubar por 5 min. à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 10 mL BSA 1XNPB frio +3% ao tubo para parar a reação lysolecithin, misture delicadamente, e spin down por 10 min a 3000 rpm em um rotor de caçamba móvel. Sobrenadante decantar. O pellet lysolecithin tratados deve olhar um pouco mais translúcido (branco opaco menos) do que tinha antes do tratamento lysolecithin. </li><li> Decantar o sobrenadante e ressuspender sedimento em 5 mL frio NPB BSA 0,3%, misture delicadamente com uma pipeta de 10 mL e spin down por 10 minutos a 3000rpm como acima. </li><li> Decantar o sobrenadante e ressuspender pellet em 500μl de tampão de espermatozóides de armazenamento e transferência para um tubo de 1,5 mL. Este é agora o seu estoque núcleos. Loja no gelo enquanto você verificar o rendimento dos núcleos. </li><li> Para verificar o rendimento dos núcleos, coloque 98 mL de tampão de diluição do esperma (SDB), 1 ml do estoque nuclear e 1μl de diluição 1:100 do estoque Hoechst em um tubo Eppendorf 1,5 ml. Misture o estoque nuclear muito bem usando um razor-cortada (ou grande abertura) ponteira pouco antes de retirar o mL 1. Misture a SDB diluído / Hoechst / núcleos muito bem e deixe uma pequena quantidade de fluxo para a câmara de um hemocitômetro de Neubauer melhorada por ação capilar. Contagem de núcleos em uma praça do hemocitômetro sob um microscópio composto. De um homem, você deve obter a contagem de pelo menos 100-200 (X10 4 células / mL) para esta diluição de 1:100 do estoque para uma concentração de ações sem diluição de 1-5 2X10 células / ml. Se o seu estoque é menos concentrada, vamos resolver os núcleos por várias horas, remover alguns dos sobrenadante, e recontagem. Deixe os núcleos a 4 ° C durante a noite para permitir que o glicerol para penetrar melhor para a criopreservação; em seguida, misture o estoque nuclear bem com um grande orifício da ponta da pipeta, prepare alíquotas 20μl, e congelar em nitrogênio líquido. </li></ol> B. Elaboração de Extrato de Alta Velocidade Este método é adaptado de Murray 3 e produz um extrato interfase citosólica que irá promover a descondensação da cromatina inchaço e parcial dos núcleos espermáticos acrescentou. Extrato pode ser congelada em pequenas alíquotas a -80 ° C e descongeladas antes de usar. <ol><li> 3-5 dias antes da injeção de HCG, primeiro 12/08 fêmea adulta X. laevis pela injeção de 50 U de PMSG no saco linfático dorsal. A noite antes da preparação extrair, injetar cada sapo com 500 unidades HCG e coloque 2 rãs / recipiente em 2 1XMMR litros. Uma vez que um sapo com lise ou ativar os ovos podem comprometer a preparação do extracto, é conveniente separar as rãs em pares para a ovulação. </li><li> Na manhã seguinte, prepare e chill todas as soluções antes de iniciar a preparação. Suavemente, manualmente expulsar os ovos de cada sapo em grande beakers contendo 1X MMR. Tela os ovos em cada recipiente e omitir qualquer lotes de ovos com sinais de lise mottling, ou a activação (visualizada pela contração da pigmentação no hemisfério animal) do procedimento. Coleta de ovos ininterrupta, mesmo com a pigmentação. Ovos bons também podem ser coletados a partir do MMR 1X nos baldes sapo. O volume total de ovos deve ser&gt; 100 mL da 8-12 fêmeas. </li><li> De-jelly os ovos. Para fazer isso, remova MMR, tanto quanto possível, adicione uma pequena quantidade de solução de cisteína, e agite os ovos. Substituir com solução de cisteína fresco várias vezes durante de-gelatinizante. De-geléia cada lote de ovos separadamente e descartar lotes com quebra ou a ativação do ovo. Combine o restante dos ovos. </li><li> Lave os ovos quatro vezes em 35 ~ mL de tampão extract (XB), e depois duas vezes em 25 mL de CSF-XB com os inibidores da protease. </li><li> Para embalar os ovos: transferência dos ovos em tubos de Beckman UltraClear. Permitir que os ovos para resolver. Remover o máximo CSF-XB possível. Centrifugar os ovos usando um Beckman SW 40 Ti rotor (rotor ou similar) a 1000 rpm (150g) de ~ 60 seg a 4 ° C. Retire o excesso de solução a partir do topo dos ovos embalados. </li><li> Para esmagar os ovos e gerar citoplasmática extrair: centrifugar os ovos em 10.000 rpm (16.000 g) por 10 min a 4 ° C. Os ovos devem separar em três camadas: lipídica (top), citoplasma (centro), e gema (parte inferior). Coletar a camada citoplasmática de cada tubo com uma agulha de calibre 18, inserindo a agulha através do tubo na base da camada de citoplasma. Transferência de citoplasma de um novo tubo de Beckman UltraClear no gelo. </li><li> Adicionar inibidores da protease para o citoplasma isolado para uma concentração final de 1X. Recentrifuge o citoplasma a 16.000 g por 10 min a 4 ° C. Recolher o citoplasma esclareceu como descrito acima. Esperam obter 0,75-1 citoplasma mL / sapo. </li><li> Adicione 1 / 20 do volume de extrato de mix de energia para a amostra. Transferência de citoplasma em tubos de paredes espessas de policarbonato para o TL-100 ultracentrífuga Beckman. Tubos de armazenar cerca de 3 mL cada um e deve ser pelo menos metade. </li><li> Adicionar 1 M CaCl 2 a cada tubo a uma concentração final de 0,4 mM. Incubar os tubos durante 15 min à temperatura ambiente. Este inativa CSF e empurra o extrato em interfase. </li><li> Balanço dos tubos e centrifugar-los em um TL-100 ultracentrífuga Beckman usando um TLA-100,3 rotor em 70.000 rpm (200.000 g) por 1,5 horas a 4 ° C. O citoplasma se fracionar em quatro camadas, de cima para baixo: lipídico, citosol membrana, / mitocôndrias e glicogênio / ribossomos. </li><li> Remover a camada citosólica de cada tubo (~ 1 se mL 2-3 mL foi carregado para dentro do tubo) através da inserção de uma seringa no topo do tubo através da camada lipídica. Alienar a fração citosólica de tubos fresco e recentrifuge as amostras a 70.000 rpm (200.000 g) por 20 min a 4 ° C. </li><li> Alíquota do sobrenadante em 25 mL em alíquotas de 0,5 mL tubos. Quick-congelar as alíquotas em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C até o uso. Para determinar se o extrato é eficaz, os núcleos do esperma pode ser incubadas no extrato e corados com Hoechst para determinar se os núcleos visivelmente swell (engrossar e alongar) dentro de 10 min da adição à temperatura ambiente. </li></ol> C. reação Transgénese e transferência nuclear Importante: Verifique se soluções, equipamentos e rãs estão todos prontos antes de começar uma reação. Uma vez que você começar, você deve proceder com a reação utilizando o calendário aproximado descrito a seguir, já que muitos componentes não permanecer estável por&gt; 30 minutos. Enquanto o estoque núcleos do esperma é mantido em gelo, reações transgênese (ambos diluído e concentrado) deve ser mantido em temperatura ambiente. <ol><li> Primeiro-rãs do sexo feminino. À noite antes de transgênese, vários injetar (3-5) sapo adulto do sexo feminino com 800 unidades de HCG no saco linfático dorsal para obter ovos frescos início no dia seguinte. </li><li> O dia do procedimento transgênese, preparar ou trazer a temperatura das soluções necessárias para a transgênese: <ol class="lalpha"><li> Cisteína feita recentemente (2,5% em 1XMMR, pH8.0). Você vai precisar de várias centenas de mililitros para ser usado naquele dia. </li><li> 0.2XMMR Ficoll 6% para os pratos de transplante e recuperação de embriões transgênicos e 0.2XMMR 100 mcg / mL de gentamicina (sem Ficoll) para a criação de embriões. Soluções não devem ser mais quente do que 18-21 ° C e embriões transgênicos devem ser levantados através de clivagens início a temperaturas entre 16 e 21 ° C, já que temperaturas mais altas afetar tanto a freqüência de transgênese e desenvolvimento embrionário. </li><li> Descongelar e atingir a temperatura ambiente alíquotas congeladas de DRS (tampão de diluição do esperma) para transplantes do dia, descongelar o extrato de alta velocidade e colocar no gelo, e preparar um 100mM MgCl 2 solução. </li><li> Sair ªagarose e pratos de injeção e preencher com MMR / Ficoll solução, e configurar e executar o pré-bomba de infusão para estabilizar o fluxo. </li><li> Verifique se as rãs do sexo feminino são poedeiras e ovos são de alta qualidade. Idealmente, os ovos devem ter um córtex empresa (manter a forma depois de-gelatinizante). </li></ol></li><li> Configurar uma reação transgenia: <ol class="lalpha"><li> Muito delicadamente (usando uma ponteira cortada) misturar o estoque núcleos e combinam em um tubo Eppendorf 1,5 ml: Núcleos 4μl (~ 4 8X10-5 núcleos) 2μl linearizada plasmídeo (100ng/μl) Incubar 5 minutos à temperatura ambiente. </li><li> enquanto processo de incubação é, diluir 0.5μl da enzima de restrição em 4.5μl H 2 O e adicione 1μl da enzima diluída para 18μl da SDB, 2μl de MgCl 2 e 2μl de extrato de alta velocidade. Adicione esta mistura para a reação de núcleos de plasmídeo. Incubar mais 10 minutos para inchar os núcleos. </li><li> Durante esta incubação, squeeze ovos 2-3 sapos e geléia de-cisteína em solução. Lave-os bem (5x) com 1XMMR, e usar uma pipeta de largura deu a transferência de 400-500 ovos dejellied para cada prato bem agarose contendo 0,2 X Ficoll MMR 4%. Isso normalmente leva cerca de 10 minutos, então quando pratos de ovos são preparados a reação é geralmente pronto para diluir. </li><li> Cerca de 15-20 minutos após o início do passo, misture delicadamente a reação (núcleos extrair / / DNA) com uma ponta cortada e adicionar cerca de 5μl a 150 SDB mL à temperatura ambiente. Núcleos nesta mistura diluída é estável por cerca de 1h., Enquanto eles não retêm a capacidade de transplante, desde quando saiu da mistura concentrada. </li></ol></li><li> Carga a agulha: Misture a reação diluída, preparada acima muito delicadamente com uma ponta de largura orifício pipeta, em seguida, carregar a agulha rapidamente, como núcleos resolverão rapidamente no tubo. Para protelar o agulha, coloque um pedaço de tubo de Tygon bem no final de uma ponteira cortada 200μl. Desenhe a solução para a ponta da pipeta, em seguida, conectar o tubo à agulha e deixar a solução para inserir a agulha por gravidade ou levemente pressionando o êmbolo da pipeta. </li><li> Anexar agulha para começar a tubulação e bomba de transplantes de núcleos. Injecções devem ser rápidas, rasas e aproximadamente perpendicular à membrana do óvulo plasma para evitar fazer danos. A uma taxa de fluxo sugerido (10nl/sec), manter a agulha dentro do ovo para ~ 0,5 segundos. Você deve concluir 1-2 pratos de transplantes dentro de 20-30 minutos. </li></ol> Após as injeções, deixe os pratos em 16-20 ° C até embriões atingiram o estágio de célula 4-8. Classificar os embriões cleaving longe de seus vizinhos não-clivagem, transferindo (com um copo de pipeta Pasteur com ponta de aproximadamente o mesmo diâmetro de um ovo) para um prato grande de doce 0.2XMMR Ficoll 4%. Subdividir a clivagem de embriões em grupos menores (10-15 embriões / poço de uma placa de 6 poços) e cultura em 0.2XMMR (sem Ficoll) 100 mcg / mL de gentamicina através do desenvolvimento precoce. Embriões devem ser verificados durante a gastrulação com qualquer embriões morrendo removidas imediatamente e os meios de comunicação mudado quando necessário. Solução de problemas: <ol><li> Agulha é bloqueado: fluxo de solução da agulha deve ser aparente durante os transplantes. Se a agulha for bloqueada por partículas visíveis, alterar agulhas ou tentar remover os destroços por corte a ponta com uma pinça e empurrando solução através da agulha. </li><li> Sem ovos clivagem são obtidos: verifique se diluições de núcleos de esperma e de volume de injeção são adequadas e que a agulha não foi bloqueado durante o transplante. Se o volume de injeção é muito alto, os ovos também podem não decompor e, em vez mostrar pigmentação descoloridos ou danos. </li><li> Embriões morrem durante a gastrulação. Vários fatores podem aumentar a sobrevivência embrionária: <ol><li> tomar cuidado com os núcleos durante a preparação ea reação enzimática. Núcleos descondensada são frágeis e precisam ser transplantados usando o calendário acima. Não colocá-los no gelo. </li><li> O dano cromossômico sustentada pelos núcleos do esperma durante a reação enzimática e transferência nuclear afeta tanto a freqüência de transgênese e o desenvolvimento normal dos embriões. Danos cromossômicos para os núcleos aumenta a eficiência da transgenia, mas afeta negativamente a sobrevivência / desenvolvimento normal. Diminuindo ou omitindo enzima de restrição durante a incubação da enzima podem aumentar a taxa de desenvolvimento normal, mas pode diminuir a freqüência de transgênese ou número de cópias do plasmídeo introduzido no genoma do embrião. </li><li> Se o atraso for blástula através de embriões gástrula mostrar sinais de descoloração ou morte celular, também é possível que um reagente utilizado para os transplantes era tóxico para os ovos. Além disso, se ovos não têm um córtex empresa, eles podem sofrer exogastrulation e não para gerar normais de pós-gástrula embriões. </li></ol></li><li> O número de embriões expressando o transgene é baixa. Aumentar a quantidade de enzima de restrição. </li></ol> Representante Transgênicos Resultados Embrião <img src="/files/ftp_upload/2010/2010fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Embriões transgênicos resultantes de transferências nuclear deve ser levantada até a expressão do promotor de interesse é visível. Na Figura 1 acima, um promotor de actina de músculo drives expressão da proteína verde fluorescente no somitos deste girino transgênicos.

<ol>
	<li>Kroll, K. L., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Xenopus+embryos+from+sperm+nuclear+transplantations+reveal+FGF+signaling+requirements+during+gastrulation.">Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation.</a> Development. 122, 3173-3183 (1996).</li><li>Amaya, E., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+generating+transgenic+frog+embryos.">A method for generating transgenic frog embryos.</a> Methods Mol Biol. 97, 393-414 (1999).</li><li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+extracts.">Cell cycle extracts.</a> Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).</li><li>Hartley, K. O., Hardcastle, Z., Friday, R. V., Amaya, E., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Xenopus+embryos+reveal+that+anterior+neural+development+requires+continued+suppression+of+BMP+signaling+after+gastrulation.">Transgenic Xenopus embryos reveal that anterior neural development requires continued suppression of BMP signaling after gastrulation.</a> Developmental Biology. 238, 168-184 (2001).</li><li>Karaulanov, E., Kn&#246;chel, W., Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+BMP4+synexpression+in+transgenic+Xenopus.">Transcriptional regulation of BMP4 synexpression in transgenic Xenopus.</a> EMBO J. 23, 844-856 (2004).</li><li>Ogino, H., Fisher, M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+a+head-field+selector+Otx2+and+Notch+signaling:+a+mechanism+for+lens+specification.">Convergence of a head-field selector Otx2 and Notch signaling: a mechanism for lens specification.</a> Development. 135, 249-2458 (2008).</li><li>Taylor, J. J., Wang, T., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tcf-+and+Vent-binding+sites+regulate+neural-specific+geminin+expression+in+the+gastrula+embryo.">Tcf- and Vent-binding sites regulate neural-specific geminin expression in the gastrula embryo.</a> Developmental Biology. 289, 494-506 (2006).</li><li>Marsh-Armstrong, N., Huang, H., Berry, D. L., Brown, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+transmission+of+transgenes+in+Xenopus+laevis.">Germ-line transmission of transgenes in Xenopus laevis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 14389-14393 (1999).</li><li>Offield, M. F., Hirsch, N., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Xenopus+tropicalis+transgenic+lines+and+their+use+in+studying+lens+developmental+timing+in+living+embryos.">The development of Xenopus tropicalis transgenic lines and their use in studying lens developmental timing in living embryos.</a> Development. 127, 1789-1797 (2000).</li></ol>

Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Animal Care e Use Comité na Washington University School of Medicine.

Para cada construção de transgênicos a serem testados, geralmente transplante de núcleos em 500-1000 ovos; nessa escala, podemos gerar embriões transgênicos expressando até 10 construções diferentes por dia, dependendo de quantas mulheres são induzidas a pôr ovos. Desses transplantes, cerca de um terço do cleave ovos e 60-80% destes embriões cleaving proceder através gastrulação normalmente. Dependendo das condições de reação utilizadas, entre 10-50% desses embriões expressar o transgene de interess...

A. preparação núcleos do esperma Reagentes: <ol><li> 1X MMR (2mM CaCl 2, HEPES 5mM, pH 7,5, 2mM KCl, 1 mM MgCl 2, 100mM NaCl). </li><li> 0,1% tricaina metanosulfanato (MS222, ácido aminobenzóico etil éster, Sigma A-5040), bicarbonato de sódio a 0,1%. Dissolvem na água. </li><li> Manteiga Preparação 2X Nuclear (NPB). No dia da preparação núcleos espermáticos, compõem 30 ml de NPB 2X de alíquotas das soluções estoque armazenado congelado: 500 mM de sacarose (1,5 M de ações), 30 mM HEPES (stock 1M; titular com KOH para que pH 7,7 é de 15 mM), 1 trihydrochloride espermidina mM (Sigma S-2501, 10 ações mM), 0,4 mM tetrahidrocloreto espermina (Sigma S-1141, 10 ações mM), 2 mM ditiotreitol (Sigma D-0632, 100 ações mM), 2 mM EDTA (500 mM EDTA, pH 8,0). </li><li> Use o 2XNPB para fazer a. 30ml 1X NPB, b. 10ml 1XNPB +3% BSA (fração V, Sigma A-7906), c. BSA 1XNPB 5ml 0,3%. </li><li> Lysolecithin: 100 l de 10 mg / ml L-α-LYSO-lecitina, gema de ovo (Calbiochem, 440154); dissolver à temperatura ambiente imediatamente antes da utilização. Loja de ações sólida a 20 ° C. Descartar o pó de ações se torna-se pegajosa. </li><li> Albumina sérica bovina (BSA), 10% (w / v) BSA (fração V, Sigma A-7906) Maquiagem 5 ml na água no dia da preparação núcleos do esperma. </li><li> Esperma de armazenamento de buffer (1 ml) 1X NPB, glicerol 30%, BSA 0,3%. </li><li> Tampão de diluição do esperma: 250 mM de sacarose, 75 mM KCl, 0,5 mM trihydrochloride espermidina, espermina tetrahidrocloreto 0,2 mM. Titular de pH 7,3-7,5 e 0,5-1 loja alíquotas ml a 20 ° C. </li><li> Hoechst No. 33342 (Sigma B-2261): 10 ações mg / ml em dH 2 O, armazenar em um recipiente apertado luz a 20 ° C. </li></ol> Equipamento: <ul><li> Rotor de caçamba móvel e centrifugar </li><li> gaze </li><li> instrumentos de dissecação (pinças e tesouras) </li><li> microscópio de fluorescência </li><li> funil </li><li> luvas </li><li> hemocitômetro </li><li> agulhas (26 gauge) </li><li> toalhas de papel </li><li> placas de Petri (60 mm) </li><li> pipetas </li><li> plástico (5 e 10 ml) </li><li> Pipetman dicas (1 ml e 200μl) </li><li> Seringas (1 ml) </li><li> tubos (14 ml; Falcon, 2059) </li><li> tubos </li><li> microcentrífuga (1,5 ml) </li></ul> B. Elaboração de Extrato de Alta Velocidade Reagentes: <ol><li> Modificado 1X Marc da campainha (MMR): 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM HEPES, pH 7.5. Prepare um estoque de 10X, e ajustar o pH com NaOH para 7,5. </li><li> 20X tampão Extract (XB) estoque de sal: 2 M KCl, 20 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, filtram-esterilizar e armazenar a 4 ° C. </li><li> Extrato de buffer (XB; recém-preparados e armazenados em gelo): 1X sais XB, 50 mM de sacarose, HEPES 10 mM (1 M de ações, titulada com KOH de modo que o pH é de 7,7 quando diluído a 15 mM; filtro de esterilizar e armazenar em alíquotas a 20 ° C). Prepare cerca de 100 ml. </li><li> 2% (w / v) L-Cisteína cloridrato de 1-hidrato: Formada em 1X sais XB antes de usar e titulada até pH 7,8 com NaOH. Prepare cerca de 300 ml. </li><li> CSF-XB: 1X sais XB, 1 mM MgCl 2 (além de MgCl 2 apresentam em sais XB; concentração final 2 mM), 10 mM HEPES, pH 7,7, 50 mM de sacarose, 5 mM EGTA, pH 7.7. Prepare 50 ml. </li><li> Inibidores da protease: Mistura de leupeptin, chymostatin e pepstatin, cada dissolvido para uma concentração final de 10 mg / ml em dimetil sulfóxido (DMSO). Loja em pequenas alíquotas a 20 ° C. </li><li> 1 M CaCl 2. </li><li> Cabaz energético: 150 fosfato de creatina mM, 20 mM ATP, 20 mM MgCl 2. </li><li> Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG): 100 U / ml PMSG (PG600 ®, Intervet, Inc., 021.825). Dissolver em água e armazenadas a 20 ° C. </li><li> Gonadotrofina Coriônica Humana (HCG): 1000 U / ml HCG (CHORULON ®, Intervet, Inc., 057.176). Dissolver em água e armazenadas a 4 ° C. </li></ol> Equipamento: <ul><li> Xenopus laevis fêmeas </li><li> Agulhas (18 e 26 gauge) </li><li> Pipeta Pasteur </li><li> ampla furo </li><li> Seringas (1 mL) </li><li> Tubos de microcentrífuga (0,5 mL) </li><li> Tubos, espessura de parede de policarbonato (Beckman, 349622) </li><li> Tubos, UltraClear (14 x 95 mm; Beckman, 344060) </li><li> Ultracentrífuga e rotores (por exemplo, Beckman TL-100 com rotores SW 40 Ti e TLA-100,3) </li><li> Copos para coleta de ovos </li><li> Baldes ou recipientes para a realização de rãs do sexo feminino (por exemplo, 4-L copos de plástico com tampa mesh). </li></ul> C. Nuclear transplante. Reagentes: <ol><li> Agarose 2,5% em 0.1XMMR (para fazer pratos de injeção) </li><li> Cisteína 2,5% em 1XMMR, PH8.0, preparado no dia de uso </li><li> Ficoll </li><li> 10 mg / ml de gentamicina (estoque 1000X) </li><li> extrato de ovos de alta velocidade (veja acima) </li><li> 100 MgCl 2 </li><li> MMR 10X (veja acima) </li><li> Enzima de restrição (por exemplo, NotI de New England Biolabs) </li><li> Tampão de diluição do esperma (SDB; veja acima) e núcleos de espermatozóides (veja acima) </li><li> Gonadotrofina Coriônica Humana (HCG) como acima </li><li> óleo mineral (Sigma, M8410) </li><li> Plasmídeo linearizado para ser apresentado como o transgene: Prepare plasmídeo linearizado em uma concentração de cerca de 100 ng / mL em estéril, livre de nuclease água (evitamos Tris EDTA e contendo buffers, que são pouco tóxicos para os embriões). A enzima de restrição usado para linearizar o plasmídeo não tem que ser o mesmo que o utilizado na reação de transferência nuclear. Nós usamos geralmente NotI para todas as reações, independentemente do que é plasmídeo linearizado com. Alguns calibração da diluição enzima usada na reação pode ser necessário, como enzimas em excesso pode causar efeitos adversos sobre a pós-gástrula desenvolvimento. Plasmídeo pode ser purificado de várias maneiras diferentes: costumamos usar o kit de purificação QIAquick Qiagen PCR de acordo com as instruções do fabricante; purificação de uma única faixa de um gel não é necessário. Se plasmídeo é purificado usando fenol / clorofórmio e precipitação extrações de etanol, a certeza de remover todos os vestígios de orgânicos e etanol. </li></ol> Equipamento: Pratos de agarose injectável: Em uma placa de Petri 60 milímetros de plástico, colocar uma pequena 35mmX35mm pesar de barco no fundido agarose 2,5% em 0.1XMMR água para criar uma depressão com um fundo revestido agarose para o preenchimento com os ovos. Uma vez agarose endureceu wrap, em parafilme e armazenar a 4 ° C até o uso. Faça 2-3 pratos com antecedência para cada reação transgênico você pretende fazer. Bomba de infusão: Nós usamos uma bomba de infusão única seringa do Aparelho Harvard, equipado com uma seringa de 3 cc / agulha cheia de óleo mineral (Sigma M-8410). Blunt a ponta da agulha da seringa (para mantê-lo de perfurar a tubulação) e conectar o tubo tygon bem. Funcionar a bomba em ~ 10nl/sec; isso pressupõe que o tempo a agulha é em cada ovo haverá seg maior que 1. Bomba deve ser pré-run por vários minutos antes de transgênese de partida para o dia para garantir que o êmbolo da seringa para fique nivelada com o pistão e esse fluxo constante positiva de óleo para fora do tubo está ocorrendo. Agulhas para a transferência nuclear. Utilizando um extrator de micropipeta, gerar agulhas com comprimento, dicas inclinada. Clipe estes com um fórceps sob um microscópio de dissecação equipado com um micrômetro ocular para obter uma abertura ~ micron 80 com uma forma chanfrada. Outros equipamentos: Xenopus laevis fêmeas, estereomicroscópio, incubadora, micromanipulador, puxador de microinjeção agulha (por exemplo, modelo P-87, Sutter), agulhas de seringa (26 gauge), agulhas microinjeção de vidro, micrômetro ocular calibrada para recorte de dicas microinjeção agulha de diâmetro 80μm, placas de Petri, pesar barcos 35mm, tubos de Tygon (ID = 1 / 32 pol, OD = 3 / 32 pol)

production of transgenic xenopus laevis by restriction enzyme mediated integration and nuclear transplantation

Integração estável dos produtos gene clonado no genoma Xenopus é necessário para controlar o tempo e lugar de expressão, para expressar genes em fases posteriores do desenvolvimento embrionário, e para definir como potenciadores e promotores de regular a expressão de genes no interior do embrião. O protocolo demonstrado aqui pode ser usado para produzir de forma eficiente embriões transgênicos Xenopus laevis. Esta abordagem transgenia envolve três partes: 1. Núcleos espermáticos são isolados do adulto X. testículo laevis pelo tratamento com lysolecithin, que permeabilizes da membrana plasmática de espermatozóides. 2. Extrato de ovo é preparado por centrifugação de baixa velocidade, além de cálcio para causar o extrato para avançar para a interfase do ciclo celular, e uma centrifugação de alta velocidade para isolar citosol interfase. 3. Nuclear transplante: os núcleos e extrato são combinados com o DNA do plasmídeo linearizado para ser apresentado como o transgene e uma pequena quantidade da enzima de restrição. Durante uma reação de curto, extrato de ovo parcialmente decondenses a cromatina de espermatozóides ea enzima de restrição gera quebras cromossômicas que promovem a recombinação do transgene no genoma. Os núcleos de espermatozóides tratados são então transplantados para ovos não fertilizados. Integração do transgene geralmente ocorre antes da primeira clivagem embrionária de tal forma que os embriões resultantes não são quiméricos. Esses embriões podem ser analisados ​​sem qualquer necessidade de raça para a próxima geração, permitindo a geração eficiente e rápida de embriões transgênicos para análises de promotor e função do gene. Adulto X. laevis resultante deste procedimento também propagar o transgene através da linha germinativa e pode ser usado para gerar linhas de animais transgénicos para fins múltiplos.

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Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Este protocolo de vídeo demonstra um método para a geração de transgênicos<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Por introdução de transgenes em núcleos do esperma seguida de transplante nuclear em ovos não fertilizados.

Produção de transgênicos Xenopus laevis Por Restrição Integração Mediada por Enzima e Transplante Nuclear

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

11.8K visualizações.  University of Manchester. Este protocolo de vídeo demonstra um método para a geração de transgênicos Xenopus laevis Por introdução de transgenes em núcleos do esperma seguida de transplante nuclear em ovos não fertilizados.

Vídeo: Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Incorporação de plástico e secção de embriões Xenopus laevis

Biologia

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Obtenção de ovos de Xenopus laevis fêmeas

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Preparação e fracionamento de Xenopus laevis Egg Extractos

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

In Vitro Assembléia Nuclear Usando Extractos Egg fracionado Xenopus

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjeção de Oócitos Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Em células vivas, Imagem e Análise Quantitativa de células embrionárias epiteliais em Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Transplantes faciais em<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Os embriões

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

Dissecção<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Crista neural para<em&gt; In vitro</em&gt; Cultura Explant ou<em&gt; In vivo</em&gt; Transplante

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Usando plusTipTracker software para medir Microtubule Dynamics em<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Cones de Crescimento

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis como um modelo para identificar Tradução Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...