Stentor coeruleus tem sido empregado há muito tempo como um organismo modelo para entender a regeneração unicelular. Embora a linha do tempo para a regeneração morfológica visual seja conhecida, a linha do tempo para a regeneração funcional permanece desconhecida. Este ensaio acompanha a motilidade da população central em regeneração sincronizada de modo que a recuperação da função de perda possa ser quantificada.
Pode ser adaptado para uso com outros tipos de células. A falta de um selo seguro da câmara de imagem resultará em poços vazando uns nos outros ou bolhas de ar se formando dentro dos poços. Para pesquisadores que não estão familiarizados com o uso de espaçadores de silicone, recomendamos fortemente que o PSW ou outro meio limpo seja estocido em cada um dos poços para testar o vazamento antes do uso.
A construção das câmaras de amostra é mais fácil de ser mostrada do que descrita verbalmente. Assim como o processo de extração de padrões de motilidade a partir dos dados de vídeo adquiridos. Para começar, corte um pedaço de 250 micrômetros de espessura da folha espaçadora de silicone ligeiramente menor tanto em altura quanto em largura do que um slide de microscópio.
Use um soco inteiro para criar poços circulares deixando espaço suficiente entre poços vizinhos para garantir uma boa vedação. Inicie a regeneração do aparelho oral incubando células de coeruleus de stentor em 10% de sacarose ou 2% uria por dois minutos. Em seguida, lave três vezes com meio fresco.
Pipeta suavemente aproximadamente 10 stentor em cada poço. Tomando o cuidado de corresponder o volume da amostra ao volume do poço o mais próximo possível. Feche os poços baixando suavemente um pedaço de vidro de cobertura sobre os poços a partir de uma borda.
Use um objeto estreito e ligeiramente flexível, como uma ponta de pipeta de 10 microliteres para pressionar o vidro da tampa onde ele entra em contato com a folha de silicone para garantir uma boa vedação. Coloque a amostra no estágio do microscópio e ajuste o microscópio para a menor ampliação disponível para que se encaixe bem no quadro. Comece o lapso de tempo e adquira um vídeo de dez segundos a 30 quadros por segundo de cada poço em cada ponto de tempo.
Para calibrar, adquira uma imagem clara de um slide de calibração ou uma régua clara nas mesmas configurações de ampliação que os vídeos. Usando qualquer programa de visualização de imagens, conte o número de pixels entre marcas de uma distância física conhecida. Baixe os dois scripts, rastreie células e limpe os traços para um local fácil de lembrar no computador e transfira os vídeos de dados para este computador também.
Organize os vídeos de dados em pastas. Um para cada ponto de tempo. Use as células de rastreamento de script para executar o rastreamento automatizado de células nos vídeos de dados, abrindo células de faixa e executando o script Escolha adicionar ao caminho"se solicitado por uma janela pop-up que normalmente só acontecerá quando o script é executado pela primeira vez a partir de uma determinada pasta.
Quando solicitado, selecione um ou mais vídeos de dados para iniciar o rastreamento. Navegue até os vídeos de dados e uma vez satisfeito com a lista de arquivos clique em aberto "Para rejeitar manualmente traços anômalos ou falsos, abra traços limpos na janela do editor MATLAB clicando duas vezes no arquivo. No prompt selecione a saída da pasta de dados por células de faixa.
Navegue até uma das pastas criadas e selecione-a. Quando solicitado, digite um para manter o traço e zero para rejeitar o traço. Em seguida, pressione entrar para passar para o próximo traço.
Comece baixando o roteiro intitulado enredos de espaguete. Abra e execute o roteiro. Quando a janela do navegador de arquivo aparecer com o prompt, selecione pasta para abrir.
Navegue até a pasta de um dos pontos de tempo. Quando solicitado, calibração, qual é o número de pixels por milímetro? Digite o valor de calibração e pressione enter.
Ajuste os eixos da trama conforme necessário alterando a linha 55 do script, que por padrão é definida como RR é igual a quatro. por incluir um raio de até quatro milímetros. Guarde o enredo.
Os resultados mostram a motilidade coletiva da população celular de stentor em duas, três, sete e oito horas no processo de regeneração do aparelho oral. Essas parcelas mostram tanto o aumento esperado no número de indivíduos motile quanto o aumento de quatro vezes na gama de células mais motile dentro da população. As células de natação mais rápidas, se iniciadas perto da borda, são proibidas de nadar inteiramente em linha reta e seu alcance de movimento parece menor.
As células do trato foram classificadas em três categorias distintas, não-motile sem espera visível, não-motile com ressarem visível e moída. O resultado mostrou um histograma empilhado resumindo contagens de células relativas nessas categorias em função da nossa em regeneração. Mais tarde, um número significativo de células foram encontradas em colônias com jejuns visíveis sugerindo fortemente que tinham explorado o ambiente e preferencialmente ligados perto de outros de sua espécie.
É importante selecionar as dimensões do poço da amostra que funcionam bem para o coeruleus stentor que têm aproximadamente um milímetro de tamanho. Isso inclui espessura espaçadora de silicone de 5/16 polegadas de diâmetro, e 10 células por poço. Esses números devem ser ajustados ao adaptar este protocolo para outros tipos de células.
Este ensaio pode ser realizado em conjunto com o RNA-I para investigar e comparar a regeneração de diferentes fenótipos de estêncil.
