Agradecemos Sophie Gournet para obter ajuda com ilustrações, Julie Chaumeil para a leitura do manuscrito, a instalação de alojamento dos animais e da plataforma de imagem da Unidade. Este trabalho recebeu apoio no âmbito do programa «Investissements d&#39;Avenir» lançado pelo Governo francês e implementado pela ANR com as referências ANR-10-LabX-0044 e PSL ANR-10-IDEX-0001-02, o EpiGeneSys FP7 não. 257082 Rede de Excelência para EH, uma ERC Avançada Investigator adjudicação, no. 250367 e da UE FP7 SYBOSS conceder nenhuma. 242129 a EH Os autores gostariam de reconhecer o Celular e Tecidual plataforma de imagem da Genética e Departamento de Biologia do Desenvolvimento (UMR3215 / U934) do Institut Curie, membro da France-BioImaging (ANR-10-InsB-04), para obter ajuda com a luz microscopia.

procedimentos com animais foram realizados de acordo com o cuidados com os animais institucional aprovado e usar comitê dos protocolos Institut Curie (CEEA-IC) (C 75-05-18). O trabalho também foi realizado sob a aprovação do Ministério do Ensino Superior e da Investigação francês para o uso de Organismos Geneticamente Modificados (número do contrato 5549CA-I). 1. Preparação de secções de criostato <ol><li> Recolha de embriões naturalmente F1 ovular murganhos C57BL / 6 x DBA ratinhos / 2J como descrito em Shea et al., 12. No dia 7 de gestação (E7), sacrificar rato 8-12 semanas de idade por deslocamento cervical. Recolha todo o concepto ou seja decídua 12. </li><li> Isolar conceptos E7, conforme descrito em Shea et al., 12. Coloque-os em um prato de 60 milímetros Petri contendo PBS. </li><li> Congelar o mouse concepto E7 para seções criostato. <ol><li> Prepare poços folha de alumínio adaptados 1cm de altura ( &#39;caseira&#39; usando um Pasteur pip de vidroet). Depositar uma gota de meio de congelação de tecido na parte inferior deste recipiente de pequenas dimensões. Depositar o conceptus na orientação correcta (isto é, para as secções longitudinais do conceptus deve mantida na sua orientação horizontal). </li><li> Encher o poço contendo o concepto com o tecido congelando médio. Suspendê-lo com uma pinça em vapor acima líquido N 2, a fim de permitir que ele congelar lentamente - em seguida, mergulhe o bloco no líquido N 2 durante alguns segundos até que fique branco. Subsequentemente, o bloco de transferir para um frasco de congelação e armazenar a -80 ° C (pode armazenar durante vários meses). </li></ol></li><li> Antes de crio-seccionamento, colocar o bloco congelado contendo o conceptus a -20 ° C no criostato para 30 min. Realizar criocortes de espessura de 8 um. Depósito 4 seções em um slide para permitir fixação eficiente. Seções lugar próximo o suficiente para caber sob uma lamela 18 x 18 mm 2. </li><li> Verifique a qualidade doseções (intactos e sem arranhões) e a orientação do embrião (cortes longitudinais) com uma lupa e escolher as seções adequadas para análise posterior. O mais rapidamente possível depositá-los em uma jarra de Coplin e executar RNA FISH (Ver 3.3.2). </li></ol> 2. Preparação de CTGs Secundário <ol><li> Isolar a Conceptus (ver 1.1 e 1.2). </li><li> Dissecar o E7 Ectoplacental Cone (EPC) <ol><li> Use um microscópio estereoscópico e placas de Petri contendo PBS estéril. Dissecar a decídua com uma pinça. Pierce da amostra e pinças abertas para rasgar os dois lados da decidua separados. </li><li> Desembolsar o embrião. Utilize pontas de uma pinça fina fechados (Dumont # 5) em uma ação do tipo tesoura para separar o EPC do embrião propriamente dito. Use cuidado especial para se obter uma amostra perfeitamente limpo, separado do tecido materno, bem como a partir do cório e do saco vitelino. Lave a explantes EPC em PBS. </li><li> Com um pouco de colher, transferir EPC dissecado indivíduo para um 4-well placa contendo uma lamela estéril em meio. </li></ol></li><li> Derivar CTGs de EPCs culturas de curto prazo. <ol><li> Preparar as placas de 4 poços contendo lamelas. Esterilizar 12 milímetros rodada lamelas de vidro de diâmetro por imersão em etanol, seguido por flame-secagem. </li><li> Adicionar 0,5 ml de meio a cada poço de EPC (EPC meio: RPMI 1640 suplementado com 15% de FCS, 0,1 mM de 2-mercaptoetanol e antibióticos). </li><li> único depósito, dissecaram-EPCs no centro da lamela no poço, juntamente com o meio de cultura. Use uma pinça fina para aplicar o EPC na lamela de vidro. Culturefor 3-5 dias a 37 ° C, 5% de CO 2. Explante indivíduo forma uma excrescência que se espalha como uma monocamada de CTGs achatada (Figura 2A). </li></ol></li></ol> 3. RNA FISH NOTA: Os protocolos são baseados naqueles descritos para células-tronco embrionárias (CES) em Chaumeil et al, 8 e Pollex e Heard 13.. <ol><li> Prepa avançadaração de soluções estoque <ol><li> Preparar um tampão de acetato de sódio 3M pH 5,2. </li><li> Preparar tampão de hibridação 2x contendo 40% (w / v) de sulfato de dextrano de sódio, 20x de BSA, 400 mM de vanadil ribonucleósido Complexo (VRC) em solução salina de 4x Citrato de sódio (SSC). </li><li> Prepare meio de montagem contendo 90% (v / v) de glicerol, 0,1% (w / v) de p-fenilenodiamina, pH 9 em PBS. </li></ol></li><li> Soluções recentemente preparadas <ol><li> Preparar a solução fixadora composta por 3% de paraformaldeído recentemente preparada (PFA) em PBS. Preparar a solução de permeabilização que contém 0,5% de Triton-X-100 em PBS suplementado com 2 mM de VRC. Preparar o tampão de lavagem através da mistura de 50% de formamida (FA) e 2x SSC e ajustar o pH a 7,2-7,4. </li><li> Preparar a solução de contra-coloração de ADN consistindo em 1? G / mL de DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole dicloridrato) em 2 x SSC. </li></ol></li><li> Fixação e permeabilização em Preparação para FISH <ol><li> Para as células em lamelas, lavar as células em 1X PBS durante 5 mno. fixar as células em lamelas, ou secções embrionárias sobre as lâminas durante 10 minutos em solução fixadora (3% PFA) à TA. </li><li> Enxaguar as células três vezes com PBS 1x. Permeabilizar as células durante 5 minutos em solução de permeabilização gelada em gelo. Lave as células três vezes com 70% de etanol. lamelas de loja em placas de 4 poços e slides na caixa do transporte 4-slide em etanol 70% a -20 ° C. NOTA: As lamelas e as lâminas podem ser armazenados durante vários meses à temperatura de -20 ° C. As placas e caixas contendo os mesmos têm de ser selados com parafilme para evitar a evaporação do etanol. </li></ol></li><li> ADN sonda identificadora <ol><li> Rotular sondas de DNA por nick translation usando nucleótidos fluorescentes. Siga as instruções do fabricante (ver Tabela 1) 8. </li><li> Para uma mistura de reacção de 50 ul, adicionar 1-2 ug de plasmídeo, cromossomas artificiais bacterianos (BAC) ou amplificação por deslocamento múltiplo (MDA) (para a amplificação de ADN, ver 3.4.4) de ADN de 17,5 ul de água, 2,5 ul de 0,2 mMSR-, SG-, Cy5-dUTP, 10 ul de 10 mM cada mistura dNTP (dGTP, dATP, dCTP), dTTP 5 ul 10 mM, 5 jul 10x nick tampão tradução e 8 ul nick enzima tradução. </li><li> Incubar durante 16 horas a 15 ° C no escuro. Inactivar a reacção por congelação a -20 ° C. sondas Store para meses a -20 ° C. </li><li> MDA NOTA: Para DNA BAC, quantidade de DNA obtido após a preparação clássica é baixa, portanto, pode-se usar uma etapa de amplificação do DNA antes da rotulagem usando MDA. Usar um kit comercial e seguir as instruções do fabricante (ver Tabela 1). </li><li> Misture DNA de BAC 0,5 ul com 9,5 ul de tampão de amostra. Aquecer 3 min a 95 ° C. extinguir imediatamente em gelo; deixar em gelo 10 min. Prepare a mistura de tampão de reacção / enzima: (9,5 mL + 0,5 mL mistura de enzima) e manter em gelo. </li><li> Misturar 10 ul de mistura de ADN + 10 ul de mistura de reacção tampão / enzima. Incubar a 30 ° C, pelo menos, 20 horas. Inativar a enzima por amostra de aquecimento 10 min a 65 &amp; #176; C. Arrefecer a amostra a 4 ° C antes de armazenamento a -20 ° C. </li><li> Verificar MDA por digestão. Adicionar 1 mL de MDA, 2 ul de tampão 10X, 2 ul de Hind III e 15 ul de H 2 O. Incubar a 37 ° C durante a noite. Executar lentamente num gel de agarose a 0,8-1% para confirmar a amplificação do DNA precisas. Os fragmentos de ADN claras de peso molecular elevado deve ser observado no gel. </li></ol></li><li> Probe Preparação <ol><li> Use 0,1 ou 1 mg sonda por lamela ou slide. NOTA: Adicionar 2-5 ug de Cot-1 DNA se a concorrência é necessária, por exemplo, a maioria das sondas como eles podem conter sequências de repetição que hibridizam outra forma transversal e aumentar o fundo. <ol><li> Para a precipitação, adicionam-se 5 ug de ADN de esperma de salmão, 1/10 do volume de 3 M acetato de sódio pH 5,2 e 3 volumes de etanol. Centrifugação a 16000 xg e 4 ° C durante 25 min. Lave pelotas com 70% de etanol e girar novamente por 5 min. </li></ol></li><li> sedimento seco durante 2 minutos num concentrador de vac / velocidade. Ressuspender em forma 100%amida em metade do volume necessário para a hibridação (por exemplo, 2,5 ul de lamela ou 7 ul de secções embrionárias na corrediça). Colocar 30 min a 37 ° C com agitação num termomisturador. Desnaturar durante 7 minutos a 75 ° C. </li><li> Quench no gelo, ou se a concorrência for necessário colocar directamente a 37 ° C durante 30-60 minutos. Misturar a solução de sonda com um volume igual de solução de hibridação 2x. </li></ol></li><li> A hibridação e as lavagens <ol><li> Desidratar; lamelas em poços, e slides em um frasco Coplin, por lavagem sequencial em 1x 80%, 1x 95% e 2x 100% de etanol durante 5 minutos cada. lamelas secas e slides completamente. </li><li> Para a hibridação, aplique a 5 ul mistura de hibridação da sonda (ver 3.5) sobre uma lâmina e abaixar a lamela, com células que enfrentam na mistura de hibridação. Para seções sobre slide, aplicar 14 ul mistura de hibridação da sonda (ver 3.5) e cobrir com uma lamela de 18 x 18 mm 2. </li><li> Colocar as lâminas em câmara úmida (papel de tecido embebido em50% de FA / 2x SSC) e incubar a 37 ° C durante a noite, no escuro. </li><li> As lavagens pós-hibridação: <ol><li> Adicionar 1 ml de 50% FA / 2x SSC para a lamela na lâmina para soltá-lo; Retirar as lamelas com cuidado a partir do slide (tomando cuidado para não raspar as células) e colocá-la do lado de células-se em uma placa de 4 poços contendo 50% FA / 2x SSC. Para seções sobre slide, remover a lamela de uma maneira similar e coloque o slide em uma jarra de Coplin contendo 50% FA / 2x SSC. </li><li> Realizar 3 lavagens, cada uma durante 7 minutos com pré-aquecida até 50% FA / SSC 2x a 42 ° C ou 44 ° C durante lamela ou corrediça, respectivamente. </li><li> Realizar 3 lavagens com pré-aquecido 2x SSC durante 5 min cada a 42 ° C ou 44 ° C durante lamela ou corrediça, respectivamente. </li></ol></li><li> núcleos por lavagem em contra-corante 2x SSC com 1 ug / ml de DAPI, durante 3 minutos, à TA. Lavar duas vezes com 2x SSC. </li></ol></li><li> Montagem de Lamelas e Slides <ol><li> Para as pequenas lamela de CTGs culta, aplicar 5 &amp; #181; meio de montagem em um slide l. Coloque célula do lado da lamela para baixo no topo da gota. </li><li> Para slides com seções, aplicar 15 ul médio no slide de montagem. Coloque um mm2 lamela de 22 x 22 em cima da gota. </li><li> Evitar bolhas. Limpe solução de montagem excesso. Selar a lamela com uma pequena quantidade de unha polonês. Se possível, a imagem desliza imediatamente ou loja para até vários meses a -20 ° C. </li></ol></li></ol> 4. Microscopia e Análise <ol><li> Adquirir imagens z eixo sequenciais em 3D em 0,3 mm utilizando um microscópio de fluorescência (objetiva 63X) e realizar a análise das pilhas de imagens em 3D usando o software ImageJ 14. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

ARN nascente FISH é um método fácil e sensível para a análise de células isoladas de actividade de transcrição em tecidos embrionários, em diferentes estádios de desenvolvimento. O poder dessa abordagem é a capacidade de identificar diferentes linhagens embrionárias em qualquer fase particular de acordo com critérios morfológicos. No entanto, este também exige que o fundo mínimo de fluorescência está presente. Qualquer fundo torna a identificação de diferentes regiões embrionárias e tipos de células de desafio. Para assegurar fundo mínima, existem dois passos críticos neste protocolo. A primeira é a qualidade do criocorte e o segundo é a eficiência (relação sinal-ruído) do ARN de peixe, que depende do nível de expressão do gene e a qualidade da sonda. Para este último, as sondas são, por conseguinte, sempre testada em células cultivadas sobre lamelas de cobertura (células estaminais embrionárias ou células somáticas) anteriores para uso em secções. Neste protocolo, nós fornecemos the técnicas necessárias para realizar a análise de FISH ARN em CTGs a partir de dois tipos diferentes de preparação da amostra (secções em criostato e culturas primárias de explantes embrionárias). Tal análise única célula permite mudanças dinâmicas na expressão do gene em diferentes estágios de pós-implantação a ser avaliadas. Os métodos que descrevemos para gerar CTGs secundário (em E7-7.5 estágios pós-implantação) foram utilizados em nosso laboratório para estudar os padrões de inativação do cromossomo X de uma linhagem extra-embrionária, que é constituído de CTGs em estágios pós-implantação. desenvolvimento extra-embrionárias em roedores depende da diferenciação de CTGs. Com efeito, CTGs são essenciais para o desenvolvimento da placenta e, assim, embrionária. Defeitos na diferenciação TGC causar letalidade embrionária (para revisão ver referência 15). A atividade transcricional de CTGs usando RNA FISH nos permitiu demonstrar um estado de inativação do cromossomo X incomum de tal tipo de células durante o desenvolvimento do mouse 3. <p claSS = &quot;jove_content&quot;&gt; Os métodos aqui apresentados, para obter e estudar CTGs secundárias pode ser aplicado para estudar vias moleculares no desenvolvimento das importantes tecidos extra-embrionárias que fazem parte de, tanto em ratos normais e mutantes. Estas abordagens podem ser adaptados para investigar o desenvolvimento TGC em outros mamíferos. Nossa análise envolveu o uso de embriões selvagens tipo de rato que nos permite avaliar a atividade transcricional de vários genes em in vivo CTGs e em in vitro CTGs derivados de explante EPC. Este método pode ser estendido para a análise de ratinhos transgénicos e / ou por adição de moléculas de inibidor no meio de cultura. Temos utilizado com sucesso este método de RNA FISH em outro tipo de CTGs, como CTGs primários que aparecem em um estágio inicial de desenvolvimento rato, blastocistos E3.0, que podem ser cultivados individualmente por 4-5 dias durante o qual desenvolvidos conseqüência, os ICM estar rodeado por grandes CTGs primários 16,17. transcritos nascentes para diferentesgenes, bem como Xist poderia ser visualizados e quantificados utilizando a abordagem FISH mesma RNA 3. Imunofluorescência combinadas e ARN peixe também pode ser realizada em secções de crióstato, bem como in vitro em cultura CTGs 3. Isto demonstra que o método é bastante robusta, como transcritos primários são altamente susceptíveis à degradação e não é um requisito absoluto de RNase compostos livres. IF / RNA FISH fornece informações adicionais sobre os níveis de transcrição, localização celular e expressão da proteína, ao mesmo tempo em uma determinada célula. Embora, as secções de tecido embebidas em parafina foram previamente utilizados para detectar o ARN nascente em tumores humanos, mantendo a morfologia do tecido 18, nas nossas mãos, as secções do crióstato são mais apropriados para preservar tanto o ARN nascente e os epítopos necessários para a detecção de anticorpos durante imunofluorescência . Em adição ao ARN de FISH, seguindo immunofluorescence, DNA cromossómico de FISH também pode ser realizada em CTGs secundárias usando sondas marcadas com fluorocromos, semelhantes aos utilizados para o ARN PEIXES 3. As sondas fluorescentes podem ser tanto plasmídeos fosmids / ou BACs, dUTPs marcados com fluorescentes como usado aqui, e descritos em Chaumeil et ai., 8. Alternativamente, os oligonucleótidos marcados com fluorescência pode ser utilizado 19. Uma vez que o ADN FISH não requer Strand-especificidade, as sondas de oligonucleótidos podem ser concebidas para atingir qualquer uma das duas cadeias complementares na região alvo. As sondas de DNA ramificado, em que a amplificação do sinal é conseguida por dois ciclos sequenciais de sondas específicas e amplificador também pode ser utilizada para melhorar a relação sinal-ruído de 20 sinais de FISH. Alternativamente, as sondas de ARN, tais como ribossondas podem ser usados, embora em nossas sondas baseadas em ADN garantir um melhor compromisso entre a qualidade do sinal, a especificidade e a facilidade de utilização. Finalmente, acquisiti imagem 3Dem é essencial, a fim de obter a informação espacial requerida nestas células grandes, e pode ser realizada utilizando uma variedade de microscópios de fluorescência, tal como o microscópio ApoTome, ou microscópios de epifluorescência, com desconvolução, tais como o DeltaVision (GEH), ou outros microscópios adequado para secções de tecido de imagem, e grandes (&gt; 20 mm) CTGs. Deve notar-se que, para os loci de ADN de cópia única, o sinal detectado ponteada por FISH ARN nascente ou FISH ADN pode não ser prontamente detectados por microscopia confocal. Em conclusão, os métodos aqui descritos devem ser úteis tanto para a análise pormenorizada de TGS num contexto de desenvolvimento, mas também em outras situações de doença. Muitos genes que estão envolvidos no desenvolvimento e na função TGC em roedores são conservadas entre roedores e seres humanos, tais como factores de transcrição, proteases e moléculas de adesão celular 21. Rato CTGs são um modelo celular para genes que estudam que regulam o desenvolvimento de uma placentad, portanto, dar insights sobre doenças da placenta humana. Além disso, devido ao facto de que estas células são endoreplicating e uma vez que algumas células cancerosas envolver programas endocycle, além de processos de amplificação de genes, os métodos que descrevem deve também ser útil nas investigações de células individuais necessários para explorar mecanismos que conduzem ao genoma instabilidade em células cancerosas .

As células trofoblásticas gigantes mamíferos (CTGs) formar uma barreira entre os tecidos maternos e embrionárias. Eles mediar implantação e invasão do conceptus no útero e desempenham um papel crítico no desenvolvimento da formação da placenta. Eles produzem vários fatores de crescimento (citocinas) e hormônios da família e esteróides prolactina / Placentário Lactogen, necessária para o crescimento embrionário e sobrevivência. CTGs são grandes, mononucleadas e células poliplóides com um ciclo celular, o endocycle, que consiste em alternar fases S e G. Na verdade, CTGs são endoreplicating células, capazes de passar por várias rodadas de síntese de DNA, sem qualquer divisão 2. A fim de investigar o estado transcricional de genes in vivo, em CTGs em comparação com outros tipos de células embrionárias e extraembryonic, nascente PEIXES ARN pode ser realizada in vivo em secções criostáticas de 3 em estágios específicos pós-implantação. CTGs são facilmente reconhecíveis em seções devido a their grande tamanho e sua atividade transcricional gene pode ser gravado, mas o seu número em estágios pós-implante precoce é baixa. Escassez de CTGs no E7 seções embrionárias, levou-nos para realizar culturas de curto prazo de tecidos trophectodermal embrionárias para obter CTGs diferenciados, a fim de estudar a regulação da expressão de genes durante o desenvolvimento trofectoderma. Além disso, a fim de permanecer como fisiológico quanto possível, as linhas celulares estabelecidas ou seja trofectoderma células (TS) da haste não são sempre adequadas para investigar os mecanismos de desenvolvimento Geração de CTGs secundárias fornecer uma ferramenta valiosa para estudar gravidezes patológicas associadas a defeitos de CTGs devido ao gene anormal regulação em camundongos. Células trofoblásticas do cone ectoplacental (EPC) são precursores de CTGs secundário 4. Diferenciação espontânea de EPCs cultivadas para CTGs secundário foi relatado anteriormente 5. No entanto, em contraste com CTGs primárias, estudos sobre a diferen TGC secundáriociação permaneceram limitadas, presumablydue às dificuldades de isolar explantes EPC livres de quaisquer tecidos maternos ou embrionárias. Nós adaptamos esses métodos, a fim de realizar RNA FISH em CTGs secundários derivados de embrião humano no E7, um estágio de pós-implantação de desenvolvimento, onde CTGs são muito poucos, mas poderia ser gerada a partir de precursores de EPC. PEIXES ARN para analisar transcritos primários nucleares nunca foi feito ao nível do nível de uma única célula em CTGs secundárias. Isto permite uma análise precisa da transcrição e foi usado para demonstrar a instabilidade epigenética de CTGs em fases pós-implante 3. Um exemplo clássico da epigenética em mamíferos, a inativação do cromossomo X (ICX) é estudada no laboratório Heard 6. Neste processo, um dos cromossomas X 2 na fêmea é inactivado. O não-codificante XIST transcrição reveste o cromossoma X, a partir do qual ele é expresso em células do sexo feminino e provoca o silenciamento da maioria dos genes. Utilizando ARN FISH,transcritos nascentes de genes ligados ao X pode ser investigado como pode a acumulação de Xist ARN no cromossoma X inactivo (XI). Descrevemos aqui um procedimento para executar RNA FISH em seções de embriões pós-implantação e em culturas de curto prazo da EPC. Este protocolo adaptado a partir dos que foram utilizados para estudar ICX em diferenciação de células estaminais embrionárias fêmeas e embriões pré-implantação 7-11. Nós fornecemos exemplos de ICX em embriões femininos in vivo, assim como in vitro CTGs.

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ 1500</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi SV6</td><td></td></tr><tr><td>Scissors Pascheff-Wolff</td><td>Moria</td><td>MC19</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Roth</td><td>PK78.1</td><td></td></tr><tr><td>4-well tissue culture dishes&amp;nbsp;</td><td>Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petri dishes Falcon</td><td>Dutsher, France</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petri dishes Falcon</td><td>Dutsher, France</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 18 mm x 18 mm&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>631-1331</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 22 mm x 22 mm</td><td>VWR</td><td>631-0125</td><td></td></tr><tr><td>12 mm glass round coverslips&amp;nbsp;</td><td>Harvard apparatus</td><td>64-0712</td><td></td></tr><tr><td>Slides Superfrost plus</td><td>VWR</td><td>631-9483</td><td></td></tr><tr><td>4-slide Transport&amp;nbsp; box&amp;nbsp; Lockmailer</td><td>Dutsher, France</td><td>40684</td><td></td></tr><tr><td>Cryotubes 1.8 ml Corning&amp;nbsp;</td><td>Fisher Science</td><td>10418571</td><td></td></tr><tr><td>Glass Coplin staining jars</td><td>Fischer Scientific</td><td>W1561L</td><td></td></tr><tr><td>TissueTek O.C.T compound</td><td>VWR</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Invitrogen</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td>10x&amp;nbsp; is used</td></tr><tr><td>Water&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Panreac Quimica, Spain</td><td>141451</td><td>3% in PBS</td></tr><tr><td>Triton-X-100&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>&amp;nbsp;2000-A</td><td>0.5% final</td></tr><tr><td>Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs, USA</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dextran sulfate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin&amp;nbsp; (BSA)</td><td>New England Biolabs, USA</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47671-1L-F</td><td>&amp;nbsp;aliquots kept at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Illustra TempliPhi&amp;nbsp; Kit Construct (Kit MDA)</td><td>Dutsher, France</td><td>25-6400-80</td><td></td></tr><tr><td>Nick translation kit</td><td>Abbott, USA</td><td>07J00-001</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC buffer concentrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;S6639</td><td></td></tr><tr><td>Spectrum green dUTP&amp;nbsp;</td><td>Abbott, USA</td><td>02N32-050</td><td></td></tr><tr><td>Spectrum red dUTP&amp;nbsp;</td><td>Abbott, USA</td><td>02N34-050</td><td></td></tr><tr><td>Cy-5 dUTP&amp;nbsp;</td><td>Dutsher, France</td><td>PA55022</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Cot-1 DNA&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18440016</td><td></td></tr><tr><td>DNA, MB grade</td><td>Invitrogen</td><td>Roche</td><td>DNA from fish sperm</td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>p-phenylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695106</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5417R</td><td>Eppendorf, Germany</td><td></td><td>molecular biology grade</td></tr><tr><td>Eppendorf concentrator plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer comfort</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquiport Liquid pump</td><td>KNF Neuberger, Trenton, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shake&#039;N&#039;Bake Hybridization oven</td><td>Boekel Scientific, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryostat&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>CM3050</td><td></td></tr></tbody></table>

transcriptional analysis by nascent rna fish of in vivo trophoblast giant cells or in vitro short-term cultures of ectoplacental cone explants

A placenta deriva de uma linhagem extra-embrionária, o trofectoderma. No blastocisto murino-implantação peri, células trofectoderma murais diferenciar em células trofoblásticas gigantes primário (CTGs) enquanto o trofectoderma polar que recobre a massa celular interna continua a proliferar depois diferenciar em CTGs secundárias. CTGs desempenhar um papel fundamental no desenvolvimento da placenta e são essenciais para uma gravidez bem sucedida. Investigação de regulação da transcrição de genes específicos durante o desenvolvimento pós-implantação pode dar insights sobre o desenvolvimento CTGs. As células do cone ectoplacental (CPE) a partir de embriões em 7-7,5 dias de gestação (E7-7.5), derivado do trofectoderma polar, diferenciam-se em CTGs secundária 1. CTGs pode ser estudada in situ, em secções de criostato de embriões em E7, embora o número de CTGs é muito baixa nesta fase. Um meio alternativo de analisar CTGs secundário é a utilização de culturas de curto prazo de EPCs individuais a partir E7 embriãos. Propomos uma técnica para investigar o estado transcricional de genes de interesse in vivo e in vitro, ao nível de uma única célula utilizando hibridização in situ fluorescente (FISH ARN) para visualizar transcritos nascentes. Esta técnica fornece uma leitura direta da expressão gênica e permite avaliar o estado cromossômica de CTGs, que são células endoreplicating grandes. Com efeito, uma característica fundamental da diferenciação terminal de CTGs é que eles saem do ciclo celular e submetidos a vários ciclos de abordagem endoreplication.This pode ser aplicado para detectar a expressão de qualquer gene expresso a partir de autossomas e / ou cromossomas sexuais e pode fornecer informações importantes no desenvolvimento mecanismos, bem como doenças da placenta.

CTGs podem ser identificados em secções de E7 por coloração DAPI, devido à sua localização no conceptus e o seu tamanho grande. Isto é ilustrado na Figura 1A em um corte longitudinal. ARN de FISH foi realizada em tais secções embrionárias, a fim de estudar a inactivação do cromossoma X nesta linhagem extra-embrionárias. Várias lâminas ou lamelas podem ser processadas ao mesmo tempo. Ao utilizar diferentes corantes para rotular o ARN de diferentes genes, pode-se detectar transcritos primários diferentes no mesmo núcleo. Pelo menos 2 sondas podem ser misturados em conjunto, por exemplo, acoplado a Xist SG (sinal verde) e acoplado a ATRX SR (sinal vermelho). Um exemplo de uma TGC fêmea é mostrado na Figura 1B, onde 2 outras linhagens são representados, o embrião propriamente dito (E) e endoderma visceral (VE). Um núcleo TGC é mostrada Xist com ARN cobrindo o Chrom Xosome que é inativado (Xi), enquanto o outro cromossomo X que está ativa (Xa) exibe alguns pontinhos. Genes ATRX transcritos primários ligados ao X são expressos a partir do cromossoma X activo (não decorado por Xist) em várias cópias, devido a endoreplication. Isto ilustra monoalélicos expressão por exemplo, inactivação de ATRX em um cromossomo X. Desde CTGs são heterogéneos no tamanho, como ilustrado na Figura 2B, só as mais importantes são registados. Três sondas podem também ser utilizadas, tal como ilustrado na Figura 2C para CTGs secundárias. Neste caso, Xist -SG (verde), dois genes ligados ao X: G6PD -SR (vermelho) e Huwe1-Cy (magenta) foram analisadas ao mesmo tempo no mesmo núcleo. Enquanto G6PD é monoallelically expressa como mostrado aqui (e previamente mostrado na CTGs secundárias 3) Huwe1 é biallelically expressa demonstrando a sua property escapar XCI. Endoreplication, com vários pontinhos seja, transcrições de nascentes cópias, também é evidente. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54386/54386fig1.jpg" /> Figura 1. expressão transcrito primário em CTGs de E7 seção embrionária do sexo feminino. (A) Corte longitudinal do concepto E7 coradas com DAPI. O embrião e tecidos extra-embrionárias são cercados pelo tecido mãe, a decídua. A localização dos diferentes linhagens é feito mediante a coloração DAPI com objectiva 5X. CTGs são identificados devido ao seu grande tamanho. Ch, chorion, E, embrião, EPC, cone ectoplacental, VE, endoderme visceral, TGC, as células trofoblásticas gigantes. Barra de escala = 100 pm. (B) Maior ampliação da área de box-in em A (objetiva 63X) RNA FISH. ATRX transcrito primário em RNA vermelho e Xist em verde são visualizados no 3 linhagens = E, VE, TGC. Scale barra = 10 mm. Exemplo de um in vivo TGC onde ATRX é monoallelically expressa (Xa, ponta de seta) e em silêncio sobre o Xist -Revestido cromossomo X (Xi); vários sinais ATRX visto na Xa são devido a endoreplication. clone ATRX = ONT RP23-260I15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54386/54386fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54386/54386fig2.jpg" /> Figura 2. expressão transcrito primário em CTGs secundários derivados de EPC. (A) Vista geral de crescer CTGs secundário (objectivo x5). Barra de escala = 100 pm. (B) Asterisk indicam exemplo de CTGs de acordo com seu tamanho (objetiva de 10X). Barra de escala = 60 mm. (C) Exemplo de uma fêmea secondary TGC RNA FISH com o uso de 3 sondas (doma Xistem em verde, cobrindo o cromossomo X inativado: Xi) mostrando endoreplication da G6PD e Huwe1 transcritos primários (vários pontinhos, em vermelho e magenta). Enquanto G6PD é expressa monoallelically, expressão Huwe1 é bialélico neste núcleo Huwe1 = clone BAC RP24-157H12;. G6PD = BAC clone RP23-13D21. Xi = seta; Xa = seta (objetiva 63X). Barra de escala = 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54386/54386fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones.

Análise transcricional por RNA Nascente PEIXES de<em&gt; In Vivo</em&gt; Células trofoblásticas gigantes ou<em&gt; In Vitro</em&gt; Culturas de curto prazo de Ectoplacental Cone explantes

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells ...

transcriptional-analysis-nascent-rna-fish-vivo-trophoblast-giant

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

7.8K visualizações.  Institut Curie, PSL Research University, CNRS UMR 3215, INSERM U934. Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones. 

Vídeo: Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend diseases related to pregnancy. In this protocol, human primary villous cytotrophoblasts freshly isolated from placentas through a standard DNase/trypsin protocol are microporated with small interfering RNA (siRNA). This approach provided greater efficiency for siRNA transfection when compared to a lipofection-based method. Transfected cells can subsequently be analyzed by standard Western blot within a time frame of 3-4 days post-transfection. In addition, using cultured primary villous cytotrophoblasts, Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) analysis was optimized and performed on extracts from days 1 to 4. The use of these cultured primary cells and the protocol described allow for an evaluation of the implication of specific genes and transcription factors in the process of villous cytotrophoblast differentiation into a syncytiotrophoblast-like cell layer. However, the limited time span allowable in culture precludes the use of methods requiring more time, such as generation of a stable cell population. Therefore testing of this cell population requires highly optimized gene transfer protocols.

This protocol describes a method for efficiently transfecting siRNA in freshly isolated human villous cytotrophoblasts using microporation and identifying DNA-protein complexes in these cells. Transfected cells can be monitored by Western blot and EMSA analyses during the 4-day culture time.

As análises siRNA transfecção e EMSA sobre recentemente isolados das vilosidades citotrofoblastos Humanos

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Genética

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density centrifugation, media gradient isolation and immunomagnetic purification. As observed in vivo, mononucleated villous cytotrophoblast cells in primary culture differentiate into multinucleated syncytiotrophoblast cells after 72 hr. Compared to normoxia (8% O2), villous cytotrophoblast cells that undergo hypoxia/reoxygenation (0.5% / 8% O2) undergo increased oxidative stress and intrinsic apoptosis, similar to that observed in vivo in pregnancy complications such as preeclampsia, preterm birth, and intrauterine growth restriction. In this context, primary villous trophoblasts cultured under hypoxia/reoxygenation conditions represent a unique experimental system to better understand the mechanisms and signalling pathways that are altered in human placenta and facilitate the search for effective drugs that protect against certain pregnancy disorders. Human villous trophoblasts produce melatonin and express its synthesizing enzymes and receptors. Melatonin has been suggested as a treatment for preeclampsia and intrauterine growth restriction because of its protective antioxidant effects. In the primary villous cytotrophoblast cell model described in this paper, melatonin has no effect on trophoblast cells in normoxic state but restores the redox balance of syncytiotrophoblast cells disrupted by hypoxia/reoxygenation. Thus, human villous trophoblast cells in primary culture are an excellent approach to study the mechanisms behind the protective effects of melatonin on placental function during hypoxia/reoxygenation.

This manuscript presents a unique in vitro model of immunopurified human villous cytotrophoblast cells cultured under hypoxia/reoxygenation. This model is suitable to study the protective effects of promising treatments, such as melatonin, on pregnancy complications associated with increased oxidative stress and altered placental function.

Trophoblast primário humano Cultura celular modelo para estudar os efeitos protetores da melatonina contra a hipóxia / Disruption induzida pela reoxigenação

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Biologia do Desenvolvimento

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining the ability to self-renew and to differentiate into all subtypes of the trophoblast lineage, equivalent to the in vivo stem cell population giving rise to the fetal portion of the placenta. Therefore, TSCs offer a unique model to study placental development and embryonic versus extra-embryonic cell fate decision in vitro. From the blastocyst stage onwards, a distinct epigenetic barrier consisting of DNA methylation and histone modifications tightly separates both lineages. Here, we describe a protocol to fully overcome this lineage barrier by transient over-expression of trophoblast key regulators Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2 in murine embryonic fibroblasts. The induced trophoblast stem cells are able to self-renew and are almost identical to blastocyst derived trophoblast stem cells in terms of morphology, marker gene expression and methylation pattern. Functional in vitro and in vivo assays confirm that these cells are able to differentiate along the trophoblast lineage generating polyploid trophoblast giant cells and chimerizing the placenta when injected into blastocysts. The induction of trophoblast stem cells from somatic tissue opens new avenues to study genetic and epigenetic characteristics of this extra-embryonic lineage and offers the possibility to generate trophoblast stem cell lines without destroying the respective embryo.

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

Protocolo para a conversão directa de murino embrionárias fibroblastos em células-tronco trofoblásticas

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Na diferenciação in vitro de pluripotentes humanas Células-tronco em células Trofoblásticas

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation

The placenta is an essential organ that regulates and maintains mammalian development in utero. The placenta is responsible for the transfer of nutrients and waste between the mother and fetus and the production and delivery of growth factors and hormones. Placental genetic manipulations in mice are critical for understanding the placenta's specific role in prenatal development. Placental-specific Cre-expressing transgenic mice have varying effectiveness, and other methods for placental gene manipulation can be useful alternatives. This paper describes a technique to directly alter placental gene expression using CRISPR gene manipulation, which can be used to modify the expression of targeted genes. Using a relatively advanced surgical approach, pregnant dams undergo a laparotomy on embryonic day 12.5 (E12.5), and a CRISPR plasmid is delivered by a glass micropipette into the individual placentas. The plasmid is immediately electroporated after each injection. After dam recovery, the placentas and embryos can continue development until assessment at a later time point. The evaluation of the placenta and offspring after the use of this technique can determine the role of time-specific placental function in development. This type of manipulation will allow for a better understanding of how placental genetics and function impact fetal growth and development in multiple disease contexts.

Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation

Here we describe a time-specific method to effectively manipulate critical developmental pathways in the mouse placenta in vivo. This is performed through the injection and electroporation of CRISPR plasmids into the placentas of pregnant dams on embryonic day 12.5.

Mouse In Vivo Placental Alvo CRISPR Manipulação

The placenta is an essential organ that regulates and maintains mammalian development in utero. The placenta is responsible for the transfer of nutrients ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

Análise celular única de alelos ativos transcricionralmente por peixe de molécula única

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Bioquímica

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

Derivação de células-tronco do rato trofoblasto de blastocistos

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Biologia

Analyzing Angiogenesis: In Vitro Assay for Tube Formation on BM Matrix

Trophoblast Cell Recovery from Angiogenesis-Tube Formation Assay for Differentiation Marker Expression Analysis

During placenta development, extravillous trophoblast (EVT) cells invade the maternal decidua to remodel the uterine spiral arteries by a process of mesenchymal to endothelial-like transition. Traditionally, this process is evaluated by an in vitro tube-formation assay, where the cells organize themselves into tube-like structures when seeded over a polymerized basement membrane preparation. Although several structural features can be measured in photomicrographs of the structures, to assess the real commitment of EVT to the endothelial-type phenotype, biochemical analysis of cell extracts is required. Scraping the cells from the culture dish to obtain RNA and/or protein extracts is not an alternative since the tube-like structures are severely contaminated by the bulk of proteins from the polymerized basement membrane. Thus, a strategy to separate the cells from the basement membrane proteins prior to the preparation of cell extracts is needed. Here, a simple, fast, and cost-effective method to recover the tube-like structures from the in vitro tube-formation assay and the subsequent analysis by biochemical techniques is presented. Tube-like structures formed by HTR8/SVneo cells, an EVT cell line, were liberated from the polymerized basement membrane by a short incubation with PBS supplemented with ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). After serial washes, a ready-to-use pellet of purified tube-like structures can be obtained. This pellet can be subsequently processed to obtain RNA and protein extracts. qPCR analysis evidenced the induced expression of VE-cadherin and alphav-integrin, two endothelial cell markers, in EVT-derived tube-like structures compared to control cells, which was consistent with the induction of the endothelial cell marker, CD31, evaluated by immunofluorescence. Western blot analysis of the tube-like structures' protein extracts revealed the overexpression of RECK in transfected HTR8/SVneo cells. Thus, this simple method allows to obtain cell extracts from the in vitro tube-formation assay for the subsequent analysis of RNAs and protein expression.

The present protocol allows the recovery of tube-like structures formed in the classical in vitro angiogenesis-tube formation assay where cells, such as trophoblast cells, organize in capillary-like structures over a layer of extracellular basement membrane matrix. The recovered structures are used for RNA and protein isolation for various biochemical analyses.

During placenta development, extravillous trophoblast (EVT) cells invade the maternal decidua to remodel the uterine spiral arteries by a process of ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

Isolamento de células primário do mouse trofoblasto e Ensaio invasão do trofoblasto

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Análise de uma única célula de transcrição do gene pela RNA Fluorescente<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridização (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Análise transcricional por RNA Nascente PEIXES de

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