Este protocolo é significativo, pois permite a manipulação direcionada tempo-específica de placentas de camundongos usando CRISPR. Isso permitirá que os pesquisadores elucidem funções gênicas específicas durante a metade e o final da gravidez. Manipulações genéticas que causam superexpressão dentro da placenta de camundongos são muito incomuns.
A principal vantagem desta técnica é que permite uma série de alterações na expressão gênica dentro da placenta. Não desanime se os termos preliminares tiverem essa técnica malsucedida. Como essa técnica é desafiadora, requer bastante tempo para praticar para dominar.
Para começar, coloque a barragem anestesiada em decúbito dorsal com um cone nasal para manter a anestesia na área de preparação. Raspe bem o abdômen da represa. Para evitar o ressecamento da córnea, coloque gel de lágrima artificial sobre os dois olhos da represa.
Em seguida, utilizar aplicadores estéreis com ponta de algodão para desinfetar o sítio cirúrgico com pelo menos três rodadas alternadas de solução de iodopovidona, seguidas de etanol a 70% com uma camada final de solução de iodopovidona. Após o preparo, mova a barragem com o cone nasal de anestesia para a área de cirurgia designada. Para a laparotomia uterina, coloque a barragem em decúbito dorsal na mesa cirúrgica e fixe o cone nasal no lugar com fita adesiva.
Coloque uma almofada de aquecimento por baixo de uma almofada absorvente ajustada a 45 graus Celsius. Depois de confirmar a profundidade da anestesia através da ausência de refluxo da pinça do dedo, use pinça e tesoura para fazer uma incisão de aproximadamente dois centímetros na linha média através da pele da tenda. Em seguida, faça uma incisão vertical através do peritônio usando pinças estéreis, suavemente afastadas dos cornos uterinos.
Massageie ambos os chifres uterinos pressionando em ambos os lados do abdômen com os dedos para guiá-los. Coloque o útero exposto em cima de campos cirúrgicos estéreis colocados sobre o abdome inferior e mantenha-o úmido com gotas de soro fisiológico estéril quente, conforme necessário. Uma vez que o útero está exposto, selecione três pares de placentas para manipulação.
Registrar a localização das manipulações placentárias e a organização dos embriões dentro dos cornos uterinos. Para a injeção placentária do plasmídeo controle, carregar uma quantidade suficiente do plasmídeo de controle apropriado para três injeções usando uma micropipeta calibrada. Realizar todas as injeções entre a decídua e a zona juncional a uma profundidade de aproximadamente 0,5 milímetros lateralmente na placenta.
Após a injeção, mas imediatamente antes da eletroporação, cubra os locais de contato com soro fisiológico estéril, aplicando o soro fisiológico precisamente nos três locais da parede uterina e nas pás com um conta-gotas ou seringa. Dentro de dois minutos após a injeção, realizar a eletroporação usando um par de pás de três milímetros acopladas a uma máquina de eletroporação. Para garantir a eficiência da incorporação de CRISPR e a viabilidade dos embriões, ajuste as configurações para 30 volts, pulso de 30 milissegundos, dois pulsos, pulso de 970 milissegundos desligado e unipolar.
Pressione suavemente as pás de eletroporação sobre as paredes uterinas nas laterais da placenta. Coloque a pá do ânodo sobre o local de injeção e o cátodo diretamente oposto. Pressione o pulso na máquina de eletroporação e aguarde que os dois pulsos se completem antes de remover as pás de eletroporação.
Em seguida, proceder à injeção placentária do plasmídeo experimental, conforme demonstrado anteriormente. Realizar a eletroporação das três placentas experimentais injetadas dentro de dois minutos após a injeção, conforme realizado para o grupo controle. Uma vez que a manipulação placentária esteja completa, massageie suavemente os cornos uterinos de volta para dentro da cavidade abdominal usando apenas os dedos para manipular diretamente os cornos uterinos.
Realizar suturas interrompidas na camada de peritônio utilizando pontos solúveis revestidos e trançados com 45 centímetros de comprimento com uma liga de agulha circular de 13 milímetros e três oitavos. Após a sutura da camada peritoneal, suturar a pele com suturas solúveis utilizando o mesmo tipo de suturas solúveis utilizadas para o peritônio. Uma vez que a sutura esteja completa, aplique adesivo tecidual nas suturas na pele.
Quando o adesivo de tecido tiver secado, desligue o vaporizador e transfira a barragem da área de cirurgia para uma gaiola de suporte em suas costas. As placentas foram injetadas com um plasmídeo de controle geral CRISPR Cas9 e um plasmídeo de ativação CRISPR ou um plasmídeo de ativação IGF-1 SAM. As imagens representativas pós-necropsia não mostraram danos perceptíveis ou alteração na aparência fenotípica em nenhum grupo de tratamento.
A taxa de sobrevivência dos embriões não tratados nas ninhadas manipuladas diminuiu para uma média de 79,05%, enquanto houve uma diminuição significativa na sobrevivência dos embriões manipulados com uma média de 55,56%Não houve diferença significativa no peso placentário de nenhum grupo. Não houve diferença significativa no ganho de peso materno imediatamente após a cirurgia em comparação com as cirurgias simuladas. Muitas mulheres grávidas apresentaram uma ligeira diminuição ou nenhuma mudança de peso no dia seguinte ao procedimento, provavelmente devido à interrupção da alimentação durante e brevemente após a cirurgia.
A maioria das mães apresentou aumento de peso no E14.5, mas ocasionalmente ainda foi observada uma diminuição no peso. A qPCR mostrou um aumento significativo na expressão de IGF-1 nas placentas de superexpressão de IGF-1 em relação às placentas controle. A avaliação ELIZA das placentas E14.5 mostrou um aumento significativo nos níveis da proteína IGF-1 nas placentas de superexpressão de IGF-1 em relação às placentas controle.
A autofluorescência verde demonstrou as sub-regiões da interface materno-fetal placentária com marcação Cas9 vermelha apenas na placenta de superexpressão de IGF-1, indicando incorporação bem-sucedida de CRISPR em todas as três sub-regiões da placenta. A marcação fluorescente na hibridização C2 confirmou a incorporação do plasmídeo de ativação do IGF-1 sem migração para placentas não tratadas. A zona decidual e labiríntica pôde ser identificada ao redor da zona juncional vermelha marcada pela coloração de Prl8a8.
Lembre-se de registrar o tipo de manipulação e a localização das placentas e embriões correspondentes. O registro da localização do colo do útero e dos embriões dentro dos cornos uterinos é altamente recomendado. Após esse procedimento, podem ser realizadas análises da placenta, embrião e mãe.
Isso permitirá uma maior compreensão dos papéis específicos da placenta dos genes na gravidez, função placentária e desenvolvimento embrionário.
