Os autores reconhecem o apoio financeiro de uma subvenção ZonMW-VICI 918.11.635 (Holanda). Os autores gostariam de agradecer à loja de ferramentas da Vrije Universiteit Amsterdam para as suas sugestões práticas e para a fabricação dos componentes de instalação e Jarno Voortman de Carl Zeiss Holanda para os conselhos úteis sobre microscopia. Marjolein Blaauboer foi um grande apoio ao comentar criticamente sobre vários rascunhos do manuscrito.

Todos os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as experiências Holanda sobre Animals Act. NOTA: O filtro método do papel sanduíche submersa é modificado a partir de 1. 1. Filtro Submerso Preparação Sandwich Papel <ol><li> Pannett-Compton (PC) -saline 27,28 <ol><li> Preparar soluções de reserva A (1 L de ultrapura H2O, 121 g de NaCl, 15,5 g de KCl, 10,42 g de CaCl2-H2O, e 12,7 g de MgCl 2 .6H 2 O) e B (1 L de ultrapura H2O, 2,365 g de na 2 HPO 4 2H 2 O ·, e 0,188 g de NaH 2 PO 4 2H 2 O ·) em frascos limpos 1-L. Armazená-los a 4 ° C. </li><li> Prepare 1 litro de solução salina PC-misturando 900 mL de H2O ultra pura com 40 ml de solução de estoque A e 60 ml da solução de B (nesta ordem para evitar a precipitação). Prepara-PC salina FR recentementeom soluções de A e B a cada semana. NOTA: As soluções de reserva pode ser armazenado a 4 ° C durante vários meses. Autoclavagem e / ou a adição de antibióticos ou antimicóticos não são necessárias. </li></ol></li><li> A incubação de ovos de galinha fertilizados <ol><li> Em uma incubadora umidificada, colocar os ovos em seu lado e incubar-los a 37,5 ° C até que atinjam a idade desejada. Nota: Armazenar ovos não superior a duas semanas (de preferência a 12 - 15 ° C) antes da experiência, como a taxa de eclosão irá diminuir significativamente </li></ol></li><li> Transportadores de papel de filtro (adaptado a partir de 1) <ol><li> Se possível, use uma máquina de corte a laser para cortar portadores de papel de filtro em forma de ampulheta do papel filtração de espessura (28 mm x 22 mm). Taper a largura no meio de 22 mm a 10,4 mm. Cortar uma abertura elíptica central (10,6 milímetros x 5,5 mm), com o eixo maior da elipse orientada paralelamente ao lado maior do transportador de papel de filtro (Figura 1-H). <ol><li> Opcionalmente, preparar uma matriz de cartão com as dimensões correctas e transferir o seu contorno e que da abertura central para o papel de filtragem de espessura usando um lápis. Recorte o portador do papel de filtro, utilizando uma tesoura fina. </li></ol></li><li> Corte duas operadoras de papel de filtro idênticos para cada embrião a ser explantado. Prepare portadores de papel de filtro extras como backup no caso de um embrião se perde durante o explante. </li></ol></li><li> A temperatura controlada banho de óleo (no dia da experiência) <ol><li> Colocar a proveta com controlo de temperatura no centro do XY-platina motorizada do microscópio de zoom vertical e ligar o copo para o seu controlador de temperatura. </li><li> Coloque quatro anéis grandes de aço inoxidável (diâmetro exterior 30 mm, 4 mm de altura, 1,5 milímetros de espessura de parede) em uma placa de Petri de 6 centímetros de agir como pesos e colocar o prato no meio do recipiente de temperatura controlada. NOTA: Esta placa de Petri serve apenas como um espaço reservado para ajustar o leve de óleoeu. </li><li> Encher o balão com controlo de temperatura com 130 ml de óleo mineral leve. Ajustar o nível de óleo, se necessário, de modo a que ele termina cerca de 3 mm abaixo da borda superior da placa de Petri de 6 centímetros. </li><li> Remova a placa de Petri de 6 cm a proveta com temperatura controlada e ajustar a temperatura a 40 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Filtro Submerso Sandwich Produção de Papel <ol><li> O meio de cultura (no dia da experiência) <ol><li> Pour 30 ml de PC-solução salina (tal como preparado nos passos 1.1.1 a 1.1.2) para um tubo de centrífuga de 50 ml. Preparar um tubo de centrífuga de 50 ml cheio com 30 ml de solução salina-PC para cada dois embriões a ser explantado. </li><li> Cuidadosamente quebrar um ovo não incubados em um 10 centímetros placa de Petri. </li><li> Colher albúmen finas movendo uma pipeta de transferência de plástico ao longo das paredes da placa de Petri e chupando no albúmen finas. Recolha de 30 ml de albumina de finos num tubo de centrífuga de 50 ml para cada dois embriões a ser explantado. Certifique-se de obter apenas o thin albúmen. NOTA: Normalmente 3 - 4 ovos permitir a colheita de cerca de 30 ml de albumina finas. </li><li> Introduzir 20 ml de albumina de finos em todos os PC-salina preenchido 50 ml tubo de centrifugação (como foi preparado no passo 2.1.1). </li><li> Misture a solução salina PC-albumina com os finos, invertendo suavemente os tubos várias vezes. Deixe repousar por alguns minutos e verifique se a mistura, chamada meio de cultura a partir daqui em diante, é claro. Se o meio de cultura não é claro, preparar, de fresco PC-salina a partir da solução estoque e colher albúmen finas frescas. </li></ol></li><li> Coloque dois anéis pequenos de aço inoxidável (diâmetro externo 20 mm, 4 mm de altura, espessura da parede 1,5 mm, 6,5 gap mm no anel) tão distantes quanto possível em um 6 centímetros de plástico placa de Petri fresco e preenchê-lo com 22 ml de cultura forma (tal como preparado nos passos 1.4.1 a 1.4.4) usando uma pipeta de plástico de 25 ml (Figura 1-H). Certifique-se de que os detritos acumulados na parte superior do meio se mantém no tubo de centrifugação. </li><li> Remover todos os detritos oR bolhas a partir do meio utilizando uma pipeta de transferência de plástico. </li><li> Encha com 10 cm numa caixa de Petri com 75 ml de solução salina-PC (para ser utilizado no passo 2.15). </li><li> Remover um ovo a partir do incubador e deixá-lo assentar no banco de lado durante 1 minuto para permitir que o embrião vir para o topo da gema. </li><li> Cuidadosamente quebrar o ovo em uma placa de Petri (Figura 1-A). Embeber a ponta de um pedaço de papel de tecido fino na clara de espessura e o centro da blastoderme, puxando, se necessário. </li><li> Remover a maior parte do endosperma finas e grossas da placa de Petri com uma pipeta de transferência de plástico (com a ponta cortada para facilitar a aceitação do endosperma de espessura). </li><li> Criar uma janela no albúmen de espessura em torno do embrião suavemente enxugando a clara grossas com um pedaço de papel de seda, afastando-se do centro (Figura 1-B). Impedir que o papel de tecido de se fixar a membrana vitelina. </li><li> Com uma pinça, coloque cuidadosamente uma transportadora papel de filtro na vitelline membrana em torno do embrião, com o eixo maior da abertura elíptica paralelo ao eixo ântero-posterior do embrião (Figura 1-C). </li><li> Beliscar uma ponta da tesoura de unhas através da membrana vitelina perto do portador do papel de filtro e rapidamente cortar em torno de todo o suporte de papel de filtro (Figura 1-D). </li><li> Usando pinças, levantar o portador do papel de filtro para longe da gema numa direcção paralela oblíquo ao eixo ântero-posterior do embrião (figura 1-E). </li><li> Ligue o transportador de papel de filtro em torno de ter o lado ventral do embrião em cima e pode ser mergulhado na solução de soro fisiológico PC. Mergulha-se o suporte de papel de filtro ao longo do eixo ântero-posterior do embrião numa direcção oblíqua. </li><li> Se livrar de toda a gema ainda ligado a membrana vitelina eo blastoderm por liberando-o suavemente com o PC-salina a partir de uma pipeta de transferência de plástico. Manter a totalidade do suporte de papel de filtro submerso numall vezes (Figura 1-F). </li><li> Remover o transportador de papel de filtro a partir do PC-solução salina ao longo do eixo ântero-posterior do embrião numa direcção oblíqua e livrar-se do excesso de líquido, esfregando a borda do suporte em papel de filtro um papel de seda. </li><li> Segurar o papel de filtro na horizontal, com o lado ventral do embrião virado para cima e colocar outra transportadora de papel de filtro na parte superior do primeiro, usando um segundo par de pinças. Suas aberturas devem corresponder exatamente, imprensando assim o embrião entre as duas camadas de papel de filtro (Figura 1-G). </li><li> Imediatamente submergir o transportador sanduíche de papel de filtro para o meio de cultura numa direcção oblíqua ao longo do eixo ântero-posterior do embrião. Colocá-lo na área que atravessa o espaço entre os dois anéis de aço (Figura 1-H). </li><li> Fixar a sanduíche de papel de filtro, colocando mais dois anéis de aço por cima dos outros dois, certificando-se que a abertura com o embryo permanece completamente descoberta (Figura 1-I). </li><li> Verifique o nível médio e ter certeza de que o espaçador superior é apenas submersa no meio. Se necessário, adicionar ou remover pequenas quantidades de meio. </li><li> Cuidadosamente colocar a placa de Petri no centro do banho de óleo com temperatura controlada e estabilizar o prato lateralmente colocando três grandes anéis de aço inoxidável (diâmetro de 30 milímetros exterior, de 4 mm de altura, 1,5 milímetros de espessura de parede) ao lado do prato no óleo . Certifique-se de que os anéis de aço toquem os lados do prato (Figura 1-J). </li><li> Lentamente pipetar cerca de 6 ml de óleo mineral leve na parte superior do meio com uma pipeta de transferência de plástico, de modo que o meio é coberto com uma camada contínua de óleo mineral (Figura 1-K). </li><li> Configurar a aquisição de lapso de tempo. NOTA: A imagem latente os embriões como panoramas horizontais de cinco sub-imagens sobrepostas (telhas) permite imagens detalhadas (objetiva 5x), com um overvi geralEW da morfologia 29-30. Intervalos de imagem entre 3 e 10 min permitir o acompanhamento detalhado das alterações morfológicas 31, ea aquisição de pequenas Z-stacks (cinco a sete aviões diferentes, com uma distância de 30 mm) compensa a maior parte do espessamento e de viragem do embrião 30 . Z-aviões com o maior contraste pode ser selecionado antes do processamento adicional 32 de quadros individuais em filmes de lapso de tempo (veja a seção de resultados representativos para obter informações detalhadas sobre a aquisição da imagem). </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54636/54636fig1.jpg" /> Figura 1: Configuração do Sandwich papel de filtro submerso. (A) Um ovo é rachado em uma placa de Petri. (B) A maioria dos albúmen grossos e finos é removida da placa de Petri com uma pipeta de transferência de plástico (não mostrado). Em seguida, uma janela de espessura no albúmen é criado umrodada do embrião suavemente enxugando a clara grossas com um lenço de papel. Portadora de papel (C) Um filtro é colocado em torno da blastoderme em cima da gema. (D) O transportador de papel de filtro é cortada solta a partir da membrana vitelina circundante e (E) removida da parte superior da gema. (F) A gema restante é cuidadosamente lavados em um banho de PC-salina. (G) O embrião é colada com um segundo suporte de papel de filtro idênticas. (H) O papel sanduíche de filtro está submerso no médio e posicionado sobre anéis de aço inoxidável dois de metal (embrião enfrentando dorsal ou lateral ventral para cima). (I) dois anéis de estabilizar a sanduíche a partir do topo. (J) a placa de Petri contendo o embrião é transferido para o banho de óleo de temperatura controlada. anéis de aço inoxidável estabilizar a placa de Petri lateralmente. (K) O meio de cultura é coberto com uma camada de óleo mineral.(G) esquemática da sanduíche de filtro submerso. (M) As dimensões dos suportes de papel de filtro utilizados para a sanduíche de papel de filtro submerso. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54636/54636fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Os autores não têm nada para revelar.

Como uma nova variante da cultura CE bem estabelecida uma, a sanduíche de papel de filtro submerso facilita a aquisição de campo claro e de campo escuro de lapso de tempo de filmes de longo prazo do início do embrião de pinto ex ovo fazendo uma temperatura e humidade controladas incubadora em torno o microscópio dispensável. Em vez de ser cultivados num semi-sólido de fundo de agar-albumina, os embriões são mantidos totalmente submerso em um meio de cultura simples que consiste em PC-albumina de soro fisiológico e finas. A evaporação e a perda de calor é minimizado por uma camada de óleo mineral que flutua no topo do meio de cultura. Os embriões podem ser cultivadas facilmente, ou dorsal ou ventral lateral-se, sem diferenças visíveis na qualidade. Como mostrado aqui, os embriões no papel sanduíche filtro submerso são acessíveis a intervenções de microcirurgia, como a aplicação de contas embebido com morfogénio. As aplicações futuras incluem fluorescência ao vivo de imagem, microinjeções e eletroporação e silenciamento gênico para manipulate e estudar uma ampla gama de eventos morfogenéticos durante ventral desenvolvimento (por exemplo, coração cedo e somitogenesis) e dorsal (por exemplo, a gastrulação tarde, fechamento do tubo neural, e inicial do cérebro). Um tratamento de droga dependente do tempo é possível, se a placa de Petri contendo a sanduíche de papel de filtro é substituída por uma câmara de perfusão, permitindo a troca de meio de cultura por baixo da camada de óleo mineral. O papel sanduíche filtro submerso vai desenvolver o seu potencial de imagem completa em combinação com imagens baseadas em laser (incluindo microscopia de luz folhas) e os objetivos de imersão. Algumas dificuldades com a preparação do papel sanduíche filtro submerso serão abordados nos parágrafos seguintes. Embora ele requer apenas uma quantidade moderada de formação a transferência dos embriões a partir da gema para o papel de filtro sanduíche, vários passos ainda pode influenciar de forma significativa a qualidade do embrião em cultura. Antes que o portador do papel de filtro écolocada sobre a gema, a membrana vitelina do embrião em torno deve ser libertado de qualquer albumina de espessura. Só então é que a conexão entre o filtro de papel com a membrana vitelina ser forte o suficiente para resistir a lavagem em PC-salina. O papel de filtro transportando o embrião deve atravessar a interface líquido / ar tão pouco quanto possível para minimizar a tensão sobre as membranas. Uma vez trazido para o PC-solução salina para a lavagem, todo o papel de filtro transportador deve ficar completamente submerso em todos os momentos. O tempo no banho de PC-solução salina deve ser limitada a cerca de 30 - 60 s, como a membrana vitelina irá começar a liberar a partir do papel de filtro. Ainda assim, a limpeza do embrião deve ser executado muito bem, como restos de gema, mais tarde, obscurecem a visão do embrião. Durante a lavagem, nunca aponte o fluxo a partir da pipeta directamente para o embrião, mas sempre radialmente para fora a partir dele. Depois de retirar o embrião a partir do PC-salina, certifique-se de segurar o papel de filtro na horizontal para minimizartensão sobre as membranas embrionárias. Em seguida, estabilizar o embrião com o segundo suporte de papel de filtro. Uma vez que o segundo suporte de papel de filtro é colocada, evitar a criação de qualquer tensão lateral, o que poderia deslocar os transportadores de papel de filtro em relação ao outro e rasgar as membranas embrionárias. Quando a sanduíche de papel de filtro é trazido para o meio de cultura, também deve atravessar a interface ar / líquido apenas uma vez para minimizar a tensão sobre as membranas. O segundo par de anéis de aço inoxidável usados ​​para estabilizar a sanduíche de papel de filtro a partir do topo devem ser colocados muito lentamente e sem qualquer pressão para minimizar a compressão das membranas embrionárias. As pequenas rupturas do opaca do embrião área geralmente curar durante a primeira hora de cultura, mas um embrião danificado pode e deve ser sempre substituída por uma nova amostra antes da camada de óleo é pipetada no topo do meio de cultura. Para a imagem de um embrião inteiro ou várias amostras para filmes de lapso de tempo de alta resolução, o microfoneroscope deve ser equipado com uma platina motorizada-XY, controlado pelo software de microscópio. É de importância crucial para que o movimento xy-palco com uma velocidade mínima para evitar danos aos embriões e turbulências no meio de cultura e o óleo, o que irá diminuir a qualidade da imagem. Para a aquisição dos filmes de lapso de tempo aqui apresentados, o xy-platina motorizada mudou-se com uma velocidade de aproximadamente 1,75 mm / seg. No futuro, a imagem poderia ser melhorada por primeiro mover o palco para a posição desejada e adquirir a imagem depois de um curto período de repouso para permitir que as vibrações e turbulências desaparecer. Como uma limitação, usuários em potencial deve estar ciente da distância relativamente longa de trabalho (cerca de 1 cm) necessária para este método de cultura se um microscópio vertical, sem objetivos de imersão é usado. Esta distância de trabalho resulta da camada de meio e de óleo mineral no topo do embrião. No 6 centímetros placa de Petri, a camada de óleo tem um thickness de cerca de 1 - 1,5 mm e o embrião está submersa cerca de 4 mm de profundidade no meio de cultura. Dependendo do diâmetro do objectivo, o bordo superior da placa de Petri de 6 centímetros também pode limitar o acesso ao embrião. Isto pode ser contornado pela utilização de uma antena maior. A distância de trabalho a partir do topo pode ser ligeiramente reduzido, minimizando as espessuras das camadas de líquido. Além disso, a distância de trabalho a partir de baixo poderia ser minimizado, trazendo o embrião ainda mais para baixo para o fundo da placa de Petri e reduzindo a espessura da janela de vidro da proveta aquecida. Enquanto que o protocolo foi optimizado para trabalhar com um tempo de trabalho de zoom distância microscópio vertical, que pode ser montado num microscópio invertido bem. Os futuros usuários devem ter em mente que submergindo o embrião muito profundamente no meio de cultura pode levar a O 2 -diffusion problemas, embora experimentos preliminares sugerem que a difusão limitada não parece ser um provLEM, contanto que o embrião encontra-se rodeado por um grande suficientemente-reservatório de meio de cultura e o papel de filtro ensanduichada não é pressionado para a parte inferior da placa de Petri. Outra limitação é o controlo da temperatura. Ao ajustar a temperatura do controlador para a proveta aquecida a 40 ° C, a temperatura no meio equilibra a 37,5 ° C em torno dos embriões quando o meio é coberta com óleo mineral. Isto mostra que alguma energia é perdida entre a parte inferior do recipiente, em que os elementos de aquecimento e o sensor de temperatura situam-se, e a localização dos embriões. O controle de temperatura pode ser otimizado pelo reposicionamento do sensor e redistribuindo os elementos de aquecimento.

Embriogênese tem fascinado o homem desde o início da história. Como a estrutura e morfologia de um embrião se desenvolver de forma temporal e espacial tão bem definido? O embrião de galinha tornou-se um dos modelos animais vertebrados clássicos para embriogênese por várias razões: É facilmente disponível, barata, transparente em seus estágios iniciais, e acessível para manipulações experimentais, como ele se desenvolve fora da mãe. Além disso, tem uma geometria quase plano durante eventos morfogenéticos início, como coração e formação do cérebro, gastrulação, neurulação e somitogenesis 15. processos morfogenéticos pode ser entendido melhor se eles são estudados de forma dinâmica, como através da aquisição de imagens de lapso de tempo. O embrião de galinha pode ser visualizado no ovo 16, mas com fraca acessibilidade para manipulações experimentais e visibilidade limitada para imagens de microscopia de luz de transmissão. Portanto, cortaral técnicas têm sido propostas para cultura de embriões de pintainho ex ovo, quer em sistemas de cultura de gema de inteiros 13,17 - 19 ou como culturas de explantes de 1,20 - 23. Em sistemas de cultura de gema de inteiros, o embrião permanece em cima da gema intacta, e todo o conteúdo do ovo é transferida para um outro recipiente de incubação. Este recipiente pode ser um shell substituto de ovo 17, uma placa de Petri 19, ou uma rede feita de plástico filme plástico 13,18. Embriões em culturas de gema inteiras podem idealmente ser cultivadas até à eclosão e são acessíveis a micromanipulations. Estas técnicas são especialmente úteis para o estudo do desenvolvimento de embriões após o início da circulação sanguínea (o que aumenta o contraste), enquanto que os embriões mais jovens permanecem difíceis de visualizar. Estes embriões podem ser visualizados melhor se eles são excisados da gema e cultivadas como explantes in vitro. Os explantes são facilmente acessíveis para experimentaçãoal manipulações e necessitam de menos espaço para a cultura. Por muitos anos, uma técnica pioneira por Denis Nova em 1955 e suas variações foram os padrões de ouro de métodos de cultura de explantes de embriões de galinha, tornando assim o embrião acessível para microscopia de lapso de tempo e as intervenções de microcirurgia 20,21. Apesar de seu grande sucesso, a técnica de Novo é relativamente exigente e demorado. O blastoderme frequentemente separa quando a membrana vitelina, transportando o blastoderme, é esticada em torno de um anel de vidro para atingir a tensão correcta 1. Além disso, o embrião só podem ser cultivadas, com o lado ventral para cima. A cultura CE (galinha precoce), uma técnica mais recente desenvolvido por Chapman e Collignon 1, evita o estiramento da membrana vitelina, utilizando um transportador de papel de filtro com uma abertura central. O papel de filtro atribui à membrana vitelina, mantendo assim a sua tensão natural, e envolve o embrião como uma moldura 1.Os embriões são então cultivadas em um fundo agar-albumina, geralmente com o seu lado ventral para cima. Cultura dorsal lateral-se parece só é possível para os embriões em HH8 15 e mais velhos. Muitos grupos adaptaram o transportador de papel de filtro para as suas necessidades, tais como através da substituição de parte inferior de agar-albumina com um suporte feito a partir de fibras de sutura cirúrgica 24 ou uma membrana de colagénio revestida 25. Muitas vezes, os embriões cultivados com a técnica de Novo ou com a cultura CE estão expostos, com o seu dorsal ou superfície ventral para o ar para facilitar a difusão de oxigênio 1,20. Estas culturas de explantes têm de ser mantidas numa atmosfera humidificada a fim de evitar a evaporação do meio e para evitar que o embrião de secar. Isto é alcançado através da incubação do prato de cultura com o explante em uma maior prato de Petri contendo papel de tecido humedecido 1. A aquisição de imagens de lapso de tempo de estes embriões requer o uso de uma incubadora de temperatura controlada em torno de todo o microscópio ou uma têmperaAture controlado recipiente com tampa aquecida para evitar a condensação no caminho da luz 14. No entanto, embriões de galinha podem também desenvolver ex ovo completamente submerso em meio de cultura como culturas de papel de filtro 25, ensanduichada entre uma camada de óleo mineral pesado e albumina em adaptações da técnica de Nova 2,21, ou como explantes blastoderme dobradas no &quot;pastoso Cultura Cornish &quot;23,26, sem contato direto com o ar. O sanduíche de papel de filtro submerso é uma nova variante da técnica de filtro de portador do papel. Ao combinar o conhecimento anterior sobre a cultura de embriões de galinha ex ovo, faz a incubadora de temperatura controlada e a tampa aquecida dispensável. O embrião é colocado entre duas operadoras de papel de filtro idênticos (laser-cut) 24 e cultivados totalmente submerso em um meio simples de cultura (Pannett-Compton solução salina 27,28 e albúmen finas na proporção de 3: 2) em uma temperatura controlada contêmer. Uma camada de óleo mineral leve que flutua no topo do meio evita a evaporação 2,21 e minimiza a perda de calor para o ambiente. O fundo do recipiente tem uma janela de vidro, e toda a configuração é executado em um tempo de trabalho de zoom distância microscópio vertical. Esta configuração permite a aquisição de alta resolução de campo claro e campo escuro filmes de lapso de tempo de cerca de 30 horas de desenvolvimento embrionário, que vão desde a fase de linha primitiva início ao estágio de 28 somite (equivalente a Hamburger Hamilton etapas 5 a 16, HH5-16 ) 15. Os embriões podem ser cultivadas igualmente bem com a sua ventral ou dorsal para cima. Portanto, os embriões são acessíveis à observação e manipulação de ventral (por exemplo, cardíaca precoce 7,8 e somitogenesis 6) e dorsal (por exemplo, tarde gastrulação 2, fechamento do tubo neural 3-5, e do cérebro no início 9-13) desenvolvimento. O filtro submerso papel sanduíche pferece um ambiente simples e estável para microcirurgia, implantação talão, microinjecção, silenciamento de genes, e os estudos de eletroporação. O seu potencial de imagem pode ser empurrado para muito mais longe, utilizando uma imagem baseada em laser (incluindo microscopia de luz folhas) e os objetivos de imersão.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Milli-Q&#160;Reference Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Z00QSV0WW&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duran&#160;laboratory bottles, with caps, 1L</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Duran</td>
			<td>Z305200-10EA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1064041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 H2O</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1023821000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H2O</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>13152-1KG-D&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4.2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1065801000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1063420250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman&#160;qualitative filter paper, Grade 595</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10311611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser cutting machine MLS-90120-C130, CO2-laser, 130W, wavelength 10.6 &#181;m</td>
			<td>Micro Lasersystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tork Extra Soft Facial Tissues</td>
			<td>Tork</td>
			<td>140280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex gloves</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z645613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EMDAMED</td>
			<td>EMDA 300.131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z350613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>VWR</td>
			<td>WITG5.480.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>accu-jet pro Pipette Controller</td>
			<td>BrandTech Scientific</td>
			<td>26332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological plastic pipettes, 25mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic document sleeves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator - Incubator mod. Cip Cip 40</td>
			<td>Fiem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized chicken eggs (Gallus gallus)</td>
			<td>Drost BV (Loosdrecht, NL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm Petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Centrifuge tubes , Greiner centrifuge tubes&#160; or Cellstar tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel rings, custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large rings, 30 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small rings, 20 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness, 6.5 mm gap in the ring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont #5, Inox</td>
			<td>Fine Science Tools , F.S.T.</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine, really sharp scissors for cutting filter paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3516&#160;Sigma-Aldrich Mineral Oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS Number&#160;8042-47-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar bottoms for EC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539&#160;SIGMA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653&#160;SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbead implantation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead Sampler Kit III (45 &#181;m beads were used)</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>16905-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accupuncture needles: type J, No.02, 0.12x30mm</td>
			<td>SEIRIN</td>
			<td>&#160;type J, No.02, 0.12x30mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTD Temperature Sensor with M4 Threaded Housing RTD-850M</td>
			<td>Omega</td>
			<td>RTD-850M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hermetically Sealed RTD Sensors HSRTD-3-100-A-3M</td>
			<td>Omega</td>
			<td>HSRTD-3-100-A-1M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermistor and RTD Extension Wire EXTT-3CU-26S-50</td>
			<td>Omega</td>
			<td>EXTT-3CU-26S-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Pin Mini Connectors for Thermocouples, 3-Wire RTD&#39;s and Thermistors MTP-U-M</td>
			<td>Omega</td>
			<td>MTP-U-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters KHLV-103/(10)-P</td>
			<td>Omega</td>
			<td>KHLV-103/(10)-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature/Process Controller CNi16D24-C4EIT-DC</td>
			<td>Omega</td>
			<td>CNi16D24-C4EIT-DC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-made aluminium beaker, isolated with polyacetal (drawings see sheet 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>495010-0009-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective PlanNeoFluar Z 1.0x/0.25 FWD 56mm</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435281-9100-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Rotary Control MARC</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435604-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transillumination top 450 mot</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435500-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized measuring stage S 150x100 mot; CAN (D)</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435465-9020-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insert plate S, glass 237x157x3mm (D)</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435465-9053-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller EMS 3</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435610-9010-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>System Control Panel SYCOP 3</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435611-9010-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy High-End Workstation Xeon Quad-Core mulitlingual</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>490004-0025-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Language Package Windows 7 x64 Ultimate English US</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410373-0200-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD TFT Monitor HP ZR2440w 24&#34;</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410350-2403-000</td>
			<td>not available anymore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN pro 2012 Hardware License key</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410135-1002-120</td>
			<td>not available anymore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Software Driver Hamamatsu Cameras Hardware License Key</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410136-1045-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN module Z Stack</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410136-0030-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Module Tiles/ Positions</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410136-1025-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Module Time Lapse</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410136-1031-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Module Experiment Designer</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410136-1022-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Desk 2012 Hardware License Key</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410135-1004-120</td>
			<td>not available anymore</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a submerged filter paper sandwich for long-term ex ovo time-lapse imaging of early chick embryos

Devido à sua disponibilidade, baixo custo, geometria plana, e transparência, o ex ovo embrião de galinha tornou-se um modelo animal vertebrado importante para o estudo de eventos morfogenéticos, como gastrulação 2, neurulação 3-5, somitogenesis 6, dobra do cardíaco 7, 8, e do cérebro formação 9-13, durante a embriogênese precoce. Chave para entender processos morfogenéticos é segui-los de forma dinâmica por imagem time-lapse. A aquisição de filmes de lapso de tempo de pinto embriogênese ex ovo tem sido limitada, quer para janelas de tempo curtos ou para a necessidade de uma incubadora para controlar a temperatura e umidade em torno do embrião 14. Aqui, apresentamos uma nova técnica para pinto cultura embriões ex ovo de alta resolução de imagem de lapso de tempo usando microscopia de luz transmitida. A sanduíche de papel de filtro submerso é uma variante do transportador Techn papel de filtro bem estabelecidaique (CE-cultura) 1 e permite a cultura de embriões de galinha, sem a necessidade de uma câmara climática. O embrião está ensanduichado entre dois transportadores de papel de filtro idênticas e é mantido totalmente submerso em um meio simples, com temperatura controlada, coberto por uma camada de óleo mineral leve. A partir do estágio primitivo raia (Hamburger-Hamilton estágio 5, HH5) 15 até pelo menos a fase de 28-somite (HH16) 15, os embriões podem ser cultivadas tanto com sua ventral ou dorsal para cima. Isto permite a aquisição de filmes lapso de tempo que cobrem cerca de 30 horas de desenvolvimento embrionário. quadros e filmes representativos de lapso de tempo são mostrados. Os embriões são comparados morfologicamente a um embrião cultivadas na CE-cultura padrão. O sanduíche de papel de filtro submerso fornece um ambiente estável para estudar dorsal cedo e processos morfogenéticos ventral. Ele também permite que para imagens de fluorescência ao vivo e micromanipulations, como microcirurgia, imp talãolantation, microinjecção, o silenciamento de genes, e electroporação, e tem um grande potencial para ser combinado com objectivos de imersão para imagiologia à base de laser (incluindo microscopia de luz-folha).

<img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54636/54636fig2.jpg" /> Figura 2: Comparação morfológica entre os embriões em cultura CE 1 e na Cultura Sandwich papel de filtro submerso. quadros de lapso de tempo seleccionados mostram os embriões em intervalos de 3 horas. Os quadros são redimensionadas para dar uma visão geral da morfologia do embrião completo. Os embriões foram idade-pareado para a fase 7 somite (HH9) 15. 0 hr indica o início de cada experiência. Anterior, é sempre para a esquerda. As imagens foram adquiridas com uma iluminação de campo escuro. (A) de embriões em cultura CE 1, culta lado ventral em cima de ágar-albumina inferiores a 1,33. As imagens de alta qualidade pode ser adquirida, como o embrião está confinado na direcção z. (B e C) Dois embriões cultivados no sanduíche papel de filtro submerso: (B) lado ventral para cima e (C) dorsal para cima.Embriões no sanduíche de papel de filtro desenvolver sem diferenças qualitativas para, pelo menos, 27 horas. Eles desenvolvem a circulação sanguínea funcional e flexão craniano e cervical e girar com sucesso. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54636/54636fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> aquisição de lapso de tempo depende do sistema de microscópio disponível. Neste estudo, uma distância de trabalho longa, foi usada na posição vertical zoom microscópio. O fator de zoom foi ajustado para 5X. Em combinação com a ampliação de 16X da ocular, isto resultou em 80X ampliação total, com uma resolução teórica de 1,3 pM / pixel (tal como indicado no software microscópio) 30. Para aumentar o campo de visão, os embriões foram fotografadas como panoramas horizontais de cinco sub-imagens (telhas). Portanto, uma região da telha, consistindo de cinco telhas sobrepostas, foi definido 29. Esta região telhafoi posicionado de modo a cobrir totalmente a abertura elíptica da transportadora de papel de filtro na sua extensão horizontal (Figura 2B - 0 h). Cada azulejo tinha um tamanho de 2048 x 2048 pixels, que cobre um campo de visão-de, aproximadamente, 2,7 milímetros, e telhas foram adquiridas com uma sobreposição de 10%, resultando no total campo de visão de cerca de 12 milímetros x 2,7 mm para o panorama. O XY-platina motorizada movido em relação ao objectivo, com uma velocidade de aproximadamente 1,75 mm / s, entre a aquisição das peças separadas 29. A imagem ao vivo foi focada na mesoderme presomitic anterior e os sómitos mais recentemente formadas (o foco do nosso grupo de pesquisa). Para compensar a espessamento e curling dos embriões em direção z, pequenas z-stacks (cinco a sete planos diferentes, com uma distância de 30 mm) foram adquiridas em cada ponto 30 do tempo. Estas foram seleccionadas em torno do plano focal da ponta anterior da mesoderme presomitic. A duração do ACQ time-lapseuisition foi definido para 50 horas, e os intervalos de imagens de 3, 4, ou 10 min foram escolhidos 31. A qualidade da aquisição de lapso de tempo poderia ser melhorado, reorientando a cada 5-10 horas e redefinindo o z-stack em torno do novo plano focal ideal. No final do experimento, o conjunto de séries temporais foi editada manualmente, e subconjuntos de imagens contendo o plano z com o melhor foco foram criados e salvos em uma pasta separada 32. Estes subconjuntos de imagens eram em tempo costurado para criar uma série temporal de imagens com o foco ideal. As telhas de cada imagem desta série temporal completa foram costurados e fundidos sem correção de sombreamento 30, e quadros de lapso de tempo foram exportadas como JPEG-imagens de tamanho e 95% a 100% de compressão 32. Os quadros de lapso de tempo foram importados como uma sequência de imagens em software de edição de vídeo profissional. Os detalhados 100% zooms foram estabilizados e o contraste geral foi ajustado para o nosso gosto. O prazo-lapsos finais foram codificard com o codec H.264 e exportados em MPEG-4 recipientes. Os filmes são exibidos em uma taxa de quadros de 15 frames / seg (fps) e uma resolução de 1.920 x 1.080 pixels. A Figura 2 mostra uma comparação entre um embrião em cultura CE 1 (Figura 2A) e dois embriões em cultura a sanduíche de papel de filtro submerso, a ser cultivada uma lado ventral para cima (Figura 2b) e o lado dorsal uma outra para cima (Figura 2C). Todos os embriões foram para a sete fase somito (HH9) 15 e fotografada com uma resolução temporal de 4 minutos (Figura 2A e B) ou 10 minutos (Figura 2C) pareados por idade. quadros selecionados de intervalos de 3 horas são retratados. A cultura CE (Figura 2A) permitiu imagiologia muito estável devido ao embrião que descansa sobre uma estável ágar-albumina inferiores a 1,33. Todo o embrião manteve-se em um plano focal durante todo tele toda time-lapse. Isso poderia ser benéfico para experimentos mais curtos (várias horas) e embriões muito jovens, mas ele vem com um forte confinamento do embrião na z-direção, possivelmente impedindo o seu desenvolvimento tridimensional bem sucedido no longo prazo. No início, o confinamento resultou apenas num ligeiro achatamento lateral da cabeça do embrião em comparação com um embrião em cultura na sanduíche de papel de filtro submerso com o lado ventral para cima (comparar a Figura 2A e 2B, a 0 horas). Mais tarde, o giro da cabeça foi prejudicada (Figura 2A - 21 h) eo batimento cardíaco mais lento. A circulação do sangue quase parou. Veja Suplementar Filme 1 para o lapso de tempo completo do embrião em cultura CE. O painel superior neste filme mostra uma visão geral completa do embrião, enquanto o painel no canto inferior esquerdo visualiza o desenvolvimento coração, em plena resolução. A segmentação da mesoderme presomitic em somites pode ser seen em detalhe no canto inferior direito. Embriões em sanduíche o papel de filtro submerso, por outro lado, foram na sua expansão tridimensional limitada apenas pela tensão natural das membranas que os rodeavam. Eles podem ser cultivadas quer com sua ventral (Figura 2B) ou o lado dorsal para cima (Figura 2C). De qualquer forma, os embriões mostrou somitogenesis contínua, e suas cabeças viradas. Eles desenvolveram flexão craniano e cervical ea circulação sanguínea funcional. Ambos os embriões no sanduíche de papel de filtro foram fotografadas com o foco na mesoderme segmentação, de modo que partes da cabeça moveu-se gradualmente fora de foco como os embriões cresceu, engrossou, e começou a girar, enquanto a parte segmentação da mesoderme permaneceu no foco (comparar com a figura 2B e 2C a 21 horas para 27 horas). Suplementar Movie 2 mostra o filme de lapso de tempo completo do embrião representadona Figura 2B. O intervalo de imagem foi de 4 minutos. O painel superior deste filme mostra uma visão geral completa do embrião. O desenvolvimento do embrião foi fotografada consecutivamente mais de 46 horas, mas depois de aproximadamente 30 horas, o foco na mesoderme segmentação se perdeu devido ao espessamento geral e de viragem do tecido embrionário. O painel inferior esquerdo mostra o desenvolvimento inicial do coração, em plena resolução a partir dos quadros de lapso de tempo adquiridos. Através da fusão de o primórdio cardíaca emparelhado em ambos os lados da linha média, uma estrutura tubular quase linear é formado, que mais tarde começa a bater e inclinando-se para a direita. O painel inferior direito mostra a maioria dos somitos recém-formados e a ponta anterior da mesoderme presomitic em plena resolução e acompanha a formação de novos somitos ao longo do tempo. Suplementar Filme 3 mostra outro embrião em cultura e fotografada do lado ventral para cima no sanduíche papel de filtro submerso. O intervalo de imagem foi de 4 minutos. O filme de cobre the desenvolvimento do embrião a partir da fase HH5-6 a aproximadamente encenar HH14 15, mais ou menos 27 horas de tempo de cultura. A cabeça dobrar formas e progride posteriormente. As formas de coração de seu primórdio bilateral, começa a bater, e se inclina para a direita. Os primeiros três a quatro somites formar simultaneamente. somites adicionais brotam sequencialmente a partir da ponta anterior da mesoderme presomitic. O painel inferior mostra a região da cabeça do embrião em resolução plena, permitindo a observação da dobra cabeça e formação do coração no início de elevado detalhe. Devido à transparência do embrião, o encerramento do tubo neural pode ser observada na região da cabeça futuro. Suplementar Filme 4 exibe formação somite no mesmo embrião em resolução total sobre o tempo de imagem completa no painel inferior. Suplementar Filme 5 mostra o lapso de tempo completo do embrião dorsal cultivados lado para cima (Figura 2C). O intervalo de imagem foi de 10 min. Enquanto o upper painel mostra o desenvolvimento do embrião a partir do sete estágios somite (HH9) para aproximadamente estágio HH16-17, o painel inferior é cortada para exibir as alterações morfológicas no cérebro início nessa fase em resolução máxima. O inchaço local do tubo neural pode ser observado, levando à regionalização da parte frontal do cérebro, mesencéfalo e rombencéfalo, que irá dividir-se em cinco sub-regiões do cérebro embrionário em fases posteriores 13. Além disso, o crescimento das vesículas ópticas podem ser vistos claramente. Após cerca de 30 horas em cultura, o embrião está morrendo. Para mostrar a compatibilidade do papel de filtro submerso sanduíche com manipulações microcirúrgicas, várias microesferas de poliestireno (~ 40 um de diâmetro) foram implantados no ou na vizinhança da mesoderme presomitic de um embrião de galinha em cultura o papel sanduíche de filtro submerso. As microesferas foram lavadas em PBS para remover o tampão de armazenamento e IMPLANTed antes de cobrir o meio de cultura com a camada de óleo mineral leve (comparar para o passo 2.18 do protocolo secção). Uma pipeta de Pasteur de vidro foi utilizado para transferir os grânulos para a superfície do embrião, sob observação através das oculares do microscópio. Cinco buracos foram criados na endoderme raspando suavemente com uma agulha de acupuntura. Uma ferramenta em forma de J feitos por medida, criado por alongamento e flexão uma pipeta de Pasteur de vidro, numa chama, foi utilizado para manipular os grânulos e empurrá-los cuidadosamente nos orifícios até que eles tornaram-se imóveis. Três buracos foram preenchidos com um cordão de cada (Figura 3A - 0 hr e 3B *) e dois furos com duas contas cada (Figura 3A - 0 h). 3A figura mostra, em quadros de lapso de tempo seleccionados, o desenvolvimento do embrião de galinha após a implantação microcirúrgico dos grânulos. Três grânulos foram incorporados com sucesso para dentro do tecido no local desejado, e o seu movimento foi trabalhada através dacurso do experimento em detalhe elevado (Figura 3B). O desenvolvimento do embrião não parecem ser prejudicada pela manipulação ou a presença dos grânulos. Veja Suplementar Filme 6 para o filme de lapso de tempo integral. O intervalo de imagem foi de 4 minutos. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54636/54636fig3.jpg" /> Figura 3: Geração de Time-lapse após Microbead Implantação. Prova de princípio experimento mostrando a compatibilidade do papel sanduíche filtro submerso com a implantação microbead. A cabeça do embrião é para a esquerda, mas não foi fotografada durante esta experiência. As imagens foram adquiridas com uma iluminação de campo escuro. (A) seleccionado de lapso de tempo armações mostrando o embrião manipulado em intervalos de 3 horas após a implantação de sete micropérolas (~ 40 um de diâmetro). O embrião alongado e formada continuamente somit adicionales. Três contas parecem ter sido devidamente conectado e se mudou medial com o fluxo de tecido ao longo de 18 h de cultura. Os outros quatro esferas bateu fora de seus buracos entre 6 e 9 horas da cultura e derivou posteriormente. (B) Vista detalhada das três esferas individuais (B1 a B3) implantado no mesoderme presomitic no início do experimento (0 h, B *) e após 12 horas de incubação (B **). O número de somitos recém-formando é indicada (S9 na B * e S18 em B **). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54636/54636fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="filme 1" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie1.jpg" /> Suplementar Filme 1: EC-cultura Ventral Side Up. Embrião em cultura CE 1, culta lado ventral para cima, desde a fase de sete somite (HH9) 15 em diante em um botto agar-albuminam 1,33. O intervalo de imagem foi de 4 minutos. O tempo relativo é apresentado no canto superior esquerdo. imagens de alta qualidade podem ser adquiridos, como o embrião foi confinado na direção z. Após 21 h, o batimento cardíaco e fluxo de sangue quase foram presos e o embrião tinha começado a se desintegrar. O painel superior mostra uma visão geral redimensionada do embrião, enquanto que os painéis inferiores visualizar desenvolvimento do coração (painel da esquerda) e segmentação da mesoderme presomitic (painel da direita) em resolução completa (100% de zoom). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_1_EC_culture-Ventral_up.mp4" target="_blank">(Clique direito a download).</a> <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie2.jpg" /> Filme Suplementar 2: Filtro Submerso Sandwich Papel Ventral Side Up. Embrião cultivadas no sanduíche de papel submersa do palco sete somite (HH9) 15 em diante, sid ventrale voltado para cima. O intervalo de imagem foi de 4 minutos. O tempo relativo é exibido no canto superior esquerdo em horas e minutos, reiniciando após 24 horas. O painel superior mostra uma visão geral redimensionada do desenvolvimento do embrião mais de 46 horas, consecutivamente. O painel inferior esquerdo visualiza coração desenvolvimento precoce durante a primeira 10 horas de aquisição de imagem em resolução máxima (100% zoom). O painel inferior direito retrata segmentar mesoderme ao longo de aproximadamente 30 horas de desenvolvimento na resolução total (100% zoom) até que o foco é perdido devido ao espessamento geral e torneamento de tecido embrionário. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_2_Sandwich-Ventral_up.mp4" target="_blank">(Clique direito a download).</a> <img alt="filme 3" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie3.jpg" /> Filme Suplementar 3: Cabeça Formação Fold. Embrião cultivado lado ventral para cima no sanduíche papel de filtro submerso do que elead-process / estágio cabeça-fold (HH5-6) 15 a aproximadamente o estágio de 22 somite (HH14) 15 ao longo de aproximadamente 27 horas de tempo de cultura. O intervalo de imagem foi de 4 minutos. O tempo relativo é exibido no canto superior esquerdo no he min, reiniciando após 24 horas. O painel superior mostra uma visão geral redimensionada do desenvolvimento do embrião. O painel inferior mostra a região da cabeça do embrião em resolução máxima (100% zoom). A formação da dobra a cabeça eo coração cedo eo fechamento do tubo neural pode ser observado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_3_Sandwich-Ventral_up-Head.mp4" target="_blank">(Clique direito a download).</a> <img alt="filme 4" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie4.jpg" /> Filme Suplementar 4: somitogénese. Embrião cultivado lado ventral para cima no sanduíche papel de filtro submerso desde a fase de processo cabeça / head-fold (HH5-6) 15para aproximadamente o estágio de 22 somite (HH14) 15 ao longo de aproximadamente 27 horas de tempo de cultura. O intervalo de imagem foi de 4 minutos. O tempo relativo é exibido no canto superior esquerdo no he min, reiniciando após 24 horas. O painel superior mostra uma visão geral redimensionada do desenvolvimento do embrião. O painel inferior mostra a mesoderme paraxial segmentar em resolução máxima (100% zoom). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_4_Sandwich-Ventral_up-Somitogenesis.mp4" target="_blank">(Clique direito a download).</a> <img alt="filme 5" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie5.jpg" /> Filme Suplementar 5: Filtro Submerso Sandwich Papel Dorsal Side Up. Dorsal cultivados lado Embryo-se no sanduíche papel de filtro submerso do sete estágios somite (HH9) 15 a aproximadamente o estágio HH16-17 15. O intervalo de imagem foi de 10 min. O tempo relativo é exibidono canto superior esquerdo em horas e minutos, reiniciando após 24 horas. O painel superior mostra uma visão geral redimensionada do desenvolvimento do embrião. O painel inferior mostra as alterações morfológicas no cérebro cedo na resolução total (100% zoom). O embrião morreram depois de aproximadamente 30 horas em cultura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_5_Sandwich-Dorsal_up-Head.mp4" target="_blank">(Clique direito a download).</a> <img alt="filme 6" src="/files/ftp_upload/54636/54636movie6.jpg" /> Filme Suplementar 6: Microbeads implantado. Embrião cultivado lado ventral para cima no sanduíche papel de filtro submerso por cerca de 19 horas, a partir da fase somite nove (HH9-10) 15. O intervalo de imagem foi de 4 minutos. O tempo relativo é exibido no canto superior esquerdo no he min. O painel superior mostra uma visão geral redimensionada da região da cauda com sete micropérolas implantadas no prmesoderme esomitic. O painel inferior mostra a região com micropérolas implantadas em resolução máxima (100% zoom). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54636/Movie_6_Sandwich-Ventral_up-Microbeads.mp4" target="_blank">(Clique direito a download).</a>

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A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Um Sanduíche papel de filtro submerso por longo prazo<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Imagem Time-lapse de galinha precoce embriões

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

a-submerged-filter-paper-sandwich-for-long-term-ex-ovo-time-lapse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

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Vídeo: A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

Transferência de Gene eficiente em retinas pintainho para célula primária Estudos de Cultura: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Eletroporação Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Biologia do Desenvolvimento

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

Otimizado<em&gt; Ex-ovo</em&gt; A cultura de Chick embriões para estágio avançado de desenvolvimento

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Captura de Reparo de Tecidos em Zebrafish larvas com a Time-lapse Brightfield lupa estereoscópica

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

analisando<em&gt; In Vivo</em&gt; Migração celular usando transplantes de células e de imagem Time-lapse em embriões Zebrafish

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune cells, and the coordination with lymphatic vessels and nerves. The multi-cell, multi-system interactions necessitate the investigation of angiogenesis in a physiologically relevant environment. Thus, while the use of in vitro cell-culture models have provided mechanistic insights, a common critique is that they do not recapitulate the complexity associated with a microvascular network. The objective of this protocol is to demonstrate the ability to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks before and after angiogenesis stimulation in cultured rat mesentery tissues. Cultured tissues contain microvascular networks that maintain their hierarchy. Immunohistochemical labeling confirms the presence of endothelial cells, smooth muscle cells, pericytes, blood vessels and lymphatic vessels. In addition, labeling tissues with BSI-lectin enables time-lapse comparison of local network regions before and after serum or growth factor stimulation characterized by increased capillary sprouting and vessel density. In comparison to common cell culture models, this method provides a tool for endothelial cell lineage studies and tissue specific angiogenic drug evaluation in physiologically relevant microvascular networks.

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.

A<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Método for Imaging Time-Lapse of cultivadas Rato Mesentéricas microvasculares Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Um método de montagem versátil para Long Term Imagens de Desenvolvimento Zebrafish

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

Uma câmara simples para a imagem confocal a longo prazo do desenvolvimento da raiz e do hipocótilo

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Longo prazo Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco para os olhos

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

Fóton multi tempo lapso imagem para visualizar o desenvolvimento em tempo real: visualização de migrar as células da crista Neural em embriões de peixe-zebra

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Um método de montagem em camadas para a microscopia confocal de lapso de tempo prolongado de embriões zebrafish inteiros

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...