Name: long-term live imaging of drosophila eye disc
Uploaded: 2017-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc at JoVE.com

Somos gratos a Chun-lan Hsu e Yu-Chi Yang para preparar a comida mosca e manter os estoques da mosca, e Su-Ping Lee eo IMB imagem Núcleo por sua ajuda com a microscopia confocal. Este estudo foi apoiado por bolsas para YHS (NSC 101-2321-B-001 -004, NSC 100-2321-B-001 -012, NSC 102-2321-B-001 -002, MAIS 103-2311-B-001 -035 -MY3) do Conselho Nacional de Ciência e do Ministério da Ciência e Tecnologia da República da China.

Configuração 1. Pré-experimental <ol><li> Recolhe um ovo de mosca que expressa nuclear proteína fluorescente verde (GFP) sob mδ0.5-Gal4 e cultura a 25 ° C durante 5 dias. </li><li> Microondas 0,7 g de agarose de baixo ponto de fusão em 10 ml de solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS) até a agarose estar completamente dissolvida. Manter o gel de baixo ponto de fusão a 0,7% numa incubadora a 37 ° C até à sua utilização. </li><li> Esterilizar todo o equipamento, incluindo as pinças, tesouras, 42 mm x 0,17 mm lamelas, uma placa de ponto vidro 9 poços, e uma câmara de cultura magnética, com 70% de etanol por mais de 12 h. </li><li> Prepara-se o meio de cultura 3: meio de Drosophila de Schneider suplementado com 2% de Soro Fetal Bovino (FBS), 0,5% de penicilina-estreptomicina, e 1,25 mg / mL de insulina. Para evitar a contaminação, preparar a forma de um capuz de cultura de células. Armazenar o meio de cultura preparado, a 4 ° C e utilizadas dentro de um mês. </li><li> Limpe a plataforma de dissecção e o experimentador&#39;s mãos com etanol a 70% antes de iniciar a dissecção. </li></ol> Dissecção 2. Disco <ol><li> Air secar todo o equipamento a partir de 70% de etanol. </li><li> Selecione uma larva de terceiro instar de um frasco mosca. Para evitar a contaminação a partir do frasco de mosca, lavar a larva em 1x PBS, 3x para remover os resíduos. </li><li> Dissecar a larva limpas em 1 ml de meio de cultura (em RT) na 9-poço da placa de ponto de vidro sob um microscópio de dissecção. </li><li> Agarrar a larva com um par de pinças em cerca de um terço do caminho a partir da extremidade posterior e mais uma pinça no gancho boca. Puxar as duas pinças em sentidos opostos para libertar os tecidos internos. <ol><li> Retirar as glândulas salivares, gordura corporal, e a cutícula do complexo olho-cérebro ligado ao gancho boca. Se o cordão nervoso ventral está ainda ligado, cortá-lo afastado com uma tesoura. </li></ol></li><li> Utilizar um par de fórceps para agarrar o gancho boca e um par de fórceps para remover uma peça de tecido que connects os cérebros e discos de olho na parte dorsal. NOTA: Se esse tecido não é removido, os dois discos olho-antenal será próximos uns dos outros e do cérebro. Os discos oculares, em seguida, não vai ficar na posição horizontal sobre a lamela porque este tecido, o cérebro, e o disco de olho-de antenas irá formar um triângulo. </li><li> Gire todo o complexo para uma posição ventral-para cima. Remover o filamento que liga o gancho ou disco para o cérebro. NOTA: Se o filamento não é removido, o disco olho-antenal será dividida em duas peças, quando o gancho for removido da boca. <ol><li> Retirar o gancho boca. Tome cuidado para não danificar o disco olho durante o processo. NOTA: O disco olho é agora livre no meio e apenas ligado ao cérebro pela haste óptico. </li></ol></li></ol> 3. montagem <ol><li> Ar seco e montar os componentes da câmara com um x 0,17 milímetros lamela de 42 mm. Anexar uma dupla camada de O-rings para o centro da lâmina de cobertura para segurar thE agarose. </li><li> Monte a câmara com lamínula. Coloque a lamela de 42 mm x 0,17 mm no receptor de palco. Coloque o O-ring de silício sobre a tampa deslizante. Coloque a base. Bloqueie o cacifo de vedação e coloque a tampa ( Figura 1 ). </li><li> Transferir cuidadosamente o complexo olho-cérebro dissecado para o centro do O-ring usando uma micropipeta de 20 μL com uma ponta de 10-200 μL. </li><li> Remover a maior parte do meio e adicionar 12 μL de 0,7% de agarose de baixo ponto de fusão (a 37 ° C) à amostra. NOTA: A posição do disco ocular pode ser alterada com fórceps antes da solidificação da agarose. A agarose irá solidificar dentro de 5 min. <ol><li> Adicionar 1 mL de meio de cultura à temperatura ambiente ao centro do O-ring; Cada O-ring pode carregar até 4 amostras. Certifique-se de que a agarose é colada ao O-ring para evitar a derivação da amostra. NOTA: Não é necessária ventilação ou circulação do meio. </li></ol></li></ol>4. microscopia confocal <ol><li> Coloque a câmara na platina de um microscópio invertido confocal durante 30 minutos para equilibrar a temperatura. Isto pode impedir a dispersão do eixo Z durante a imagiologia. </li><li> Antes de imagens ao vivo de longo prazo, verificar se o tecido está intacta por microscopia de contraste de interferência diferencial. </li><li> Para evitar a fototoxicidade, utilize uma fonte de laser abaixo de 2 mW. Use uma objetiva de 40X para a imagem latente. </li><li> 62? M adquirir imagens Z-stack em 12 min a um intervalo óptico de 1? M. Adquirir 40 ciclos de varrimentos ao longo de um total de 10 h. Assegure-se que cada ciclo contém 12 min de imagiologia e 3 minutos de descanso. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Neste estudo, nós fornecemos um protocolo detalhado para um experimento de imagens ao vivo de longo prazo sobre discos imaginais de Drosophila. Passamos muito tempo praticando a dissecção cuidadosa para evitar danos ao disco e para permitir a fixação do disco perto as lamelas. Tentámos poli-L-lisina (PLL) e baixo ponto de fusão de agarose para segurar o tecido; no final, o de agarose de baixo ponto de fusão, demonstrou maior capacidade para manter o tecido. Embora apenas o disco olho foi usado no presente documento para demonstrar a ocorrência normal de diferenciação de fotorreceptores e rotação ommatidial durante o período de imagens ao vivo 10 h, este método também pode ser aplicado a, pelo menos, um outro disco, o disco da asa, como demonstrado em um estudo anterior 3. Além disso, a preparação de meio de cultura e configuração imagens ao vivo são simples e não exigem aeração ou circulação média. imagens ao vivo contínuo pode fornecer uma seqüência temporal clara de véspera biológicants. No nosso relatório anterior de diferenciação glia e migração no disco olho, nós fornecemos prova direta de que glia envolvendo diferenciar da glia existente após a migração para o anterior do disco olho 3. Longo prazo ex vivo cultura permite a rotulagem ativado por laser específico de células, como a foto-conversão da proteína fluorescente KAEDE, para seguir seus comportamentos 3. Ele também pode acomodar o teste de produtos químicos que são adicionados directamente ao meio de cultura; Assim, ele pode ser usado como uma plataforma de rastreio de drogas. Desde ocorrer algum processo dinâmico dentro de minutos ou segundos, alta resolução temporal é necessária. Para aumentar a resolução temporal, microscopia folha de luz 15, 16 ou microscopia de disco giratório 17 pode ser uma boa opção. A condição cultura atual não é perfeito. Ele não suporta o crescimento disco. celular proliferation só é suportada por até 12 h 3. Após 12 h em cultura ex vivo, a taxa de diferenciação de fotorreceptores começa a diminuir 3. Isto pode ser devido à falta de determinados nutrientes ou hormônios. Uma vez que a principal diferença neste meio de cultura, é a elevada concentração de insulina, a insulina de mamero pode ser parcialmente imitar a função de péptidos endógenos do tipo insulina. A adição de extracto de mosca, a trealose de açúcar no sangue de insectos, e várias concentrações da hormona de muda de 20-hidroxiecdisona, não eram benéficas 3. No entanto, o período de cultura de 12-18 horas é suficiente para estudar muitos processos de desenvolvimento. Métodos de cultivo alternativos para cultivar discos imaginais larvas foram comparados 3, e nossa condição de cultura e imagem fornece a janela de tempo mais longo e mais clareza para imagens ao vivo. Embora os discos dentro de larvas vivas e pupas podem ser visualizados diretamente18, 19, 20, 21, 22, a janela de tempo para resolução e observações são limitados. Larvar tardio e discos de pupa podem ser cultivadas durante um longo período de tempo 23, 24, mas os discos passam por morfogénese significativa. Para aproveitar os, discos larvais 2D planas, nosso método de cultivo e de imagem é a melhor solução até agora.

Os discos imaginais de Drosophila larvais ter sido um sistema experimental favorecida para o estudo de uma grande variedade de mecanismos biológicos. Estes discos invaginar a partir do epitélio embrionário e tornar-se estruturas de saco construídas por duas camadas epiteliais, Peripodial Epitélio (PE) e Disco adequada (DP) 1, 2. As células de discos imaginais proliferam e diferenciam-se progressivamente, durante as fases de larvas e de pupas e, eventualmente, tornar-se as estruturas do corpo adulto. Devido à estrutura de duas camadas plana e simples dos discos imaginais, elas são fáceis de observar quando dissecados a partir de larvas. No entanto, apesar de vários esforços por muitos grupos, os métodos atuais para a cultura de longo prazo dos discos imaginais não têm sido satisfatórios. Recentemente, desenvolvemos um método de cultura que pode sustentar o desenvolvimento normal de vários discos imaginais por até 18 h e que permite que imagens ao vivo 3 </s-se&gt;. O método de cultura pode suportar a diferenciação das células e a migração, mas ele pode suportar a proliferação celular por apenas 7-12 h e não pode suportar o crescimento do disco. A principal diferença no meio de cultura é a elevada concentração de insulina 3. O método é simples, e não é necessária nenhuma aeração especial ou a circulação média. Um dos discos imaginais mais estudado é o disco olho-antenal. O olho de Drosophila é construída de aproximadamente 800 ommatidia. Cada omatídeo é composta por oito células fotorreceptoras (R1-R8). No disco olho das larvas, as células fotorreceptoras diferenciam na sequência da passagem da Morfogenética Sulco (MF), que varre o disco olho de posterior para anterior 4, 5. Os fotorreceptores em um omatídeo diferenciar em sequência, começando com R 8, seguido por R2 / R5, R3 / R4, R 1 / R6, e R7 6. O ommatidia no dorsal e vemetades ntral do disco olho submetido a uma rotação de 90 ° em sentidos opostos, o que resulta em quiralidade oposta 7, 8. O processo de rotação ocorre em duas etapas: em primeiro lugar, uma rotação de 45 ° começa no e é completada a sexta linha ommatidia atrás do MF; a segunda rotação de 45 ° está concluída em cerca de linha 16 9, 10. Este estudo utilizou rotação ommatidial, marcado pela R3 / 4-específico mδ0.5-GA4 11, para demonstrar a diferenciação celular normal e dinâmica que pode ser observada através deste método para a cultura e vive-imagem do disco olho.

<table><tbody><tr><td>Low-melting agarose</td><td>AMRESCO&amp;nbsp;</td><td>0815-25G</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td><td>AMRESCO</td><td>0780-2PK</td><td></td></tr><tr><td>42 mm x 0.17 mm cover slips&amp;nbsp;</td><td>PST</td><td>G401-42</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; medium&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>759</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Culture chamber&amp;nbsp;</td><td>PECON</td><td></td><td>POC-R2 Cell Cultivation System</td></tr><tr><td>40X objective</td><td></td><td></td><td>C-Apochromat 40X/1.2W Korr objective&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fly strain:nls.GFP</td><td>Bloominggton</td><td>4775</td><td></td></tr></tbody></table>

long-term live imaging of drosophila eye disc

imagens ao vivo fornece a capacidade de monitorar continuamente os processos celulares e de desenvolvimento dinâmicos em tempo real. Drosophila discos imaginais das larvas foram usadas para estudar muitos processos biológicos, tais como a proliferação celular, a diferenciação, o crescimento, a migração, a apoptose, a competição, a sinalização célula-célula, e formação limite compartimental. No entanto, métodos para a ex vivo da cultura a longo prazo e imagens ao vivo dos discos imaginais não têm sido satisfatórios, apesar de muitos esforços. Recentemente, desenvolvemos um método para o longo prazo ex vivo da cultura e imagem ao vivo de discos imaginais para até 18 h. Além da utilização de uma elevada concentração de insulina no meio de cultura, uma agarose de baixo ponto de fusão também foi utilizado para incorporar o disco para impedir que deriva durante o período de imagem. Este relatório usa os discos olho-antenal como um exemplo. expressão mδ0.5-GA4 / 4-específica de fotorreceptores R3 foi seguido para demonstrar que fotorreceptores differenA rotação ommatidial pode ser observada durante um período de 10 h de imagem ao vivo. Este é um protocolo detalhado que descreve este método simples.

<html> Neste exemplo, os fotorreceptores R3 / R4 foram marcadas com mδ0.5-GA4 para monitorar a diferenciação de fotorreceptores. mδ0.5-GA4 dirige uma forte express em R4 e expressão mais fraca em R3 11, tornando-a um excelente marcador para R3 e R4, bem como para o processo de rotação ommatidial. Em Filme 1, R3 e R4 foram marcadas com GFP. No início da sessão de imagens ao vivo de 10 h, havia 8 linhas de aglomerados ommatidial (Figura 2A e um filme) e 14 linhas de aglomerados ommatidial no final (Figura 2B). A taxa de diferenciação ommatidial foi de 1,67 h por fila, que é próximo da taxa de 1,5-2 h / linha em in vivo discos 7, 8, 9, 10, 11,s = &quot;xref&quot;&gt; 12, 13, 14. Com base nas posições relativas dos R3 e R4, rotação ommatidial ocorrido no disco ex vivo em cultura durante a imagem ao vivo (Figura 2A &#39;A &#39;&#39;, B&#39; e B &#39;&#39;). Um conjunto R3 / R4 único foi marcado com uma esfera em branco do primeiro quadro de filme 2. No início, o eixo R3 / R4 parece ser perpendicular ao equador (Figura 2C e Filme 2). Em seguida, ele parece rodar 15 °, 30 °, 45 ° e no 3 (Figura 2C &#39;), 6 (Figura 2C &#39;&#39;), e 9 (Figura 2C &#39;&#39;&#39;) h, respectivamente. Estes dados sugerem que este método pode sustentar a diferenciação de fotorreceptores durante as imagens ao vivo 10 h. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55748/55748fig1.jpg" /> Figure 1: Diagrama esquemático de montagem de câmara. Diagrama esquemático da montagem de câmara de: (1) Coloque a lamela de camada dupla do anel-O-ligado no receptor de fase. (2) Colocar o silício anel de vedação sobre a lamela de cobertura. (3) Colocar a base. (4) Bloquear o armário de vedação. (5) carregar a amostra no centro do anel de vedação e colocar a tampa. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/55748fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55748/55748fig2.jpg" /> Figura 2: imagem ao vivo de R3 / R4 Diferenciação e rotação. R3 / R4 marcado com mδ0.5-Gal4-expressando GFP forma nuclear durante 10 h de imagens ao vivo. Todos os valores foram capturados a partir de filme 1. (A) A imagem obtida no início. ( <strong<html> &gt; A&#39;-A&quot;) imagem ampliada da área de box à esquerda (A&#39;) e direito (A&quot;). (B) A imagem obtida no final do período de 10 h. (B&#39;-B&quot;) imagem ampliada da área de box na esquerda (B&#39;) e direito (B&quot;). (CC &#39;&#39; &#39;) Um par R3 / R4 único (assinalado por uma seta em A&#39;) é seguida ao longo do tempo para demonstrar a rotação do par de R3 / R4. Barras de escala = 15? m, 10? m, e 5? M em A, B, e C, respectivamente. Todas as figuras são z projecções de intensidade máxima. A escala de tempo é mostrado em h: min. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/55748fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="filme 1" src="/files/ftp_upload/55748/55748mov1.jpg" /> Filme 1:Rce.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_1.avi &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para fazer o download deste filme. <img alt="Filme 2" src="/files/ftp_upload/55748/55748mov2.jpg" /> Filme 1: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_2.avi" target="_blank">Clique aqui para fazer o download deste filme.</a>

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Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Este protocolo descreve um método detalhado para a longo prazo ex vivo cultura e imagens ao vivo de um disco imaginal Drosophila. Ele demonstra a diferenciação de fotorreceptores e rotação ommatidial dentro do período de 10 h de imagens ao vivo do disco olho. O protocolo é simples e não requer instalação caros.

Longo prazo Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco para os olhos

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

long-term-live-imaging-of-drosophila-eye-disc

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

8.4K visualizações.  National Yang-Ming University.  Este protocolo descreve um método detalhado para a longo prazo ex vivo cultura e imagens ao vivo de um disco imaginal Drosophila. Ele demonstra a diferenciação de fotorreceptores e rotação ommatidial dentro do período de 10 h de imagens ao vivo do disco olho. O protocolo é simples e não requer instalação caros. 

Vídeo: Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Vivo-imaging da<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Biologia do Desenvolvimento

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Imagens ao vivo da migração das células da glia no Disco Drosophila Eye Imaginal

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Biologia

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries made using this system have taken advantage of the spatiotemporal nature of photoreceptor differentiation in the developing eye imaginal disc. To use this system it is first necessary for the researcher to learn to identify and dissect the eye disc. We describe a novel RFP reporter to aid in the identification of the eye disc and the visualization of specific cell types in the developing eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc from third instar larvae and describe how the eye-RFP reporter can aid in this dissection. This eye-RFP reporter is only expressed in the eye and can be visualized using fluorescence microscopy either in live tissue or after fixation without the need for signal amplification. We also show how this reporter can be used to identify specific cells types within the eye disc. This protocol and the use of the eye-RFP reporter will aid researchers using the Drosophila eye to address fundamentally important biological questions.

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

We describe a novel red fluorescent protein (RFP) reporter that is expressed specifically in the Drosophila eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc and how this reporter can be used to aid in the dissection and identification of specific cell types in the developing eye.

A Novel Reporter RFP para ajudar na visualização do Disco Imaginal Eye em Drosophila</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Preparação de Desenvolvimento e Adultos Drosophila Brains e retina de imagens ao vivo

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

<meta charset="utf8"></head><body>Imagem ao vivo estendida da morfogênese da perna de pupa de Drosophila sem pupúrio

Long-Term Live Imaging of Drosophila Pupal Leg Development After Puparium Removal

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which fate-determined cells form three-dimensional organismal shapes remains unclear. Recent advances in confocal microscopy have facilitated efforts to observe cell dynamics during development through live imaging. The Drosophila melanogaster pupa is ideal for live imaging due to its immobility, transparent pupal cuticle, and the availability of fluorescent reporter lines. A primary challenge for imaging is the puparium, the cuticle surrounding the pupa, which obstructs optical imaging. While previous methods involved either partial or complete removal of the puparium, maintaining pupal viability for extended periods after this procedure has remained challenging. Here, a simple method is presented for days-long live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete puparium removal. The method includes removing the puparium from a pupa adhered to double-sided tape, followed by assembling a small chamber on a glass-bottom dish to enclose the pupa and a drop of water. This setup is straightforward, reliable, and supports extended pupal survival by preventing desiccation. Long-term live imaging of the Drosophila pupa has significantly contributed to capturing how the adult leg undergoes dramatic three-dimensional structural changes over 2-3 days. These changes include the transient formation of an intriguing structure (the Parthenon-like structure) by epithelial cells, rapid tissue narrowing, joint formation, and bristle elongation. This method is applicable to the observation of various tissues and can potentially be combined with other techniques, such as optical gene induction, to advance the understanding of cell dynamics during the final shape formation of tissues in the pupal stage.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Descobrindo estruturas epiteliais dinâmicas durante o desenvolvimento de Drosophila

Here, a protocol is presented for long-term live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete removal of the puparium. This protocol can also be applied to other tissues.

Imagem ao vivo de longo prazo do desenvolvimento da perna de pupa de Drosophila após a remoção do pupário

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Imagens ao vivo de Proteínas GFP-rotulados em<em&gt; Drosophila</em&gt; Oócitos

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

O tomate / GFP-FLP / FRT Method for Imaging ao vivo de Mosaico Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; As células fotorreceptoras

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Longo prazo Imagens ao vivo de

Resumo

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Vivo-imaging da

Imagens ao vivo da migração das células da glia no Disco Drosophila Eye Imaginal

A Novel Reporter RFP para ajudar na visualização do Disco Imaginal Eye em Drosophila

Preparação de Desenvolvimento e Adultos Drosophila Brains e retina de imagens ao vivo

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Imagem ao vivo de longo prazo do desenvolvimento da perna de pupa de Drosophila após a remoção do pupário

Imagem ao vivo de longo prazo do desenvolvimento da perna de pupa de Drosophila após a remoção do pupário

Imagem ao vivo de longo prazo do desenvolvimento da perna de pupa de Drosophila após a remoção do pupário

Imagens ao vivo de Proteínas GFP-rotulados em

O tomate / GFP-FLP / FRT Method for Imaging ao vivo de Mosaico Adulto