Queremos agradecer ao Dr. Devin Gary por sua introspecção e feedback sobre o uso de células GRP.

Introdução Neste protocolo vamos mostrar como extrair, selecionar e placa gliais restritas precursor (GRP), as células da medula espinhal de fetos de rato E13. Estas células são precursores precoces dentro dos linhagens celulares oligodendrocytic e astrocitária e são definidos pela sua expressão de A2B5. No meio de GRP suplementado com FGF-2, os A2B5 GRPs + de começará expressando o início dos anos oligodendrocytic linhagem marcadores PDGFαR e NG2 1,2. Estas células da linhagem de oligodendrócitos passar através de uma série de fases distintas fenotípicas, cada um deles caracterizada por alterações morfológicas, bem como a expressão de marcadores específicos para estádios de desenvolvimento. Essas células precursoras estão actualmente a ser estudada como uma fonte potencial de células-abordagens terapêuticas baseadas nos distúrbios da matéria branca do sistema nervoso central, incluindo esclerose múltipla, leucodistrofias e leucomalácia periventricular (LPV) 3,4,5,6 </sup&gt;. Estudos utilizando cérebro humano derivado de precursores de linhagem de oligodendrócitos relataram remielinização bem sucedido em cérebros de o modelo dysmyelination shiverer rato bem como na desmielinização modelos de roedores da medula espinal 6,7,8,9. Estas células precursoras da glia também têm sido utilizados em estudos de outros modelos de substância branca de doença tais como lesão da medula espinal e esclerose lateral amiotrófica 10,11,12,13. Nosso laboratório desenvolveu um modelo de rato pós-natal precoce hipóxia-isquemia com a qual estamos avaliando a eficácia destes medula espinhal derivadas de células GRP como uma abordagem restaurativa no PVL, a principal causa de paralisia cerebral 14,15,16. Existe também um cérebro de roedores derivado modelo OPC que tem sido amplamente utilizada para estudar a lesão da substância branca uma vez que as células de GRP tem uma tendência para se diferenciarem em a via astrocítica 17. O fenótipo OPC já entrou no caminho linhagem de oligodendrócitos, um fenômeno que parece irreversible. No entanto, estamos interessados ​​em avaliar a resposta de um espectro mais amplo de progenitores oligodendrócitos incluindo GRPs e, possivelmente, até mesmo os NEPS derivados em E10.5. Por este motivo adotamos o modelo derivado da medula espinhal GRP para o nosso trabalho. Além da utilização de GRPs para substituição de células, a derivação destas células de tipo selvagem e modelos de roedores transgénicos de doenças da substância branca permite um estudo mais aprofundado diferenciação glial em condições normais e de doença em um em configuração vitro. Publicações anteriores mostram evidências de vulnerabilidade seletiva de células precursoras da linhagem oligodendrocytic a vários estressores externos, como a maturação excitotoxicidade do glutamato dependente, estresse oxidativo, e os fatores envolvidos na escolha neuroinflamação 18,19. Nossos estudos têm-se centrado na compreensão dos mecanismos celulares e moleculares por trás do desenvolvimento dessas lesões da substância branca, avaliando a suscetibilidade das células emo espectro linhagem de oligodendrócitos para insultar, bem como analisar supostas abordagens terapêuticas. Materiais Todos os procedimentos que envolvem animais em conformidade com a política eo PHS IACUC JHU. Todos os procedimentos devem ser realizados em uma câmara de fluxo laminar a fim de manter condições assépticas. Comumente dissecações são realizadas de uma câmara de fluxo horizontal e in vitro trabalho numa câmara de fluxo vertical. Todos os meios utilizados frio durante dissecações. Os ratos utilizados em nosso estudo são um tipo selvagem CD-1 e uma cepa transgênica GFP em um fundo C57/BL6. Um CD-1 represa mouse normalmente produz 10 fetos + que são suficientes para sementes 1-2 T25 frascos. Normalmente, duas barragens são sacrificados em um tempo e fetais medulas espinhais agrupados e semeadas em 1 frasco T25 por barragem. Uma vez que as células foram derivados podem ser expandidos e caracterizadas in vitro para estudos posteriores. 1. Preparação de Mídia e garrafas <ul type="disc"><li> GRP estoquemeio é utilizado como o meio de dissecção: DMEM / F12 1:1 (Invitrogen) + B27 (50x; Invitrogen) N2 (100X; Invitrogen) Suplementos e albumina de soro bovino (BSA; 0,5% w / v). </li><li> A dissociação média: mesmo como meio de dissecção. </li><li> O meio de cultura: meio GRP estoque + FGF-2 (10-20 ng / ml; Invitrogen) e heparina (1 ug / ml; Sigma). </li><li> PLL / laminina revestidos 75 cm 2 ou 25 cm 2 frascos T75 (ou T25). </li><li> Frascos de cultura de tecidos (75 cm 2, Falcon) foram revestidas com 15-20μg/ml poli-L-lisina (PLL; Sigma) em H2O destilada, incubados a 37 ° C durante 1 hora, em seguida, aspirado. Frascos são lavadas com PBS 1X, em seguida, revestidas com ug 15-20 / laminina ml (Sigma) em PBS a 37 ° C durante 1 h, então aspirado e PBS fresco ou meios adicionado até que as células estão prontas para ser revestido. Após revestimento, frascos nunca deve ser deixada a secar, mas pode ser mantido em PBS ou meio a 4 ° C durante breves períodos antes da utilização. </li></ul> 2. Instrumentos e M Outrosaterial <ul type="disc"><li> Placas de Petri: 4 barragens por: 3 placas de Petri para dissecção (75 mm), um prato de 20 mm para recolher os cabos colhidos da coluna vertebral. </li><li> Tesoura maior (43 mm tesoura operacionais, Roboz) e uma pinça para a abertura do abdome da barragem s. </li><li> Tesoura pequena para dissecar o útero e remover os fetos (15 mm Micro tesoura de dissecção, Roboz). </li><li> Micro tesoura mola Dissecando (6 mm) para dissecar a medula espinhal do feto. </li><li> Dissecando Micro Pinça angulada para ancorar o corpo da barragem e fetal durante a cirurgia e depois a remoção da medula espinhal, uma vez exposta. </li><li> 40 ou 70 células filtro micrômetro para a remoção de detritos de células antes da semeadura. </li><li> 0,05% de tripsina pré-aquecida a 37 ° C. </li><li> 10 mg / ml de ADNase 1 (Sigma), preparado como um stock 100x (1 g / ml). </li><li> Bio perigo-saco para cadáveres de animais. </li><li> 15 e 50 tubos de centrífuga ml para o processamento extraída medulas espinais. </li></ul> 3. Determinar Timed Pregnancy Barragens rato grávidas ou são ordenadas a partir de fontes comerciais, especificando a entrega no dia embrionário E12 ou E13 do desenvolvimento fetal ou gravidez determinado in-house. Em suma, duas fêmeas são colocadas junto com um macho no final da tarde e saiu durante a noite juntos. No dia seguinte, as fêmeas são observadas para a presença do tampão de muco vaginal localizado. O tampão de muco é apenas uma indicação de que o acasalamento ocorreu tão animais são subsequentemente pesados ​​diariamente para monitorar taxa de aumento de peso. O dia em que o tampão de muco é observada é definido como um dia embrionário (E1). 4. Derivação tecido <ol><li> Trabalhar sob uma capela de fluxo horizontal para manter as condições assépticas. </li><li> Pulverizar para baixo do capô e área de trabalho com etanol 70%. </li><li> Instrumentos autoclave ou pulverização liberalmente com etanol 70%. </li><li> Prepare instrumentos, mídia e microscópio para uso. </li><li> Despeje 20 ml de meio de dissecção fria em estéril Petri dish. </li><li> Anestesiar animal com hidrato de cloral (500 mg / kg) administrado intraperitonealmente (IP), seguido por deslocamento cervical ou decapitação. </li><li> Pulverizar a área abdominal da mãe com etanol 70-90% (desinfecção) </li><li> Abra abdômen com tesoura grande e fórceps. <ol type="a"><li> No CD1 e C57/BL6 cepas: Geralmente de 8 a 14 fetos estarão dentro do útero. O número de fetos é a estirpe dependente. </li></ol></li><li> Extraia o útero do rato, incluindo os filhotes e coloque em meio dissecção fria e fresca em uma placa de Petri limpa para lavar o sangue e restos de tecido do feto. </li><li> Extraia cada feto do corno uterino e separá-los do saco embrionário e placenta usando as pequenas tesouras. Transfira os fetos extraídos em meio de dissecção fresco numa nova placa de Petri. <ol type="a"><li> Meio de dissecção deve ser a uma temperatura baixa para reduzir a actividade metabólica e preservar a viabilidade das células derivadas. </li><li> Trabalhe a partir de agora com duas pinças emicro dissecação mola-tesoura. </li></ol></li><li> Trabalhando sob microscópio de dissecção, corte a pele ao longo da medula espinhal com a tesoura micro cirúrgicos e pele casca de volta para expor a medula espinhal. </li><li> Transecão da medula espinal com a tesoura microcirúrgicos menos cerca de C1 e no início da cauda. </li><li> Retire a medula espinhal com uma pinça sem corte, garantir que todos os ossos e cartilagens são removidos e transferir a 3 ª placa de Petri de dissecar médio. </li><li> Para evitar o crescimento excessivo do tecido meníngea em culturas de células subsequentes tentar remover o máximo das meninges possível da medula espinhal. Devido às nascentes salientes nervos periféricos isto é mais difícil do que a remoção de tecido de cérebro meníngea extraído. </li><li> Uma vez meninges foram removidos, transfira medulas espinhais de 20 milímetros prato Petri </li><li> Limpar cuidadosamente por pulverização a área com etanol 70-90%. </li><li> Os passos seguintes para a dissociação deve ser feito rapidamente para manteruma alta viabilidade do tecido da medula espinal derivada. </li></ol> 5. Estabelecimento Cultura <ol><li> Tripsina deve ser pré-aquecido durante pelo menos 30 min, em um 37 ° CH 2 O banho-maria. Uma alíquota apropriado deve ser removido a partir do stock para reduzir a exposição do material a flutuações de temperatura. </li><li> Transferir colhidos os cordões da coluna vertebral para um tubo de centrífuga de 50 ml contendo 10 ml de pré-aquecida de tripsina (0,05%; Qualidade Biologicals) e 100 uL de DNAse (10 mg / ml) e tritura-se brevemente. </li><li> Incubar em 37 ° CH 2 O banho-maria durante 10 minutos. </li><li> Tritura-se e incubar durante mais 10 min. </li><li> Adicionar 5 ml de GRP médio (definido acima) e centrifugação durante 5 min a 1000 RPM. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender pelete com 10 médio GRP ml e adicionar DNAse-1 (10 mg / ml; Sigma). </li><li> Incubar em 37 ° CH 2 O banho-maria durante 10 minutos. </li><li> Centrifugar 5 min a 1000 RPM e aspirar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o pellet com fresh médio GRP detritos, em seguida, com um filtro de 40-70 coador de células mM. </li><li> Placa no PLL / laminina 25 cm revestido 2 frascos (T25) e incubar a 37 ° C, humidade de 95% e 5% de CO 2. </li><li> 100 mídias% em mudar do dia seguinte. </li><li> Neste ponto, GRPs ter ligado e começou a estender processos. </li></ol> 6. Immunopanning da População GRP <ol><li> Placa de tecido da medula espinhal em PLL / laminina frascos revestidos até balão é de 85-90% confluentes ou cerca de uma semana. </li><li> Células de colheita por raspagem balão com um polícia de borracha ou com tripsina a 0,05%, tritura-se cuidadosamente, mas com cuidado, centrifugar a 1000 rpm durante 5 min e completamente pelete ressuspender com 3 ml médio GRP. </li><li> Transferir 1 ml de cada para 3 T25 frascos ou 3 ml de uma T75 balão adicionar volumes adequados de meio para cobrir completamente as células e permitir frascos para atingir confluência de 80-90%. </li><li> Alterar mídia todos os dias, mais cedo se esgota rapidamente médio. </li><li> Brasão bacteriológica Pepratos tri (75 mm) durante a noite a 4 ° C com um anticorpo IgM anti-rato (Southern Biotech), 10 ug / ml em PBS. </li><li> Aspirar o tampão em excesso e lavar os pratos de Petri 3x com PBS. </li><li> Adicionar A2B5 anticorpo (Millipore), a uma concentração de 5 ug / ml diluído em PBS e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente (RT). </li><li> Lavar as placas de novo 3x com PBS, em seguida, adicionar 8 ml de meio de GRP para evitar a secagem da placa. </li><li> Transferir 5 ml de meio de GRP a partir de placas de Petri e células GRP colheita por raspagem frascos com um polícia de borracha para separar todas as células </li><li> Triturar suspensão de células rapidamente para quebrar pedaços e transferir suspensão de células 5ml aos A2B5 revestidos pratos de Petri bacteriológicos. </li><li> Incubar 1 hora à temperatura ambiente sem agitação. </li><li> Após 1 h de mídia aspirado e as placas de lavagem 8x com PBS. </li><li> Raspe as células com um policial de borracha em 2 ml GRP mídia, em seguida, transferir para PLL / laminina placas revestidas ou frascos com volume adequado de meio GRP. </li&gt; </ol> 7. Congelamento e armazenamento de células derivadas <ol><li> As células são colhidas a partir de um 85-90% T25 ou T75 balão confluente com 2 ml de tripsina a 0,05%. </li><li> Tripsina é diluído e inactivada com 8ml médio estoque GRP e centrifugadas a 1000 rpm durante 5 min. </li><li> Pelotas de T25 frascos são ressuspensas em 1 ml de GRP meio de congelação, (GRP médio estoque suplementado com 10% (v / v) de DMSO e, opcionalmente, de FBS 20%). Os peletes maiores a partir de frascos T75 são diluídas duas vezes. </li><li> As suspensões de células de 1,5 - 3 x 10 10,11,12,13 células são transferidas para frascos criogénicas (Nalgene) e armazenados durante a noite num recipiente criogénico (Nalgene) contendo isopropanol a -80 ° C a congelar lentamente durante a noite. </li><li> Na sequência durante a noite células de congelamento são transferidos para caixas de congeladores e armazenado 6 meses a 1 ano à temperatura de -80 ° C ou a longo prazo em N (l). As células descongeladas são tipicamente de 60-80% viável dependendo em grande parte a qualidade do revestimento PLL / laminina. </li></ol&gt; 8. Os resultados representativos CO 2 não é usado para anestesiar o animal por causa do efeito possível a jusante na viabilidade dos fetos e, finalmente, as células derivadas. Além disso, será muito difícil de remover totalmente as meninges da medula espinhal durante o procedimento de derivação, mas a combinação de GRP médio e immunopanning irá eliminar estas células de crescimento rápido. Do mesmo modo, toda a medula espinhal é colhida, apesar de uma maior concentração ventral da população GRP, devido à sua origem na medula espinal ventral e migrar dorsalmente 20. No entanto, o meio de GRP selecciona para o fenótipo GRP e de que a população é maximizada por A2B5 immunopanning. Após o plaqueamento tecidos medulares, as culturas in vitro são incubadas durante duas passagens ou cerca de uma semana. Após 2 dias em cultura, as células de diferentes morfologias pode ser observado nos frascos de cultura de tecidos que indicam o heteroátomogeneidade da população, mas o meio de GRP selecciona para o fenótipo GRP. Essas células são uma combinação de A2B5 + de GRP, E-NCAM + de precursores neuronais restritas (PNR) e nestina + e A2B5-neuroepiteliais células e possivelmente fibronectina + meníngeos células. Além disso, fenótipos mais maduras podem estar presentes marcadores que expressam incluindo doublecortin e TUJ1 para a linhagem neuronal, GFAP para astrócitos e PDGFaR e GalC para a linhagem oligo A fim de maximizar uma altamente GRP população enriquecida a partir da piscina de partida heterogénea (Figura 1A), as células podem ser duas vezes immunopanned para seleccionar e eliminar os E-NCAM + de células seguida por selecção para o A2B5 + população GRP uma vez densidade celular aumentou para cerca de 85-90% de confluência em frascos T75. Estas células GRP manter a sua capacidade de se tornar astrócitos apesar de estar em um meio que selecciona para o fenótipo A2B5 oligodendrócito assim immunopanning subsequente pode ser necessária para manter uma população altamente enriquecida GRP. Immunopanning Generrendimento aliado até 95% A2B5 + de células, mas para o rendimento de ainda maior A2B5 conjugados esferas magnéticas (Miltenyi Biotec, Inc.) pode ser usado para fornecer um rendimento de até 97%. Vigilância nas culturas de manutenção GRP, tais como mudanças regulares meios irá minimizar a proliferação de tipos de células não-GRP. Mesmo na ausência de BMP-4 astrócitos pode ainda ser encontrado e empobrecido meios de comunicação em particular, parece induzir a diferenciação para um fenótipo astrocítica. Embora o suplemento B27 contém tri-iodotironina hormonal (T3), não houve nenhuma tendência observada para se diferenciarem em oligodendrócitos na população GRP, apenas quando os níveis mais elevados de T3 são adicionados ao meio de não ocorrer este fenómeno. No entanto, um T3 B27 suplemento livre pode ser substituído se existe uma preocupação para a contaminação por oligodendrócitos maduros (Figura 1B). Estas células GRP podem ser prontamente identificados pela sua morfologia de soma pequena com 2 ou 3 processos curtos, mas para o rastreio de outros tipos de células que podem estar presentes, immunocytochemistry pode ser realizada para as anteriormente denominadas marcadores comuns do tipo de desenvolvimento e de células específicos. Há será normalmente uma pequena população persistente de A2B5 de células que são neuroepitelial (NEP) e capaz de se tornar, quer GRP ou NRP. Felizmente, as células mais longos são mantidas no meio de GRP o mais provável que o meio irá seleccionar para o fenótipo GRP. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3462/3462fig1.jpg" /> Figura 1. A) Plated células da medula espinal de morfologia heterogénea são observados após 2 dias em cultura. B) Immunopanning maximiza uma população altamente GRP enriquecido a partir da piscina de partida heterogénea.

<ol>
	<li>Kalyani, A., Hobson, K., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroepithelial+stem+cells+from+the+embryonic+spinal+cord:+isolation,+characterization,+and+clonal+analysis.">Neuroepithelial stem cells from the embryonic spinal cord: isolation, characterization, and clonal analysis.</a> Developmental biology. 186, 202-202 (1997).</li><li>Rao, M. S., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial-restricted+precursors+are+derived+from+multipotent+neuroepithelial+stem+cells.">Glial-restricted precursors are derived from multipotent neuroepithelial stem cells.</a> Developmental biology. 188, 48-48 (1997).</li><li>Goldman, S. A., Lang, J., Roy, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+cell-based+myelination+as+a+model+for+cell-based+therapy+of+the+central+nervous+system.">Progenitor cell-based myelination as a model for cell-based therapy of the central nervous system.</a> Ernst Schering Research Foundation workshop. (60), 195-195 (2006).</li><li>Goldman, S. A., Schanz, S., Windrem, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-based+strategies+for+treating+pediatric+disorders+of+myelin.">Stem cell-based strategies for treating pediatric disorders of myelin.</a> Human molecular genetics. 17, 76-76 (2008).</li><li>Goldman, S. A., Windrem, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+replacement+therapy+in+neurological+disease.">Cell replacement therapy in neurological disease.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. 361, 1463-1463 (2006).</li><li>Walczak, P., All, A. H., Rumpal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+glial-restricted+progenitors+survive,+proliferate,+and+preserve+electrophysiological+function+in+rats+with+focal+inflammatory+spinal+cord+demyelination.">Human glial-restricted progenitors survive, proliferate, and preserve electrophysiological function in rats with focal inflammatory spinal cord demyelination.</a> Glia. 59, 499-499 (2011).</li><li>Liu, S., Qu, Y., Stewart, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+differentiate+into+oligodendrocytes+and+myelinate+in+culture+and+after+spinal+cord+transplantation.">Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 6126-6126 (2000).</li><li>Windrem, M. S., Schanz, S. J., Guo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+chimerization+with+human+glial+progenitor+cells+can+both+remyelinate+and+rescue+the+otherwise+lethally+hypomyelinated+shiverer+mouse.">Neonatal chimerization with human glial progenitor cells can both remyelinate and rescue the otherwise lethally hypomyelinated shiverer mouse.</a> Cell stem cell. 2, 553-553 (2008).</li><li>Groves, A. K., Barnett, S. C., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+demyelinated+lesions+by+transplantation+of+purified+O-2A+progenitor+cells.">Repair of demyelinated lesions by transplantation of purified O-2A progenitor cells.</a> Nature. 362, 453-453 (1993).</li><li>Back, S. A., Han, B. H., Luo, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+of+late+oligodendrocyte+progenitors+to+hypoxia-ischemia.">Selective vulnerability of late oligodendrocyte progenitors to hypoxia-ischemia.</a> J. Neurosci. 22, 455-45 (2002).</li><li>Johnston, M. V., Trescher, W. H., Ishida, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobiology+of+hypoxic-ischemic+injury+in+the+developing+brain.">Neurobiology of hypoxic-ischemic injury in the developing brain.</a> Pediatric research. 49, 735-735 (2001).</li><li>Lepore, A. C., Han, S. S., Tyler-Polsz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+fate+of+multipotent+and+lineage-restricted+neural+precursors+following+transplantation+into+the+adult+CNS.">Differential fate of multipotent and lineage-restricted neural precursors following transplantation into the adult CNS.</a> Neuron glia biology. 1, 113-113 (2004).</li><li>Rothstein, J. D., Dykes-Hoberg, M., Pardo, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+of+glutamate+transporters+reveals+a+major+role+for+astroglial+transport+in+excitotoxicity+and+clearance+of+glutamate.">Knockout of glutamate transporters reveals a major role for astroglial transport in excitotoxicity and clearance of glutamate.</a> Neuron. 16, 675-675 (1996).</li><li>Johnston, M. V., Ferriero, D. M., Vannucci, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+cerebral+palsy:+which+ones+are+best.">Models of cerebral palsy: which ones are best.</a> Journal of child neurology. 20, 984-98 (2005).</li><li>Comi, A. M., Johnston, M. V., Wilson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+variability,+injury+distribution,+and+seizure+onset+in+a+mouse+model+of+stroke+in+the+immature+brain.">Strain variability, injury distribution, and seizure onset in a mouse model of stroke in the immature brain.</a> Developmental neuroscience. 27, 127-127 (2005).</li><li>Comi, A. M., Weisz, C. J., Highet, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+stroke+and+ischemic+seizures+in+the+immature+mouse.">A new model of stroke and ischemic seizures in the immature mouse.</a> Pediatric neurology. 31, 254-254 (2004).</li><li>Dietrich, J., Noble, M., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+A2B5++glial+precursor+cells+from+cryopreserved+human+fetal+brain+progenitor+cells.">Characterization of A2B5+ glial precursor cells from cryopreserved human fetal brain progenitor cells.</a> Glia. 40, (2002).</li><li>Alberdi, E., Sanchez-Gomez, M. V., Marino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+influx+through+AMPA+or+kainate+receptors+alone+is+sufficient+to+initiate+excitotoxicity+in+cultured+oligodendrocytes.">Ca(2+) influx through AMPA or kainate receptors alone is sufficient to initiate excitotoxicity in cultured oligodendrocytes.</a> Neurobiology of disease. 9, 234-234 (2002).</li><li>Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+injury+in+premature+infants:+a+complex+amalgam+of+destructive+and+developmental+disturbances.">Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances.</a> Lancet neurology. 8, 110-110 (2009).</li><li>Warf, B. C., Fok-Seang, J., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+ventral+origin+of+oligodendrocyte+precursors+in+the+rat+spinal+cord.">Evidence for the ventral origin of oligodendrocyte precursors in the rat spinal cord.</a> J. Neurosci. 11, 2477-2477 (1991).</li><li>Deng, W., Poretz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+in+developmental+neurotoxicity.">Oligodendroglia in developmental neurotoxicity.</a> Neurotoxicology. 24, 161-161 (2003).</li><li>Deng, W., Rosenberg, P. A., Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-permeable+AMPA/kainate+receptors+mediate+toxicity+and+preconditioning+by+oxygen-glucose+deprivation+in+oligodendrocyte+precursors.">Calcium-permeable AMPA/kainate receptors mediate toxicity and preconditioning by oxygen-glucose deprivation in oligodendrocyte precursors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 6801-6801 (2003).</li><li>Karadottir, R., Cavelier, P., Bergersen, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptors+are+expressed+in+oligodendrocytes+and+activated+in+ischaemia.">NMDA receptors are expressed in oligodendrocytes and activated in ischaemia.</a> Nature. 438, 1162-1162 (2005).</li><li>Pleasure, D., Soulika, A., Singh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+white+matter:+clinical+and+pathophysiological+aspects.">Inflammation in white matter: clinical and pathophysiological aspects.</a> Mental retardation and developmental disabilities research reviews. 12, 141-141 (2006).</li><li>Gregori, N., Proschel, C., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tripotential+glial-restricted+precursor+(GRP)+cell+and+glial+development+in+the+spinal+cord:+generation+of+bipotential+oligodendrocyte-type-2+astrocyte+progenitor+cells+and+dorsal-ventral+differences+in+GRP+cell+function.">The tripotential glial-restricted precursor (GRP) cell and glial development in the spinal cord: generation of bipotential oligodendrocyte-type-2 astrocyte progenitor cells and dorsal-ventral differences in GRP cell function.</a> J. Neurosci. 22, 248-248 (2002).</li><li>Rao, M. S., Noble, M., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tripotential+glial+precursor+cell+is+present+in+the+developing+spinal+cord.">A tripotential glial precursor cell is present in the developing spinal cord.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3996-3996 (1998).</li><li>Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glial+progenitor+cell+that+develops+in+vitro+into+an+astrocyte+or+an+oligodendrocyte+depending+on+culture+medium.">A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium.</a> Nature. 303, 390-390 (1983).</li><li>Strathmann, F. G., Wang, X., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+novel+glial-restricted+cell+populations+in+the+embryonic+telencephalon+arising+from+unique+origins.">Identification of two novel glial-restricted cell populations in the embryonic telencephalon arising from unique origins.</a> BMC developmental biology. 7, 33-33 (2007).</li><li>Nunes, M. C., Roy, N. S., Keyoung, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+multipotential+neural+progenitor+cells+from+the+subcortical+white+matter+of+the+adult+human+brain.">Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain.</a> Nature. 9, 439-439 (2003).</li><li>Roy, N. S., Wang, S., Harrison-Restelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation,+and+promoter-defined+separation+of+mitotic+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+the+adult+human+subcortical+white+matter.">Identification, isolation, and promoter-defined separation of mitotic oligodendrocyte progenitor cells from the adult human subcortical white matter.</a> J. Neurosci. 19, 9986-9986 (1999).</li><li>Chen, Y., Balasubramaniyan, V., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells.">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nature protocols. 2, 1044-1044 (2007).</li></ol>

Este estudo foi financiado pelo Instituto Nacional de Saúde [NICHD P30HD024061 (AWP), NINDS K08NS063956 (AF), e R01NS028208 (MVJ)] e da Fundação de Neurologia Infantil. O conteúdo deste relatório são da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Saúde, DHHS. Os autores não têm conflitos de interesse relevante para este estudo.

<p class="jove_content"Transtornos de matéria branca do sistema nervoso central incluem um grande número de etiologias, incluindo genéticas, causas inflamatórias, isquémica e tóxico<sup&gt; 19,21,22,23,24</sup&gt;. Enquanto a esclerose múltipla e vasculopatias são a principal causa de doença matéria branca em adultos, leucoencefalomalácia associada com a prematuridade é a causa mais comum de lesão matéria branca na população infantil. A fim de delinear mecanismos da doença um estudo mais aprofundado de células da linhagem ofoligodendrocytic, que são bastante afetados pelo insulto perinatal, é necessária. GRPs foram isolados a partir do roedor medula espinal embrionária e mostrou ser tripotential na natureza, dando origem a oligodendrócitos e astrócitos duas populações distintas, mas não se diferenciar em neurónios<sup&gt; 2,25,26</sup&gt;. Da mesma forma, as células precursoras de oligodendrócitos (OPC) derivadas de rato nervo óptico e cérebro do rato tarde embrionário ou pós-natal têm sido demonstradas para amadurecer em oligodendrócitos em funcionamento nas condições de suportes adequados<sup&gt; 27,28</sup&gt;. Além disso, fetal ou adultos derivado OPC humana foram ainda manipulado para mais maduros fenótipos oligodendrócitos<sup&gt; 29,30</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"Células&gt; GRP têm sido isolados a partir de ambos a medula espinhal de E13.5 ratos e E12-13,5 em ratinhos. Nas diferenças de ratos têm sido relatados entre as células GRP-dorsal e ventral derivado em sua resposta às condições que promovam a geração de oligodendrócitos, astrócitos ou ventral com derivados de GRPs exibindo uma maior propensão de se diferenciar em os fenótipos mais maduros<sup&gt; 25,26,28</sup&gt;. Isto é pode ser devido à migração ventral para dorsal das células GRP nascentes, que poderão ser menos receptiva para as pistas de diferenciação. Immunopanning permite a subpopulação que expressa A2B5 a ser isolado e recolhido para manutenção em cultura.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; As nossas culturas de rato GRP são derivadas de tecido da medula espinal que produz total de uma população, heterogénea agrupada de células a partir do qual as células são seleccionadas por GRP química (médio) e técnicas de anticorpo com base. Enquanto os nossos estudos têm utilizado a medula espinhal células de ratinho derivados GRP, que mais recentemente tem sido relatada a derivação de cérebro de rato derivados de células progenitoras de oligodendrócitos que também são capazes de se desenvolver em oligodendrócitos maduros<sup&gt; 31</sup&gt;. Aqui, as células derivadas são inicialmente cultivados como oligospheres que a utilização do meio de cultura apropriado são manipulados em um PDGFαR enriquecido +, a população de OPC<sup&gt; 31</sup&gt;. Os nossos estudos têm-se centrado sobre o efeito do nosso modelo de hipóxico-isquémico insulto em células no espectro de linhagem oligodendrócito de A2B5 + e PDGFαR-GRP precursores para a proteína básica da mielina (MBP expressando +) oligodendrócitos maduros. Na verdade, nossa<em&gt; In vitro</emCaracterização&gt; mostrou essas células imaturas GRP amadurecem como células que expressam MBP ou em monoculturas ou em co-culturas com neurônios corticais. Estas células podem ser manipuladas em cultura em vias de diferenciação específicos para estudar os mecanismos envolvidos na lesão da substância perinatal branco. Existem vários modelos de ratos de doenças substância branca, envolvendo células da linhagem de oligodendrócitos ea disponibilidade desta população permite investigação exaustiva aos mecanismos que causam lesão, bem como para explorar a utilidade de opções terapêuticas possíveis de células.</p

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> DMEM / F12 01:01 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320033 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td></tr><tr><td> N2 </td><td> Invitrogen </td><td> 17502048 </td></tr><tr><td> rH-FGF-básico </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0026 </td></tr><tr><td> Tripsina (0,05%) EDTA </td><td> Qualidade Biológica, Inc. </td><td> 118-087-721 </td></tr><tr><td> Poli-L-Lisina HBr </td><td> Sigma </td><td> P1274-25mg </td></tr><tr><td> A laminina </td><td> Sigma </td><td> L2020-1mg </td></tr><tr><td> Dnase 1 </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td></tr></tbody></table>

derivation of glial restricted precursors from e13 mice

Este é um protocolo para a derivação de gliais restritas precursor (GRP), as células da medula espinal de fetos de rato E13. Estas células são precursores precoces dentro da linhagem de células oligodendrocytic. Recentemente, estas células têm sido estudadas como fonte potencial para terapias de reparação em doenças da substância branca. Leucomalácia periventricular (LPV) é a principal causa de não-genéticos doença da substância branca na infância e afeta até 50% dos prematuros extremos. Os dados sugerem uma maior suscetibilidade do cérebro em desenvolvimento de hipóxia-isquemia, estresse oxidativo e excitotoxicidade, que visa seletivamente substância branca nascente. Gliais precursores restritos (GRP), células progenitoras de oligodendrócitos (OPC) e oligodendrócitos imaturos (preOL) parecem ser os principais intervenientes no desenvolvimento de LPV e são objecto de prosseguimento de estudos. Além disso, estudos anteriores identificaram um subconjunto de tecido do SNC que tem aumentado a susceptibilidade a excitotoxicidade do glutamato comobem como um padrão de desenvolvimento para a suscetibilidade. O nosso laboratório está actualmente a investigar o papel das células progenitoras de oligodendrócitos em células PVL e utilização na fase de desenvolvimento de GRP. Nós utilizamos essas células derivadas de PRFV em vários paradigmas experimentais para testar sua resposta para selecionar tensões consistentes com LPV. GRP células podem ser manipuladas in vitro em OPCs e preOL para experimentos com modelos animais de transplante PVL e modelos in vitro de PVL-como insultos, incluindo hipóxia-isquemia. Ao utilizar células cultivadas in vitro e estudos não seria reduzida variabilidade entre os experimentos o que facilita a interpretação dos dados. Células de cultura também permite o enriquecimento da população GRP enquanto minimiza o impacto de contaminar as células de não-GRP fenótipo.

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice at JoVE.com

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

Este protocolo descreve a derivação de gliais Precursores restritos a partir de medulas espinais fetais e mantido in vitro, quer para transplantação ou para o estudo da linhagem oligodendrocytic.

Derivação da glia Precursores restritos de camundongos E13

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors ...

derivation-of-glial-restricted-precursors-from-e13-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K visualizações.  Johns Hopkins University. Este protocolo descreve a derivação de gliais Precursores restritos a partir de medulas espinais fetais e mantido in vitro, quer para transplantação ou para o estudo da linhagem oligodendrocytic.

Vídeo: Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

Derivação eficiente dos recursos humanos Progenitores Neuronal e Neurônios de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Neurociência

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications for understanding the pathogenesis of demyelinating diseases such as Multiple Sclerosis (MS). Cellular development is commonly studied with primary cell culture models. Primary cell culture facilitates the evaluation of a given cell type by providing a controlled environment, free of the extraneous variables that are present in vivo. While OL cultures derived from rats have provided a vast amount of insight into OL biology, similar efforts at establishing OL cultures from mice has been met with major obstacles. Developing methods to culture murine primary OLs is imperative in order to take advantage of the available transgenic mouse lines. 
Multiple methods for extraction of OPCs from rodent tissue have been described, ranging from neurosphere derivation, differential adhesion purification and immunopurification 1-3. While many methods offer success, most require extensive culture times and/or costly equipment/reagents. To circumvent this, purifying OPCs from murine tissue with an adaptation of the method originally described by McCarthy &amp; 
de Vellis 2 is preferred. This method involves physically separating OPCs from a mixed glial culture derived from neonatal rodent cortices. The result is a purified OPC population that can be differentiated into an OL-enriched culture. This approach is appealing due to its relatively short culture time and the unnecessary requirement for growth factors or immunopanning antibodies. 
While exploring the mechanisms of OL development in a purified culture is informative, it does not provide the most physiologically relevant environment for assessing myelin sheath formation. Co-culturing OLs with neurons would lend insight into the molecular underpinnings regulating OL-mediated myelination of axons. For many OL/neuron co-culture studies, dorsal root ganglion neurons (DRGNs) have proven to be the neuron type of choice. They are ideal for co-culture with OLs due to their ease of extraction, minimal amount of contaminating cells, and formation of dense neurite beds. While studies using rat/mouse myelinating xenocultures have been published 4-6, a method for the derivation of such OL/DRGN myelinating co-cultures from post-natal murine tissue has not been described. Here we present detailed methods on how to effectively produce such cultures, along with examples of expected results. These methods are useful for addressing questions relevant to OL development/myelinating function, and are useful tools in the field of neuroscience.

This article describes methods to derive enriched populations of murine oligodendrocyte precursor cells (OPCs) in primary culture, which differentiate to produce mature oligodendrocytes (OLs). In addition, this report describes techniques to produce murine myelinating co-cultures by seeding mouse OPCs onto a neurite bed of mouse dorsal root ganglion neurons (DRGNs).

Derivação de Enriquecido Culturas oligodendroglial e Neuron / oligodendroglial Myelinating Co-culturas de tecidos pós-natais murino

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induzir Plasticidade de astrocítica Receptores de Manipulação de Neuronal queima de moeda

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Derivação sem alimentador de células da crista neural progenitoras pluripotentes humanas de células-tronco

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information regarding glial activities at the cellular and molecular levels has been obtained through in vitro cell culture systems. The in vitro systems utilized, mainly include primary glia derived from neonatal brain cortical tissue and immortalized cell lines. However, these systems may not reflect the characteristics of spinal cord glial cells in vivo. In order to further investigate the roles of spinal cord glial cells in the development of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain using a culture system that better reflects the in vivo condition, our laboratory has developed a method to establish primary spinal cord mixed glial cultures from adult mice. Briefly, spinal cords are collected from adult mice and processed through papain digestion followed by myelin removal with a density-gradient medium. Single cell suspensions are cultured in complete Dulbecco&#39;s modified Eagle media (cDMEM) supplemented with 2-mercaptoethanol (2-ME) at 35.9 oC. These culture conditions were optimized specifically for the growth of mixed glial cells. Under these conditions, cells are ready to be used for experimentation between 12 - 14 d&#160;(cells are usually in log phase during this time) after the establishment of the culture (D 0) and can be kept in culture conditions up to D 21. This culture system can be used to investigate the responses of spinal cord glial cells upon stimulation with various substances and agents. Besides neuropathic pain, this system can be used to study glial responses in other diseases that involve pathological changes of spinal cord glial cells.

The development of neuropathic pain involves pathological changes of spinal cord glial cells. A reliable glial culture system derived from adult spinal cord tissue and designed for studying these cells in vitro is lacking. Therefore, we show here how&#160;to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue.

Preparação de culturas mista glial primários de rato adulto Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of Parkinson&#39;s disease is not pathologically confirmed in up to 25% of clinically diagnosed Parkinson&#39;s disease. Therefore, tissue collected from clinically diagnosed patients with idiopathic Parkinson&#39;s disease can have a high rate of misdiagnosis; hence in vitro studies from such tissues to study Parkinson&#39;s disease as a preclinical model can become futile.
By collecting postmortem human leptomeninges with a confirmed neuropathological diagnosis of Parkinson&#39;s disease and characterized by nigrostriatal cell loss and intracellular protein inclusions called Lewy bodies, one can be certain that clinically observed parkinsonism is not caused by another underlying disease process (e.g. tumor, arteriosclerosis).
This protocol presents the dissection and preparation of postmortem human leptomeninges for derivation of a meningeal fibroblast culture. This procedure is robust and has a high success rate. The challenge of the culture is sterility as the brain procurement is generally not performed under sterile conditions. Therefore, it is important to supplement the culture media with a cocktail of penicillin, streptomycin, and amphotericin B.
The derivation of meningeal fibroblasts from autopsy-confirmed cases with Parkinson&#39;s disease provides the foundation for in vitro modeling of Parkinson&#39;s disease. Meningeal fibroblasts appear 3-9 days after sample preparation and about 20-30 million cells can be cryopreserved in 6-8 weeks. The meningeal fibroblast culture is homogenous and the cells express fibronectin, a commonly used marker to identify meninges.

The leptomeninges explant culture protocol from human postmortem brain is a technically robust and simple way to derive fibronectin-positive meningeal fibroblasts within 6-8 weeks and cryopreserve approximately 20-30 million cells.

Derivação de culturas leptomeninges explantes de Postmortem Cérebro humano Doadores

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons as well as synchronizing the outputs of pyramidal neuron ensembles. Deficits in interneuron function have been implicated in a variety of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia, autism, and epilepsy. The derivation of cortical interneurons from embryonic stem cells not only allows for the study of their development and function, but provides insight into the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of cortical interneuron-related disorders. Interneurons also have the remarkable capacity to survive, migrate, and integrate into host cortical circuitry post-transplantation, making them ideal candidates for use in cell-based therapies. Here, we present a scalable, highly efficient, modified embryoid body-to-monolayer method for the derivation of Nkx2.1-expressing interneuron progenitors and their progeny from mouse embryonic stem cells (mESCs). Using a Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC line, Nkx2.1 progenitors or their Lhx6-expressing post-mitotic progeny can be isolated via fluorescence-activated cell sorting (FACS) and subsequently used in a number of downstream applications. We also provide methods to enrich for parvalbumin (PV) or somatostatin (SST) interneuron subgroups, which may be helpful for studying aspects of fate determination or for use in therapeutic applications that would benefit from interneuron subgroup-enriched transplantations.

This protocol describes a method for generating cortical interneuron progenitors and post-mitotic interneuron precursors from mouse embryonic stem cells using a modified embryoid body-to-monolayer method. These progenitors/precursors can be used in vitro or fluorescently sorted and transplanted into neonatal neocortex for studying fate determination, or used in therapeutic applications.

Diferenciação de células estaminais embrionárias de rato em Cortical interneurônio precursores

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to the skull or the brain parenchyma. In anesthetized rodents, the exposure of the dura mater by blunt dissection of the neck muscles allows the insertion of a cannula into the cisterna magna (CM). The cannula, composed either by a fine beveled needle or borosilicate capillary, is attached via a polyethylene (PE) tube to a syringe. Using a syringe pump, molecules can then be injected at controlled rates directly into the CM, which is continuous with the subarachnoid space. From the subarachnoid space, we can trace CSF fluxes by convective flow into the perivascular space around penetrating arterioles, where solute exchange with the interstitial fluid (ISF) occurs. CMc can be performed for acute injections immediately following the surgery, or for chronic implantation, with later injection in anesthetized or awake, freely moving rodents. Quantitation of tracer distribution in the brain parenchyma can be performed by epifluorescence, 2-photon microscopy, and magnetic resonance imaging (MRI), depending on the physico-chemical properties of the injected molecules. Thus, CMc in conjunction with various imaging techniques offers a powerful tool for assessment of the glymphatic system and CSF dynamics and function. Furthermore, CMc can be utilized as a conduit for fast, brain-wide delivery of signaling molecules and metabolic substrates that could not otherwise cross the blood brain barrier (BBB).

Here we describe a protocol to perform cisterna magna cannulation (CMc), a minimally invasive way to deliver tracers, substrates and signaling molecules into the cerebrospinal fluid (CSF). Combined with different imaging modalities, CMc enables glymphatic system and CSF dynamics assessment, as well as brain-wide delivery of various compounds.

Cânula de implantação para a Cisterna Magna de roedores

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to ...

Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed electrical field of a large volume of brain tissue, extracting information about local activity is challenging. Studying neuronal microcircuits, however, requires a reliable distinction between truly local events and volume-conducted signals originating in distant brain areas. Current source density (CSD) analysis offers a solution for this problem by providing information about current sinks and sources in the vicinity of the electrodes. In brain areas with laminar cytoarchitecture such as the hippocampus, one-dimensional CSD can be obtained by estimating the second spatial derivative of the LFP. Here, we describe a method to record multilaminar LFPs using linear silicon probes implanted into the dorsal hippocampus. CSD traces are computed along individual shanks of the probe. This protocol thus describes a procedure to resolve spatially restricted neuronal network oscillations in the hippocampus of freely moving mice.

This protocol describes the recording of local field potentials with multi-shank linear silicon probes. Conversion of the signals using current source density analysis allows the reconstruction of local electrical activity in the mouse hippocampus. With this technique, spatially restricted brain oscillations can be studied in freely moving mice.

Gravação espacialmente restrita oscilações no hipocampo de ratos de comportar-se

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the roles of intrinsic vs. extrinsic mechanisms that regulate this differentiation process is a conundrum for all developmental neurobiologists. This issue is magnified for GABAergic interneurons, an incredibly heterogeneous cell population that is born from transient embryonic structures and undergo a protracted migratory phase to disperse throughout the telencephalon. To explore how different brain environments affect interneuron fate and maturation, we developed a protocol for harvesting fluorescently labeled immature interneuron precursors from specific brain regions in newborn mice (P0-P2). At this age, interneuron migration is nearly complete and these cells are residing in their final resting environments with relatively little synaptic integration. Following collection of single cell solutions via flow cytometry, these interneuron precursors are transplanted into P0-P2 wildtype postnatal pups. By performing both homotopic (e.g., cortex-to-cortex) or heterotopic (e.g., cortex-to-hippocampus) transplantations, one can assess how challenging immature interneurons in new brain environments affects their fate, maturation, and circuit integration. Brains can be harvested in adult mice and assayed with a wide variety of posthoc analysis on grafted cells, including immunohistochemical, electrophysiological and transcriptional profiling. This general approach provides investigators with a strategy to assay how distinct brain environments can influence numerous aspects of neuron development and identify if specific neuronal characteristics are primarily driven by hardwired genetic programs or environmental cues.

Challenging young neurons in new brain regions can reveal important insights into how the environment sculpts neuronal fate and maturation. This protocol describes a procedure to harvest interneuron precursors from specific brain regions and transplant them either homotopically or heterotopically into the brain of postnatal pups.

Homochronic transplante de precursores interneurônio nos cérebros de Mouse pós-natal precoce

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...