Autores querem reconhecer contribuições críticas do Dr. A. Dejam e MM Pelletier no desenvolvimento do uso da solução de nitrito de preservação para as medições de nitrito no sangue.

Todos os protocolos, incluindo o uso de animais foram aprovados para uso pelo NIDDK Animal Care e do Comitê Use e sangue humano foi obtido a partir dos bancos de sangue NIH de doadores saudáveis. Preparação 1. Amostra <ol><li> Preparação da solução de nitrito de preservação <ol><li> Prepara-se uma solução contendo 890 mM de ferricianeto de potássio (K 3 Fe (CN) 6) e NEM 118 mM (N-etilmaleimida) em água destilada. Dissolva bem até que fique claro amarelo sem cristais presentes. Adicionar NP-40 (octil phenoxylpolyethoxylethanol) em uma proporção de 1: 9 (v / v, NP-40 / solução). Misture com cuidado para evitar a formação de espuma e armazenar a 4 ° C, durante cerca de uma semana). </li></ol></li><li> Recolha e preparação de amostras de sangue <ol><li> Recolha de sangue, utilizando, pelo menos, uma agulha de 20 G para evitar hemólise com a heparina para evitar a coagulação (5 U / ml). Para a amostra de sangue, misturar sangue com nitrito de solução conservante imediatamente em uma proporção de 1: 4 (v/ V / solução de sangue). </li><li> Para as amostras de plasma e células vermelhas do sangue, centrifugação do sangue recolhido durante 5 min a 4000 xg, a 4 ° C para separar as células vermelhas do sangue (RBC) e plasma. Tome-se o sobrenadante (plasma) e misturá-lo com nitrito de solução conservante, como descrito acima para a determinação dos níveis de nitrito no plasma. </li><li> Cuidadosamente remover a restante plasma e buffy coat a partir da amostra e da pipeta da amostra de glóbulos vermelhos a partir do fundo do tubo para evitar a contaminação por outros tipos de células do sangue, utilizando uma ponta de pipeta de corte, e transferi-lo para um tubo contendo solução conservante nitrito na mesma razão como acima. </li><li> Misturar cada amostra (plasma e glóbulos vermelhos) com metanol frio a uma razão de 1: 1 ou 1: 2 (v / v da amostra / metanol) e centrifugar para a 13.000 xg, a 4 ° C durante 15 min para precipitar as proteínas. Leve o sobrenadante e usá-lo para a medição de nitrito ou congelar amostras preparadas, se necessário, em gelo seco e armazenar a -80 ° C. Nota: Nitrito rea rapidamentects com oxi-hemoglobina (oxiHb) em nitrato de formação de sangue. Desde oxiHb está sempre presente em grande excesso em relação nitrito, esta reacção conduz à aniquilação quase completa de nitrito de sangue nativo com um prazo de ~ 10 min. A fim de preservar a maioria de nitrito de sangue endógena, solução de preservação é adicionado nitrito de toda a amostra de sangue imediatamente após a colheita de sangue. A solução irá rapidamente lisar as células vermelhas do sangue e oxidar oxiHb em metemoglobina (metHb), uma forma inactiva de hemoglobina que não reage quimicamente com o nitrito. </li></ol></li><li> Preparação de amostras de outros tipos de fluido corporal <ol><li> Após a coleta de amostra para um recipiente adequado, misture bem com nitrito de preservar solução, deproteinate e medir imediatamente ou congelar e armazenar a -80 ° C. </li></ol></li><li> Recolha e preparação de amostras de tecido <ol><li> Recolha de tecidos animais perfundidos com solução salina heparinizada (10 U HEPARin / ml). Especial de consumo de cerca de 1 g de tecido desejado e homogeneizar ou usando um homogeneizador manual ou automatizado um homogeneizador. </li><li> Adicionar quantidade conhecida de solução de nitrito de preservação, conforme necessário para atingir homogenato suave. </li><li> Uma vez que o tecido é homogeneizado, precipitar as proteínas utilizando metanol frio (1: 1 ou 1: 2, razão v / v de amostra / metanol), como descrito acima, as amostras depois de centrifugação a 13.000 xg, a 4 ° C durante 15 min. </li><li> Recolha níveis de nitrito sobrenadante e medida. Se necessário, congelar amostras em qualquer fase da preparação sobre gelo seco e armazenar a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Preparação de reduzir Soluções <ol><li> Tri-iodeto (I 3) reduzir a solução de nitrito e R- (X) -NO espécies determinação 1,3,4 <ol><li> Prepara-se uma solução de Kl 301 mM em conjunto com 138 mM de solução de I2 em água. Misturar-se com ácido acético glacial na proporção de 2: 7 (v / v / solução de ácido) num agitador magnético durante ~ 30 min, até que todoscristais são dissolvidos. Preferencialmente manter em garrafa escura, como iodeto é sensível à luz, e usar dentro de uma semana de preparação. Nota: Esta solução reduzirá o nitrito em NO e que também irá liberar NO a partir de R-SNO, R-NNO e Fe-NO grupos funcionais (R- (X) -NO), mas o nitrato não será afetado. O sinal a partir dos grupos funcionais à base de NO acima podem ser separados a partir do sinal verdadeiro nitrito por tratamento de metade da amostra com sulfanilamida acidificada (AS) e comparando-tratado como sinal e não tratada. AS irreversivelmente forma de diazónio catião com nitrito e este complexo não pode ser reduzida em I 3 solução. Porque, assim como o tratamento, prepare uma solução 290 mM de sulfanilamida em HCl 1 M e adicioná-lo a uma alíquota de amostra na proporção de 1: 9 (v / v AS / amostra). Medir o sinal de CL em partes AS-tratadas e não tratadas da amostra. Calcule o sinal de nitrito de verdade, como uma diferença de parte AS-tratados e não tratados da amostra. Nitrito pode também ser medido usando um nit selectivarito de redução de solução de / mistura de ácido acético ascórbico como descrito na parte 2.2. No entanto, devido à pequena quantidade geralmente de R- (X) -NO espécies presentes, medições usando como amostras-não tratados são na maioria dos casos, uma muito boa aproximação do teor total de nitrito. </li></ol></li><li> O ácido ascórbico / ácido acético solução (4A) para a determinação selectiva de nitrito de dois <ol><li> Prepare o ácido ascórbico 500 mm de água. Misturar esta solução com ácido acético glacial numa razão de 1: 7 (v / v, ácido ascórbico / ácido acético) para se preparar a mistura de reacção. Nota: Esta solução é específico para nitrito, não vai liberar NO a partir de qualquer R- (X) -NO espécie ou nitrato. No entanto, a solução de ácido acético e ascórbico deve ser preparada de fresco a cada dia antes das medições, como o ácido ascórbico oxida facilmente em solução. Conclusão de redução de nitritos depende da concentração de ácido ascórbico; e ácido ascórbico 50 mM, pelo menos, é recomendado para R completaedução de nitrito de plasma. No entanto, recomenda-se realizar algumas experiências piloto com diferentes concentrações de ácido ascórbico e padrões de nitrito no intervalo de concentração de nitrito esperado antes das medições por amostra final. Tenha em atenção que o ácido ascórbico esgota ligeiramente durante as medições, mudanças frequentes de modo de mistura de reacção na câmara de reacção de vidro são recomendados. </li></ol></li><li> Vanádio (III) solução de cloreto de redução para a determinação de nitrato de 9 <ol><li> Preparar uma solução 51 mM de VCl 3 em HCl 1M. Filtrar a solução através de um filtro de 200 um e armazenar em um frasco escuro, use dentro de duas semanas. Nota: Esta solução irá reduzir o nitrato, nitrito e todos R- (X) -NO espécies, por isso, se quantidades comparáveis de nitrito ou outro R- (X) -NO espécies estão presentes em conjunto com o nitrato, o teor final de nitrato tem de ser calculado como a diferença entre os sinais obtidos com CL VCl 3 e I3 reduzindo soluções. </li></ol></li></ol> 3. A quimiluminescência (CL) de configuração e Medidas Analyzer <ol><li> Solução padrão <ol><li> Prepare 1 uM solução de nitrito de sódio (NaNO 2). A mesma solução pode ser utilizado para determinações de nitrito e nitrato. </li></ol></li><li> Usando analisador Nota: Atualmente, existem dois disponíveis comercialmente NÃO analisadores que são sensíveis o suficiente para fins de pesquisa biológica - Sievers NOA e Ecophysics CLD 88Y. Ambos operam no mesmo princípio; a diferença principal é que CLD 88Y utiliza oxigénio do ar ambiente para fazer o ozono (O3), enquanto NOA requer um tanque de oxigénio exterior para o efeito. O procedimento abaixo descreve o conjunto para o Sievers NOA. <ol><li> configuração do instrumento <ol><li> Faça um ajuste inicial do analisador de acordo com as recomendações do fabricantecomo visto na Figura 1. </li><li> Abrir O tanque 2 ligado ao instrumento. Escolha &quot;análise&quot; e &quot;enter&quot; no menu principal no painel frontal. Na tela seguinte, escolha &quot;iniciar&quot; e pressione &quot;Enter&quot;. Ligar a armadilha de ácido (contendo NaOH 1 M) para o instrumento, conforme visto na Figura 1. </li><li> Esperar até fotomultiplicador arrefece para a temperatura inferior a -12 ° C e a câmara de reacção é evacuado a 6 Torr. Demora cerca de 30 min para chegar a uma linha de base plana e estável. A linha de base precisa para estabilizar dentro de 1 - 2 mV, o seu valor nominal é menos importante do que a sua estabilidade. Nota: Se o nitrato é medido, ligar o banho de arrefecimento de água (definido a 4 ° C, o que serve como armadilha fria por vapores de ácido e água) e o banho de água com aquecimento (a câmara de reacção principal, 95 ° C). A taxa de redução de nitrato em NO VCl 3 em solução é dependente da temperatura, e é muito lenta em Tempe quartotura, de modo substancial aumento da temperatura é necessária para observar a reacção. </li><li> Abra o tanque Ele e ligar a câmara de reacção de vidro para armadilha de ácido, como visto na Figura 1. Encha a câmara de reacção com uma solução de redução apropriado, reduzir a borbulhar para o mínimo e ligar câmara de reação para a armadilha de ácido. Usando tentativa e erro, ajustar a taxa de borbulhamento Ele para coincidir com a taxa de aspiração do instrumento (normalmente a ~ 200 mL / min para NOA de Siever). </li><li> Ligue o computador que controla o instrumento e iniciar o software líquido baseado em LabVIEW. Para ativar a comunicação entre o instrumento e o software de aquisição, pressione &quot;Enter&quot; quando em &quot;menu de dados&quot; até que a tela lê &quot;saída habilitado&quot;, em seguida, pressione &quot;claro&quot; para voltar para a tela de dados. </li><li> Espere por um traço linha de base estável na tela e começar a injetar amostras e padrões de nitrito na solução redutora através do septo. Sempre esperar para chegar a um ré linha de base estáveler o pico. Isso pode levar até 2 min. O software líquido tem uma opção para &quot;marcar&quot; tempos de injecção e anotar a injeção e vai exportar estes comentários em um arquivo separado (filename.info) como um complemento útil para o arquivo de dados (filename.data). </li><li> Uma vez que as amostras e padrões são medidos, escolha &quot;stop&quot; opção no menu de software líquido - o que irá gravar dados de um arquivo temporário em um arquivo permanente conhecido como &quot;filename.data&quot;. Pressionando opção &quot;abortar&quot; irá terminar a medição sem escrever dados adquiridos em um arquivo permanente. </li><li> Para terminar experimento, desligue o aparelho do recipiente de reacção, desligando a torneira na parte superior do recipiente de reacção e desligue o tubo entre a armadilha ácida e vaso de reação (ver Figura 1). Agora, pare de analisador NOA - pressione &quot;claro&quot;, vá para &quot;análise&quot;, colocar máquina em &quot;standby&quot; e espera &quot;confirmar&quot;. Se usado regularmente, oinstrumento pode ser deixado em modo de espera durante várias semanas. Desligue o fornecimento de oxigênio. Em seguida, lavar a solução redutora da câmara de reacção, de desconexão e fechar o tanque Ele a partir do vaso de reacção de vidro e proceder ao acabamento vaso de reacção. </li></ol></li><li> Padrões e amostras injecções <ol><li> Injecte 50 ul de solução de nitrito de 1 uM na mistura reaccional utilizando uma seringa de Hamilton bem lavadas. Aguarde pelo menos 1 - 2 min entre as injeções para conseguir uma boa separação dos picos. Repita injecção de 50 ul para chegar duplicados para cada ponto de dados. Lavar seringa com água desionizada após cada injecção. </li><li> Para adquirir conjunto completo de dados para curva padrão, continue com injecções em duplicado de 100, 150 mL (adicional de 200 mL pode ser necessária se altas concentrações de nitrito ou nitrato são esperados) de solução de nitrito de 1 ï¿½. Em cada caso, ter o cuidado de esperar até que o sinal cai de volta para a linha de base e, em seguida, adquirir 1 - 2 min da linha de base para alcançar uma boa separação dos picos. Nota: os padrões de nitrito pode ser medido em qualquer momento durante as experiências. No entanto, é preferível para obter a curva padrão, antes da medição de dados, como também serve como um controlo independente de funcionalidade instrumento. Quando os dados são coletados, quantidade de amostra injetada deve levar a picos bem pronunciadas. No entanto, deve ser mantido em mente que o fotomultiplicador é linear apenas até ~ 800 mV, de modo nenhum o pico deve ser superior a ~ 700 mV. Isto pode ser conseguido quer através da diminuição da quantidade injectada amostra ou a diluição da amostra com a água desionizada. Cada ponto deve ser medida pelo menos em duplicado. </li></ol></li></ol></li></ol>

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Dr. Alan Schechter está listado como um co-inventor de várias patentes emitidas para os Institutos Nacionais de Saúde para o uso de sais de nitrito para o tratamento de doenças cardiovasculares. Ele recebe royalties com base no licenciamento NIH destas patentes para o desenvolvimento clínico, mas nenhuma outra compensação.

Passos críticos dentro do Protocolo Alíquotas de todas as soluções (incluindo a água) utilizados para preparar, diluir ou de outro modo tratar amostras originais têm de ser salvo e devolvido para possível nitrito ou (mais frequentemente) contaminação por nitrato. Nós descobrimos que a maioria vem de contaminação de água e muitos produtos químicos utilizados para tratar a amostra (ferricianeto em particular) também contém quantidades significativas de contaminação de nitrato em...

Nitrito, e um nitrato menos estender, os níveis no sangue refletem o estado geral do corpo NO metabolismo. concentrações de nitrito no sangue e a maioria dos órgãos e tecidos são apenas em nanomolar alta ou baixa gama micromolar, nitrato está normalmente presente em quantidades muito mais elevadas - na gama micromolar. Alterações nos níveis de nitrito devido à progressão da doença ou mudanças nos hábitos alimentares são bastante pequeno e só pode ser medido utilizando um método muito sensível. Por causa de seus níveis muito diferentes e diversos processos metabólicos, determinação separada dos níveis de nitrito e nitrato é essencial. Os chamados &quot;NO x determinação&quot;, onde nitrito e nitrato são medidos em conjunto tem muito pouco valor. Vários métodos para a quantificação de nitrito em várias amostras biológicas foram desenvolvidos - sendo o mais comum o mais antigo, com base na reacção de Griess, que tinha sido originalmente descrita em 1879. Mesmo com modificatio modernans, o limite de sensibilidade para nitrito atingível pelo método de Griess &#39;está em baixa gama micromolar. Quimiluminescência (CL), combinado com o tri-iodeto de solução redutora, é actualmente considerado como o método mais sensível, permitindo a quantificação na gama baixa nanomolar das concentrações de nitrito 1-8,10,11. O mesmo método CL, combinado com vanádio (III), cloreto de solução redutora, pode ser usado para medições sensíveis de nitrato, com precisão na gama nanomolar 9. CL detecta NO gás livre. Portanto, nitrito, nitrato, R-nitrosotióis (R-SNO), R-nitrosaminas (R-Nno), ou compostos de metal-Não (posteriormente referido como manuscrito &quot;R- (X) -NO&quot;), tem de ser convertida em grátis Sem gás, a fim de quantificar seus valores originais via CL. Conversão de NO é efectuada através de várias soluções redutoras diferentes, dependendo da natureza do NO metabolito. Após a conversão, livre Nenhum gás é purgado do recipiente de reacção por um gás transportador (He, N2 ou Ar) para dentro da câmara de reacção de um analisador CL onde o ozono (O3) é combinado com NO para formar dióxido de azoto (NO2) no seu estado activado. Com o retorno ao estado fundamental, NO 2 * emite na região do infravermelho e fóton emitido é detectada pelo fotomultiplicador (PMT) de instrumento de CL. A intensidade de luz emitida é directamente proporcional à concentração de NO na câmara de reacção, o que permite o cálculo da concentração das espécies originais usando curvas de calibração adequada. Em nosso protocolo, primeiro presente deliberação baseada em CL de nitrito e nitrato nos ambientes clínicos mais utilizados - em sangue e plasma, e depois discutimos como determinar estes íons em amostras de tecido. Nós também explicar em detalhes como preservar a concentração de nitrito fisiológica original, em ambientes de nitrito-reativa, como o sangue e seus componentes, plasma e glóbulos vermelhos.

<table><tbody><tr><td>potassium ferricyanide; K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;Fe(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>702587</td><td></td></tr><tr><td>NEM; N-ethylmaleimide</td><td>Sigma</td><td>4260</td><td></td></tr><tr><td>NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>sulfanilamide; AS&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9251</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>acetic acid, glacial</td><td>Sigma</td><td>A9967</td><td></td></tr><tr><td>ascorbic acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>potassium iodide; KI</td><td>Sigma</td><td>60399</td><td></td></tr><tr><td>iodine; I&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>207772</td><td>light sensitive, toxic</td></tr><tr><td>sodium nitrite; NaNO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>563218</td><td></td></tr><tr><td>vanadium(III) chloride; VCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>208272</td><td>ligt sensitive, toxic</td></tr><tr><td>GentleMac</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sievers NOA 280i</td><td>GE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CLD 88Y</td><td>&amp;nbsp;Ecophysics&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring nitrite and nitrate, metabolites in the nitric oxide pathway, in biological materials using the chemiluminescence method

O óxido nítrico (NO) é um dos principais reguladores de moléculas na homeostase vascular e também um neurotransmissor. NO enzimaticamente produzido é oxidado em nitrito e nitrato por interações com várias proteínas oxi-heme e outras vias ainda não são bem conhecidos. O processo inverso, a redução de nitrito e nitrato em NO tinha sido descoberto em mamíferos na última década e está ganhando a atenção como um dos possíveis caminhos para prevenir ou aliviar toda uma gama de doenças cardiovasculares, doenças metabólicas e musculares que são pensados ​​para estar associado a diminuição dos níveis de NO. É, portanto, importante para estimar a quantidade de NO e dos seus metabolitos em diferentes compartimentos do corpo - sangue, fluidos corporais e os vários tecidos. Sangue, devido à sua fácil acessibilidade, é o compartimento preferido utilizado para a estimativa de metabólitos. Devido à sua curta vida (alguns milissegundos) e baixa concentração de sub-nanomolar, medições confiáveis ​​diretos de sangue NO &lt;em&gt; in vivo apresentam grandes dificuldades técnicas. Assim NO disponibilidade geralmente é estimado com base na quantidade de seus produtos de oxidação, nitrito e nitrato. Estes dois metabolitos são sempre medidos separadamente. Existem vários métodos bem estabelecidos para determinar as suas concentrações em fluidos biológicos e tecidos. Aqui é apresentado um protocolo para o método de quimioluminescência (CL), com base na detecção espectrofotométrico de NO após nitrito ou nitrato de redução de tri-iodeto ou de vanádio (III) soluções de cloreto, respectivamente. A sensibilidade para nitrito e nitrato de detecção é em baixa gama nanomolar, que define CL como o método mais sensível disponível atualmente para determinar mudanças na NO vias metabólicas. Nós explicar em detalhe como preparar amostras de fluidos e tecidos biológicos, a fim de preservar valores originais de nitrito e nitrato presente no momento da coleta e como determinar os respectivos montantes em amostras. Limitações da técnica CL também são explained.

A Figura 2 mostra resultados representativos recolhidos a partir de padrões e cinco amostras diferentes. Como mostrado nesta figura, os aumentos de tensão fotomultiplicador imediatamente após nitrito contendo a solução (padrões ou amostras) é injectado na solução redutora (injecções de tempos estão indicados por setas vermelhas abaixo da curva) e regressa ao valor basal, uma vez todos os nitritos presentes no injectado solução foi reduzida. É também evide...

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Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

Medindo nitrito e nitrato, metabolitos na Óxido Nítrico Pathway, em materiais biológicos utilizando o método de quimioluminescência

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

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22.4K visualizações.  NIDDK, NIH. Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

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A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted mechanism of metabolic activation involves formation of &#945;-hydroxynitrosamines that spontaneously decompose to DNA alkylating agents. Accumulation of DNA damage and the resulting mutations can ultimately lead to cancer. New evidence indicates that &#945;-hydroxynitrosamines can be further oxidized to nitrosamides processively by cytochrome P450s. Because nitrosamides are generally more stable than &#945;-hydroxynitrosamines and can also alkylate DNA, nitrosamides may play a role in carcinogenesis. In this report, we describe a general protocol for evaluating nitrosamide production from in vitro cytochrome P450-catalyzed metabolism of nitrosamines. This protocol utilizes a general approach to the synthesis of the relevant nitrosamides and an in vitro cytochrome P450 metabolism assay using liquid chromatography-nanospray ionization-high resolution tandem mass spectrometry for detection. This method detected N&#8242;-nitrosonorcotinine as a minor metabolite of N&#8242;-nitrosonornicotine in the example study. The method has high sensitivity and selectively due to accurate mass detection. Application of this method to a wide variety of nitrosamine-cytochrome P450 systems will help determine the generality of this transformation. Because cytochrome P450s are polymorphic and vary in activity, a better understanding of nitrosamide formation could aid in individual cancer risk assessment.

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

&#945;-hydroxylation of carcinogenic nitrosamines by cytochrome P450s is the accepted metabolic pathway that produces DNA-damaging intermediates, which cause mutations. However, new data indicates further oxidation to nitrosamides can occur. We describe a general method for detecting nitrosamides produced from in vitro cytochrome P450-catalyzed metabolism of nitrosamines.

Um método geral para detectar a formação de Nitrosamide no metabolismo In Vitro de nitrosaminas por citocromo P450s

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted ...

Pesquisa do câncer

Procedures of Laboratory Fumigation for Pest Control with Nitric Oxide Gas

Nitric oxide (NO) is a newly discovered fumigant for postharvest pest control. This paper provides detailed protocols for conducting NO fumigation on fresh products and procedures for residue analysis and product quality evaluation. An airtight fumigation chamber containing fresh fruit and vegetables is first flushed with nitrogen (N2) to establish an ultralow oxygen (ULO) environment followed by injection of NO. The fumigation chamber is then kept at a low temperature of 2 - 5 &#176;C for a specified time period necessary to kill a target pest to complete a fumigation treatment. At the end of a fumigation treatment, the fumigation chamber is flushed with N2 to dilute NO prior to opening the chamber to ambient air to prevent the reaction between NO and O2, which produces NO2 and may damage delicate fresh products. At different times after NO fumigation, NO2 in headspace and nitrate and nitrite in liquid samples were measured as residues. Product quality was evaluated after 2 weeks of post-treatment cold storage to determine effects of NO fumigation on product quality. Keeping&#160;O2 from reacting with NO is critical to NO fumigation and is an important part of the protocols. Measuring NO levels is challenging and a practical solution is provided. Possible protocol modifications are also suggested for measuring NO levels in the fumigation chambers as well as residues. NO fumigation has the potential to be a practical alternative to methyl bromide fumigation for postharvest pest control on fresh and stored products. This publication is intended to assist other researchers in conducting NO fumigation research for postharvest pest control and accelerating the development of NO fumigation for practical applications.

This paper describes nitric oxide (NO) fumigation protocols for postharvest pest control. Fumigation chambers are flushed with nitrogen (N2) to establish ultralow oxygen conditions before NO is injected. At the end, chambers are flushed with N2 to dilute NO before exposing products to ambient air to prevent exposure to NO2.

Procedimentos de laboratório de fumigação para controle de pragas com gás de óxido nítrico

Nitric oxide (NO) is a newly discovered fumigant for postharvest pest control. This paper provides detailed protocols for conducting NO fumigation on ...

Ambiente

Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be considered one of the most important signaling molecules produced in our body, regulating essential functions including but not limited to regulation of blood pressure, immune response and neural communication. Therefore its accurate detection and quantification in biological matrices is critical to understanding the role of NO in health and disease. With such a short physiological half life of NO, alternative strategies for the detection of reaction products of NO biochemistry have been developed. The quantification of relevant NO metabolites in multiple biological compartments provides valuable information with regards to in vivo NO production, bioavailability and metabolism. Simply sampling a single compartment such as blood or plasma may not always provide an accurate assessment of whole body NO status, particularly in tissues. The ability to compare blood with select tissues in experimental animals will help bridge the gap between basic science and clinical medicine as far as diagnostic and prognostic utility of NO biomarkers in health and disease. Therefore, extrapolation of plasma or blood NO status to specific tissues of interest is no longer a valid approach. As a result, methods continue to be developed and validated which allow the detection and quantification of NO and NO-related products/metabolites in multiple compartments of experimental animals in vivo. The established paradigm of NO biochemistry from production by NO synthases to activation of soluble guanylyl cyclase (sGC) to eventual oxidation to nitrite (NO2-) and nitrate (NO3-) may only represent part of NO's effects in vivo. The interaction of NO and NO-derived metabolites with protein thiols, secondary amines, and metals to form S-nitrosothiols (RSNOs), N-nitrosamines (RNNOs), and nitrosyl-heme respectively represent cGMP-independent effects of NO and are likely just as important physiologically as activation of sGC by NO. A true understanding of NO in physiology is derived from in vivo experiments sampling multiple compartments simultaneously. Nitric oxide (NO) methodology is a complex and often confusing science and the focus of many debates and discussion concerning NO biochemistry. The elucidation of new mechanisms and signaling pathways involving NO hinges on our ability to specifically, selectively and sensitively detect and quantify NO and all relevant NO products and metabolites in complex biological matrices. Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of nitrite and nitrate by HPLC as well as detection of free NO in biological samples using in vitro ozone based chemiluminescence with chemical derivitazation to determine molecular source of NO as well as ex vivo with organ bath myography.

The endogenous production of nitric oxide (NO) regulates a wide variety of biological functions. It is becoming increasingly clear that disruption or dysregulation of NO based signaling is involved in many human diseases. Methods to quantify relevant NO metabolites may provide novel diagnostic or prognostic biomarkers for human disease.

Técnicas Analíticas para ensaiar Bioatividade Óxido Nítrico

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be ...

Medicina

Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH oxidase has critical signaling functions that modulate the inflammatory response 1. Thus, the development of a method to measure in "real-time" the kinetics of NADPH oxidase-derived ROS generation is expected to be a valuable research tool to understand mechanisms relevant to host defense, inflammation, and injury.
Chronic granulomatous disease (CGD) is an inherited disorder of the NADPH oxidase characterized by severe infections and excessive inflammation. Activation of the phagocyte NADPH oxidase requires translocation of its cytosolic subunits (p47phox, p67phox, and p40phox) and Rac to a membrane-bound flavocytochrome (composed of a gp91phox and p22phox heterodimer). Loss of function mutations in any of these NADPH oxidase components result in CGD. Similar to patients with CGD, gp91phox -deficient mice and p47phox-deficient mice have defective phagocyte NADPH oxidase activity and impaired host defense 2, 13. In addition to phagocytes, which contain the NADPH oxidase components described above, a variety of other cell types express different isoforms of NADPH oxidase.
Here, we describe a method to quantify ROS production in living mice and to delineate the contribution of NADPH oxidase to ROS generation in models of inflammation and injury. This method is based on ROS reacting with L-012 (an analogue of luminol) to emit luminescence that is recorded by a charge-coupled device (CCD). In the original description of the L-012 probe, L-012-dependent chemiluminescence was completely abolished by superoxide dismutase, indicating that the main ROS detected in this reaction was superoxide anion 14. Subsequent studies have shown that L-012 can detect other free radicals, including reactive nitrogen species 15, 16. Kielland et al. 16 showed that topical application of phorbol myristate acetate, a potent activator of NADPH oxidase, led to NADPH oxidase-dependent ROS generation that could be detected in mice using the luminescent probe L-012. In this model, they showed that L-012-dependent luminescence was abolished in p47phox-deficient mice.
We compared ROS generation in wildtype mice and NADPH oxidase-deficient p47phox-/- mice 2 in the following three models: 1) intratracheal administration of zymosan, a pro-inflammatory fungal cell wall-derived product that can activate NADPH oxidase; 2) cecal ligation and puncture (CLP), a model of intra-abdominal sepsis with secondary acute lung inflammation and injury; and 3) oral carbon tetrachloride (CCl4), a model of ROS-dependent hepatic injury. These models were specifically selected to evaluate NADPH oxidase-dependent ROS generation in the context of non-infectious inflammation, polymicrobial sepsis, and toxin-induced organ injury, respectively. Comparing bioluminescence in wildtype mice to p47phox-/- mice enables us to delineate the specific contribution of ROS generated by p47phox-containing NADPH oxidase to the bioluminescent signal in these models.
Bioluminescence imaging results that demonstrated increased ROS levels in wildtype mice compared to p47phox-/- mice indicated that NADPH oxidase is the major source of ROS generation in response to inflammatory stimuli. This method provides a minimally invasive approach for "real-time" monitoring of ROS generation during inflammation in vivo.

NADPH oxidase is the major source of reactive oxygen species (ROS) in phagocytes. Because of the ephemeral nature of ROS, it is difficult to measure and monitor ROS levels in living animals. A minimally invasive method for serial quantification of ROS in living mice is described.

Imagem de bioluminescência de NADPH oxidase em diferentes modelos animais

NADPH oxidase is a critical enzyme that mediates antibacterial and antifungal host defense. In addition to its role in antimicrobial host defense, NADPH ...

Imunologia e Infecção

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are quickly moving into the operating room. Here, we present a new approach that utilizes a technique not yet explored for intraoperative imaging: chemiluminescent imaging. This method employs a ruthenium-based chemiluminescent reporter along with a custom-built nebulizing system to produce ex vivo or in vivo images with high signal-to-noise ratios. The ruthenium-based reporter produces light following exposure to an aqueous oxidizing solution and re-reduction within the surrounding tissue. This method has allowed us to detect reporter concentrations as low as 6.9 pmol/cm2. In this work, we present a visual guide to our proof-of-concept in vivo studies involving subdermal and intravenous injections in mice. The results suggest that this technology is a promising candidate for further preclinical research and might ultimately become a useful tool in the operating room.

This protocol describes a new intraoperative imaging technique that uses a ruthenium complex as a source of chemiluminescent light emission, thereby producing high signal-to-noise ratios during in vivo imaging. Intraoperative imaging is an expanding field that could revolutionize the way that surgical procedures are performed.

Uma nova técnica para gerar e Observing Quimioluminescência em um ambiente Biológica

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are ...

Bioengenharia

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent vasoactive agents, nitric oxide (NO), can also act as a powerful inhibitor of platelet aggregation. Direct NO detection in blood is very challenging due to its high reactivity with cell-free hemoglobin that limits NO half-life to the millisecond range. Currently, NO changes after interventions are only estimated based on measured changes of nitrite and nitrate (members of the nitrate-nitrite-NO metabolic pathway). However precise, these measurements are rather difficult to interpret vis a vis actual NO changes, due to the naturally high baseline nitrite and nitrate levels that are several orders of magnitude higher than expected changes of NO itself. Therefore, the development of direct and simple methods that would allow one to detect NO directly is long overdue. This protocol addresses a potential use of platelets as a highly sensitive NO sensor in blood. It describes initial platelet rich plasma (PRP) and washed platelet preparations and the use of nitrite and deoxygenated red blood cells as NO generators. Phosphorylation of VASP at serine 239 (P-VASPSer239) is used to detect the presence of NO. The fact that VASP protein is highly expressed in platelets and that it is rapidly phosphorylated when NO is present leads to a unique opportunity to use this pathway to directly detect NO presence in blood.

Here, we present a protocol to address the potential use of platelets as a highly sensitive nitric oxide sensor in blood. It describes initial platelet preparation and the use of nitrite and deoxygenated red blood cells as nitric oxide generators.

Detecção baseada em plaquetas de óxido nítrico no sangue, medindo-se a fosforilação VASP

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

Face Detection En de óxido nítrico e superóxido na camada endotelial das artérias intactas

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Biologia

Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the effects of nitrosated compounds. Measuring NO metabolites is essential to studying NO activity both at vascular levels and in other tissues, especially in the experimental settings where exogenous NO is administered. Ozone-based chemiluminescence assays allow precise measurements of NO and NO metabolites in both fluids (including plasma, tissue homogenates, cell cultures) and gas mixtures (e.g., exhaled breath). NO reacts with ozone to generate nitrogen dioxide in an excited state. The consequent light emission allows photodetection and the generation of an electric signal reflecting the NO content of the sample. Aliquots from the same sample can be used to measure specific NO metabolites, such as nitrate, nitrite, S-nitrosothiols, and iron-nitrosyl complexes. In addition, NO consumed by cell-free hemoglobin is also quantified with chemiluminescence analysis. An illustration of all these techniques is provided.

Here, we present protocols for detecting nitric oxide and its biologically relevant derivatives using chemiluminescence-based assays with high sensitivity.

Ensaios baseados em chemiluminescência para detecção de óxido nítrico e seus derivados de Autoxidação e Compostos Nitrosated

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence of a large number of methods for detecting NO&#8226; in vivo and in vitro, the real-time monitoring of NO&#8226; at the single-cell level is very challenging. The physiological or pathological effects of NO&#8226; are determined by the actual concentration and dwell time of this radical. Accordingly, methods that allow the single-cell detection of NO&#8226; are highly desirable. Recently, we expanded the pallet of NO&#8226; indicators by introducing single fluorescent protein-based genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) that directly respond to cellular NO&#8226; fluctuations and, hence, addresses this need. Here we demonstrate the usage of geNOps to assess intracellular NO&#8226; signals in response to two different chemical NO&#8226;-liberating molecules. Our results also confirm that freshly prepared 3-(2-hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine (NOC-7) has a much higher potential to evoke change in intracellular NO&#8226; levels as compared with the inorganic NO&#8226; donor sodium nitroprusside (SNP). Furthermore, dual-color live-cell imaging using the green geNOps (G-geNOp) and the chemical Ca2+ indicator fura-2 was performed to visualize the tight regulation of Ca2+-dependent NO&#8226; formation in single endothelial cells. These representative experiments demonstrate that geNOps are suitable tools to investigate the real-time generation and degradation of single-cell NO&#8226; signals in diverse experimental setups.

This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) to monitor single cell NO&#8226; fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO&#8226; formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.

Aplicação de codificados geneticamente fluorescente óxido nítrico (NO •) Sondas, as geNOps, para imagens em tempo real de NO • Os sinais em células individuais

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions can be converted back to NO in mammals through a two-step reduction mechanism: nitrate being reduced to nitrite (NO2-) mostly by oral commensal bacteria, then nitrite being reduced to NO by several mechanisms including via heme- or molybdenum-containing proteins. This reductive nitrate pathway contributes to enhancing NO-mediated signaling pathways, particularly in the cardiovascular system and during muscular exercise. The levels of nitrate in the body before such utilization are determined by two different sources: endogenous NO oxidation and dietary nitrate intake, principally from plants. To elucidate the complex NO cycle in physiological circumstances, we have examined further the dynamics of its metabolites, nitrate and nitrite ions, which are relatively stable compared to NO. In previous studies skeletal muscle was identified as a major storage organ for nitrate ions in mammals, as well as a direct source of NO during exercise. Therefore, establishing a reliable methodology to measure nitrate and nitrite levels in skeletal muscle is important and should be helpful in extending its application to other tissue samples. This paper explains in detail the preparation of skeletal muscle samples, using three different homogenization methods, for nitrate and nitrite measurements and discusses important issues related to homogenization processes, including the size of the samples. Nitrate and nitrite concentrations have also been compared across four different muscle groups.

We present protocols for three different methods for the homogenization of four different muscle groups of rat skeletal muscle tissue to measure and compare the levels of nitrate and nitrite. Furthermore, we compare different sample weights to investigate whether tissue sample size affects the results of homogenization.

Preparação de Homogeneizados do Músculo Esquelético de Rato para Medições de Nitrato e Nitrito

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...