Gli autori vogliono riconoscere i contributi critici di Dr A. Dejam e MM Pelletier a sviluppare l&#39;uso di soluzione di nitrito di preservare per le misure di nitriti nel sangue.

Tutti i protocolli, tra cui l&#39;uso di animali sono stati approvati per l&#39;uso da NIDDK cura degli animali e del Comitato uso e sangue umano è stato ottenuto da banca del sangue NIH da donatori sani. Preparazione 1. Esempio <ol><li> Preparazione della soluzione di nitrito di conservazione <ol><li> Preparare una soluzione contenente 890 mM ferrocianuro di potassio (K 3 Fe (CN) 6) e 118 mM NEM (N-etilmaleimide) in acqua distillata. Sciogliere bene fino a quando è chiaro di colore giallo, senza cristalli presenti. Aggiungere NP-40 (ottil phenoxylpolyethoxylethanol) in un rapporto 1: 9 (v / v, NP-40 / soluzione). Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma e conservare a 4 ° C per circa una settimana). </li></ol></li><li> Raccolta e preparazione dei campioni di sangue <ol><li> Raccogliere il sangue utilizzando almeno un ago 20 G per evitare emolisi con eparina per prevenire la coagulazione (5 U / ml). Per il campione di sangue intero, mescolare il sangue con nitrito di conservazione immediatamente soluzione in un rapporto 1: 4 (v/ V / sangue). </li><li> Per i campioni di plasma e globuli rossi, centrifugare il sangue raccolto per 5 minuti a 4000 xga 4 ° C per separare i globuli rossi (RBC) e plasma. Prendere il surnatante (plasma) e mescolare con nitrito di preservare soluzione come sopra descritto per la determinazione dei livelli di nitriti nel plasma. </li><li> Rimuovere accuratamente plasma e buffy coat dal campione e pipetta RBC dal fondo del tubo rimanente per evitare la contaminazione da altri tipi di cellule del sangue utilizzando un puntale cut-off, e trasferirlo in una provetta contenente nitriti soluzione conservando nello stesso rapporto come sopra. </li><li> Mescolare ogni campione (plasma e RBC) con metanolo freddo ad un rapporto 1: 1 o 1: 2 (v / v campione / metanolo) e centrifugare a 13.000 xga 4 ° C per 15 minuti per precipitare le proteine. Prendere il surnatante e utilizzarlo per la misurazione nitriti o congelare campioni preparati, se necessario, il ghiaccio secco e conservare a -80 ° C. Nota: Nitrito rea rapidamenteCTS con ossiemoglobina (oxyHb) nel sangue formare nitrati. Poiché oxyHb è sempre presente in grande eccesso rispetto nitrito, questa reazione porta alla distruzione quasi completa del nitrito di sangue nativo con un arco di tempo di ~ 10 min. Per preservare la maggior parte endogena nitrito di sangue, soluzione di nitrito-conservazione viene aggiunto ai campioni di sangue intero immediatamente dopo il prelievo di sangue. La soluzione rapidamente lisare i globuli rossi e ossidare oxyHb in metaemoglobina (metHb), una forma inattiva di emoglobina che non reagisce chimicamente con nitriti. </li></ol></li><li> Preparazione dei campioni da altri tipi di fluido corporeo <ol><li> Dopo la raccolta del campione in apposito contenitore, mescolare bene con nitrito di preservare soluzione, deproteinate e misurare immediatamente o congelare e conservare a -80 ° C. </li></ol></li><li> Raccolta e preparazione dei campioni di tessuto <ol><li> Raccogliere tessuti provenienti da animali perfusi con soluzione fisiologica eparinizzata (10 U HEPArin / ml). Excise circa 1 g di tessuto desiderata e omogeneizzare sia utilizzando un omogeneizzatore manuale o automatizzato omogeneizzatore. </li><li> Aggiungere quantità nota di nitrito preservare soluzione come necessario per conseguire omogenato liscia. </li><li> Una volta che il tessuto è omogeneizzato, precipitare le proteine ​​usando metanolo freddo (1: 1 o 1: 2 rapporto v / v campione / metanolo) come sopra descritto, campioni quindi centrifugare a 13.000 xga 4 ° C per 15 min. </li><li> Raccogliere i livelli di nitriti surnatante e misura. Se necessario, congelarli a qualsiasi fase di preparazione in ghiaccio secco e conservare a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione di Riduzione Solutions <ol><li> Tri-ioduro (I 3) ridurre la soluzione per nitriti e R- (X) NESSUN specie determinazione 1,3,4 <ol><li> Preparare una soluzione di 301 mM KI insieme a 138 mm I 2 soluzione in acqua. Mescolare con acido acetico glaciale in rapporto 2: 7 (v / v / soluzione acida) su un agitatore magnetico per ~ 30 minuti fino a quando tutticristalli sono dissolti. Preferibilmente tenere in bottiglia scura, come ioduro è sensibile alla luce, ed utilizzare entro una settimana dalla preparazione. Nota: Questa soluzione consentirà di ridurre il nitrito in NO e sarà anche rilasciare NO da R-SNO, R-NNO e Fe-no gruppi funzionali (R- (X) -NO), ma il nitrato non sarà influenzata. Il segnale dai gruppi funzionali sopra NO-based può essere separato dal segnale vero nitriti mediante trattamento di metà del campione con sulfanilamide acidificato (AS) e confrontando AS-trattati e il segnale non trattato. Forme come irreversibilmente diazonio cazione con nitriti e questo complesso può essere ridotta I 3 soluzione. Per AS trattamento, preparare 290 soluzione mM di Sulfanilamide in 1 M HCl e aggiungerlo a una aliquota di campione in rapporto 1: 9 (v / v AS / campione). Misurare il segnale CL in parti AS-trattati e non trattati del campione. Calcolare il segnale vero nitriti come una differenza di parte AS-trattate e non trattate di campione. Il nitrito può essere misurato anche utilizzando un NIT selettivoRite-riducendo soluzione di miscela di acido ascorbico / acido acetico, come descritto nella parte 2.2. Tuttavia, a causa della piccola quantità di solito di R- (X) -NO specie presenti, misurazioni utilizzando campioni AS-trattati sono nella maggior parte dei casi una buona approssimazione del tenore totale di nitriti. </li></ol></li><li> Acido ascorbico / acido acetico soluzione (4A) per la determinazione selettiva di nitriti 2 <ol><li> Preparare 500 mm acido ascorbico in acqua. Mescolare questa soluzione con acido acetico glaciale in un rapporto 1: 7 (v / v, acido ascorbico / acido acetico) per preparare la miscela di reazione. Nota: Questa soluzione è specifica per il nitrito, non rilascerà NO da qualsiasi R- (X) NESSUN specie o nitrato. Tuttavia, la soluzione di ascorbico e acido acetico deve essere preparata estemporaneamente ogni giorno prima delle misurazioni, come acido ascorbico ossida facilmente in soluzione. Il completamento della riduzione nitriti dipende dalla concentrazione di acido ascorbico; e almeno 50 mM di acido ascorbico è raccomandato completa reduction di nitriti plasma. Tuttavia, si consiglia di eseguire alcuni esperimenti pilota con diverse concentrazioni di acido ascorbico e gli standard di nitriti nel range di concentrazione di nitriti previsto prima misurazioni campione finale. Tenere presente che l&#39;acido ascorbico esaurisce leggermente durante le misurazioni, sono raccomandati così frequenti cambi di miscela di reazione nella camera di reazione di vetro. </li></ol></li><li> Vanadio (III) riducendo soluzione di cloruro di determinazione nitrato 9 <ol><li> Preparare 51 mM soluzione di VCl 3 in 1 M HCl. soluzione filtro attraverso il filtro 200 micron e conservare in una bottiglia scura, utilizzare entro due settimane. Nota: Questa soluzione ridurrà nitrati, nitriti e tutti R- (X) -NO specie, quindi se quantità comparabili di nitriti o altro R- (X) -NO specie sono presenti insieme con nitrato, il contenuto finale nitrati deve essere calcolato come la differenza tra i segnali CL ottenuti con VCl 3 e3 riducendo soluzioni. </li></ol></li></ol> 3. chemiluminescenza (CL) Setup Analyzer e Misure <ol><li> Soluzione standard <ol><li> Preparare 1 mM soluzione di nitrito di sodio (nano 2). La stessa soluzione può essere utilizzata per nitriti e nitrati determinazioni. </li></ol></li><li> Utilizzando analizzatore Nota: Attualmente ci sono due disponibili in commercio NO analizzatori che sono abbastanza sensibili per finalità di ricerca biologica - Sievers NOA e Ecophysics CLD 88Y. Entrambi operano sullo stesso principio; la differenza principale è che CLD 88Y utilizza l&#39;ossigeno dall&#39;aria camera per rendere ozono (O 3), mentre NOA richiede un serbatoio di ossigeno esterna a questo scopo. La procedura che segue descrive il set up per il Sievers NOA. <ol><li> configurazione dello strumento <ol><li> Eseguire la configurazione iniziale del analizzatore secondo le raccomandazioni del fabbricantecome visto in Figura 1. </li><li> Aprire serbatoio O 2 collegato allo strumento. Scegliere &quot;analisi&quot; e &quot;inserire&quot; dal menu principale del pannello frontale. Nella schermata successiva scegliere &quot;start&quot; e premere &quot;invio&quot;. Collegare la trappola di acido (contenente 1 M NaOH) allo strumento come mostrato in Figura 1. </li><li> Attendere fotomoltiplicatore raffredda alla temperatura inferiore a -12 ° C e la camera di reazione viene evacuato a 6 Torr. Ci vogliono circa 30 minuti per raggiungere una linea di base piana e stabile. La linea di base deve stabilizzare entro 1 - 2 mV, il suo valore nominale è meno importante della sua stabilità. Nota: Se il nitrato è misurato, accendere il bagno di raffreddamento ad acqua (a 4 ° C, che serve trappola fredda per vapori acidi e acqua) e bagno di acqua di riscaldamento (camera di reazione principale, 95 ° C). Il tasso di riduzione dei nitrati in NO in VCl 3 soluzione dipende dalla temperatura, ed è molto lento a camera temperatura, è necessario in modo sostanziale aumento della temperatura per osservare la reazione. </li><li> Aprire il serbatoio Lui e collegare la camera di reazione di vetro per intrappolare acido come visto in Figura 1. Riempire la camera di reazione con soluzione riducente adeguata, ridurre il gorgogliare al minimo e connettersi camera di reazione alla trappola di acido. Utilizzando tentativi ed errori, regolare la velocità di ribollimento Egli per abbinare il tasso di aspirazione strumento (di solito ~ 200 ml / min per NOA di Siever). </li><li> Accendere il computer che controlla lo strumento e avviare il software Liquid Labview-based. Per attivare la comunicazione tra lo strumento e il software di acquisizione, premere &quot;Invio&quot; quando nel menu &quot;Dati&quot; fino a schermo si legge &quot;in uscita abilitato&quot;, quindi premere &quot;chiaro&quot; per tornare indietro alla schermata dei dati. </li><li> Attendere una traccia linea di base stabile sullo schermo e iniziare l&#39;iniezione di campioni e gli standard di nitrito in riducendo soluzione attraverso il setto. Attendere sempre per raggiungere una linea di base stabile a poppaer il picco. Questo può richiedere fino a 2 min. Il software Liquid ha un&#39;opzione per &quot;marcare&quot; i tempi di iniezione e annotare l&#39;iniezione e sarà esportare questi commenti in un file separato (filename.info) come un utile complemento per il file di dati (filename.data). </li><li> Una volta che i campioni e gli standard sono misurati, scegliere &quot;stop&quot; opzione nel menu del software Liquid - questo scriverà i dati da un file temporaneo in un file permanente conosciuto come &quot;filename.data&quot;. Premendo l&#39;opzione &quot;abortire&quot; terminerà la misurazione senza scrivere dati acquisiti in un file permanente. </li><li> Per terminare esperimento, scollegare la macchina dal recipiente di reazione spegnendo il rubinetto sulla parte superiore del recipiente di reazione e scollegare il tubo tra trap acidi e recipiente di reazione (vedere Figura 1). Ora smettere analizzatore NOA - premere &quot;chiaro&quot;, andare a &quot;analisi&quot;, mettere la macchina in &quot;stand-by&quot; e stand-by &quot;conferma&quot;. Se usato regolarmente, ilstrumento può essere lasciato in modalità stand-by per diverse settimane. Spegnere rifornimento di ossigeno. Poi lavare la soluzione riducendo dalla camera di reazione, scollegare e chiudere il serbatoio Egli dal recipiente di reazione di vetro e rifinire recipiente di reazione. </li></ol></li><li> Norme e iniezioni di esempio <ol><li> Iniettare 50 ml di soluzione di nitrito di 1 micron in miscela di reazione con una siringa Hamilton ben lavata. Attendere almeno 1 - 2 min tra le iniezioni per ottenere una buona separazione dei picchi. Ripetere l&#39;iniezione di 50 ml per ottenere i duplicati per ogni punto di dati. Lavare la siringa con acqua deionizzata dopo ogni iniezione. </li><li> Per acquisire una serie completa di dati per curva standard, continuare con iniezioni duplicate di 100, 150 ml (altri 200 ml potrebbero essere necessari se si prevedono elevate concentrazioni di nitriti e nitrati) di soluzione di nitrito di 1 micron. In ogni caso, aver cura di attendere che il segnale scende di nuovo alla linea di base e quindi acquisire 1 - 2 min di base per ottenere una buona separazione dei picchi. Nota: standard nitriti possono essere misurati in qualsiasi momento durante gli esperimenti. Tuttavia, è preferibile acquisire la curva standard prima della misurazione dei dati, in quanto serve anche come un controllo indipendente della funzionalità dello strumento. Quando i dati sono raccolti, quantità di campione iniettata dovrebbe portare a picchi ben pronunciate. Tuttavia va tenuto presente che il fotomoltiplicatore è lineare solo fino a ~ 800 mV, quindi nessuno del picco deve essere superiore a ~ 700 mV. Ciò può essere ottenuto sia diminuendo di campione quantità iniettata o diluendo il campione con acqua deionizzata. Ogni punto dovrebbe essere misurata almeno in doppio. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
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Dr. Alan Schechter è elencato come co-inventore diversi brevetti rilasciati il ​​National Institutes of Health per l&#39;uso di sali nitriti per il trattamento delle malattie cardiovascolari. Egli riceve royalties basate su NIH concessione di licenze di questi brevetti per lo sviluppo clinico, ma nessun altro compenso.

I passaggi critici all&#39;interno del protocollo Aliquote di tutte le soluzioni (tra cui l&#39;acqua) usate per preparare, diluire o altrimenti trattare campioni originali devono essere salvati e controllati per possibili nitriti o (più spesso) contaminazione da nitrati. Abbiamo trovato che la maggior contaminazione proviene da acqua e molti prodotti chimici usati per il trattamento di campioni (ferricianuro in particolare) contengono anche significativa quantità di contaminazione da nitrati...

Nitrito, e ad un nitrato meno estendere, i livelli nel sangue riflettono stato generale del corpo NO metabolismo. concentrazione dei nitriti nel sangue e la maggior parte degli organi e tessuti sono solo in alta nanomolari o gamma micromolare basso, il nitrato di solito è presente in quantità molto più elevate - nella gamma micromolare. I cambiamenti nei livelli di nitriti a causa di progressione della malattia o cambiamenti nelle abitudini alimentari sono piuttosto piccole e possono essere misurati solo con un metodo molto sensibile. A causa delle loro molto diversi livelli e diversi processi metabolici, la determinazione separata dei livelli di nitriti e nitrati è essenziale. La cosiddetta &quot;NO determinazione x&quot; dove nitriti e nitrati siano misurate insieme ha ben poco valore. Diversi metodi per quantificare nitriti in vari campioni biologici sono stati sviluppati - il più comune è il più antico, basato sulla reazione di Griess che era stato originariamente descritto in 1879. Anche con modificatio modernans, il limite di sensibilità per i nitriti ottenibile con il metodo di Griess &#39;è nella gamma micromolare bassa. Chemiluminescenza (CL), in combinazione con tri-ioduro riducendo soluzione, è attualmente considerato il metodo più sensibile, che consente la quantificazione in gamma bassa nanomolari della concentrazione di nitriti 1-8,10,11. Lo stesso metodo CL, combinato con vanadio (III) cloruro di riduzione soluzione, può essere utilizzato per misurazioni sensibili di nitrato, con precisione nell&#39;intervallo nanomolare 9. CL rileva libera gas NO. Pertanto, nitriti, nitrati, R-nitrosothiols (R-SNO), R-nitrosamine (R-NNO), o composti metallo-NO (più tardi nel manoscritto di cui come &quot;R- (X) -NO&quot;), deve essere convertito in liberare gas NO al fine di quantificare il loro valore originale via CL. La conversione in NO viene effettuata mediante diverse soluzioni riducenti diversi, a seconda della natura del NO metabolita. Dopo la conversione, libera gas NO viene estratta dal recipiente di reazione da un gas carrier (He, N2 o Ar) nella camera di reazione di CL analizzatore cui l&#39;ozono (O 3) è combinato con NO per formare biossido di azoto (NO 2) nel suo stato attivato. Con il ritorno allo stato fondamentale, NO 2 * emette nella regione infrarossa e fotone emesso viene rilevato da fotomoltiplicatore (PMT) dello strumento CL. L&#39;intensità della luce emessa è direttamente proporzionale alla concentrazione di NO in camera di reazione, che permette di calcolare la concentrazione della specie originali usando curve di taratura adeguate. Nel nostro protocollo, in primo luogo abbiamo presente determinazione CL a base di nitriti e nitrati nelle situazioni cliniche più utilizzate - nel sangue e di plasma, e poi discutiamo come determinare questi ioni in campioni di tessuto. Spiegheremo anche nel dettaglio come preservare la concentrazione di nitrito fisiologica originale in ambienti nitriti reattivo, come il sangue e suoi scomparti, plasma e globuli rossi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:351px;">potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">702587</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEM; N-ethylmaleimide</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td>4260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sulfanilamide; AS&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td>S9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HCl</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">acetic acid, glacial</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ascorbic acid&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">potassium iodide; KI</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">60399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">iodine; I2</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">207772</td>
			<td>light sensitive, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">sodium nitrite; NaNO2</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td>563218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">vanadium(III) chloride; VCl3</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">208272</td>
			<td>ligt sensitive, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GentleMac</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sievers NOA 280i</td>
			<td style="width:135px;">GE</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CLD 88Y</td>
			<td style="width:135px;">&#160;Ecophysics&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring nitrite and nitrate, metabolites in the nitric oxide pathway, in biological materials using the chemiluminescence method

L&#39;ossido nitrico (NO) è una delle principali molecole regolatore dell&#39;omeostasi vascolare e anche un neurotrasmettitore. Enzimatica prodotta NO viene ossidato in nitriti e nitrati dalle interazioni con diverse proteine ​​ossi-eme e altri percorsi ancora poco conosciuti. Il processo inverso, la riduzione dei nitriti e nitrati in NO era stato scoperto nei mammiferi negli ultimi dieci anni ed è guadagnando attenzione come uno dei possibili percorsi per sia prevenire o alleviare una vasta gamma di malattie cardiovascolari, malattie metaboliche e muscolari che si pensa essere associato con diminuzione dei livelli di NO. È quindi importante valutare la quantità di NO e suoi metaboliti in differenti compartimenti corporei - sangue, fluidi corporei e vari tessuti. Sangue, grazie alla sua facile accessibilità, è il vano preferito utilizzato per la stima dei metaboliti. A causa della sua breve vita (pochi millisecondi) e bassa concentrazione di sub-nanomolari, misurazioni affidabili dirette di sangue NO &lt;em&gt; in vivo presentano grandi difficoltà tecniche. Così NO disponibilità è solitamente stimato in base alla quantità dei suoi prodotti di ossidazione, nitriti e nitrati. Questi due metaboliti vengono sempre misurati separatamente. Ci sono diversi metodi ben stabiliti per determinare le loro concentrazioni nei fluidi e nei tessuti biologici. Qui vi presentiamo un protocollo per il metodo chemiluminescenza (CL), in base alla rilevazione spettrofotometrica di NO dopo nitriti o nitrati riduzione di (III) soluzioni di cloruro rispettivamente tri-ioduro o vanadio,. La sensibilità per nitriti e nitrati rilevamento è in gamma bassa nanomolari, che stabilisce CL come il metodo più sensibile attualmente disponibile per determinare le variazioni di NO vie metaboliche. Vi spieghiamo in dettaglio come preparare campioni di fluidi e tessuti biologici al fine di preservare quantità originali di nitriti e nitrati presenti al momento della raccolta e su come determinare le loro rispettive quantità nei campioni. Limitazioni della tecnica CL sono anche explained.

La figura 2 mostra i risultati rappresentativi raccolti da standard e cinque campioni diversi. Come mostrato in questa figura, tensione aumenta fotomoltiplicatore immediatamente dopo nitrito contenenti soluzione (standard o campioni) viene iniettato riducendo soluzione (iniezioni volte sono indicati da frecce rosse sotto la curva) e ritorna al valore basale volta tutte nitriti presenti nella iniettato soluzione è stata ridotta. È anche chiaro da questa figura che sono ...

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Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

Misurazione nitriti e nitrati, metaboliti in ossido nitrico Pathway, nei materiali biologici utilizzando il metodo chemiluminescenza

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

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22.4K Views.  NIDDK, NIH. Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

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Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purificazione della M. magneticum Strain AMB-1 proteina Magnetosome Associated MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

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Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Rapida rilevazione omogenea dei saggi biologici Utilizzando Magnetic biopercezione sistema di modulazione

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

Misura Caenorhabditis elegans Life Span in 96 piastre per microtitolazione Bene

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

Rilevamento di ossido nitrico e anione superossido radicale da spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica da cellule con Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Misurare il osmotica dell&#39;acqua Permeabilità Coefficiente (P<sub&gt; F</sub&gt;) Di celle sferiche: protoplasti impianto isolato come un esempio

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

En Face Detection di ossido nitrico e superossido in strato endoteliale delle arterie Intact

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Imaging Riorganizzazione spaziale di una via di segnalazione MAPK Utilizzando il sistema transitorio Expression Tabacco

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Ad alta risoluzione Time-lapse imaging e analisi automatizzata dei microtubuli Dynamics in Living ombelicale umano cellule endoteliali Vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

L&#39;isolamento di filtrazione di acidi nucleici: DNA metodo di estrazione semplice e veloce

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...