O músculo esquelético serve como um importante reservatório de nitrato que, após sua conversão em nitrito, serve como fonte de NO durante o exercício. Aqui apresentamos metodologia para medir esses íons no músculo e outros tecidos. Para começar, prepare a solução de preservação ou parada de nitrato combinando 890 milimolares de ferricianeto de potássio e 118 milimolares de n-metilmaleimida em água destilada, garantindo que nenhum cristal permaneça em solução, em seguida, adicione um surfactante não iônico em uma proporção de 1 para 9 e misture suavemente para evitar a formação de espuma.
Diluir a solução de paragem numa proporção de 1 para 9 com água destilada e adicionar a solução de paragem diluída ao tubo de homogeneização. Em seguida, descongele o tecido muscular de rato isolado e congelado anterior no gelo. Uma vez que o tecido tenha descongelado, remova a gordura restante e o tecido conjuntivo do músculo esquelético.
Corte pedaços do músculo esquelético e seque-os em uma gaze para secar. Pesar a quantidade apropriada de tecido muscular esquelético e, em seguida, colocar o tecido pré-pesado nos tubos de homogeneização que contêm a solução de parada. Para homogeneização em um homogeneizador rotativo, coloque na máquina o tubo do tipo M contendo o músculo esquelético pré-pesado e a solução de parada pré-medida.
Homogeneizar cada amostra duas vezes e, após cada homogeneização, colocar o tubo no gelo imediatamente durante 5 minutos para arrefecer. Após a homogeneização, centrifugar o tubo brevemente. Coloque o tubo de volta no gelo e adicione o volume apropriado de metanol antes de vórtice por 15 segundos.
Homogeneizar a amostra novamente e incubá-la no gelo por 30 minutos, em seguida, centrifugar a amostra, aspirar o sobrenadante e proceder à medição dos níveis de nitrito e nitrato. Para homogeneização do talão, coloque o tecido muscular esquelético em um tubo contendo contas e homogeneize duas vezes por 45 segundos na velocidade mais alta disponível no instrumento. Após cada homogeneização, coloque imediatamente o tubo no gelo por 5 minutos para esfriar, em seguida, centrifugar o tubo, coloque o tubo de volta no gelo e adicione o volume apropriado de metanol antes de vórtice por 15 segundos.
Homogeneizar a amostra mais uma vez por 45 segundos e incubá-la no gelo por 30 minutos. Centrifugar a amostra, aspirar o sobrenadante e proceder à medição dos níveis de nitrito e nitrato. Para homogeneização à base de pulverizador, prepare tubos contendo a solução de parada diluída e, em seguida, pese e registre o peso dos tubos.
Depois de resfriar a ferramenta do pulverizador em gelo seco por 30 minutos, usando pinças resfriadas em nitrogênio líquido, transfira a amostra de tecido pré-pesada para o pulverizador e, em seguida, adicione uma pequena quantidade de nitrogênio líquido para garantir que o tecido esteja à temperatura do nitrogênio líquido. Depois que 95% do nitrogênio líquido tiver vaporizado, coloque a ferramenta de esmagamento em cima do tecido e pressione firmemente para sentir o esmagamento da amostra, em seguida, usando um martelo, bata na ferramenta de esmagamento 3 a 5 vezes. Quando toda a amostra tiver sido pulverizada, utilizando uma colher e uma pinça resfriadas com azoto líquido, transfira directamente o tecido triturado para o tubo pré-pesado que contém a solução de paragem diluída.
Em seguida, vortex o tubo por 15 segundos e, em seguida, abra o tubo para verificar se há algum tecido preso na tampa. Se houver, tente desalojá-lo, então vórtice novamente. Centrifugar brevemente a amostra durante 2 a 3 segundos.
Pese o tubo novamente e calcule o peso do tecido deduzindo o peso original do tubo desse novo peso. Coloque o tubo no gelo. Adicionar um volume apropriado de metanol ao tubo e desvitrificar o tubo completamente por 15 segundos antes de incubá-lo no gelo por 30 minutos, depois centrifugar a amostra, aspirar o sobrenadante e proceder à medição dos níveis de nitrito e nitrato.
Os níveis de nitrato e homogeneizados do músculo esquelético de ratos preparados usando um homogeneizador rotativo, homogeneizador de contas e pulverizador foram semelhantes. Curiosamente, para os níveis de nitrito, a amostra homogeneizada preparada por um pulverizador apresentou o maior valor, que foi estatisticamente diferente dos outros dois valores amostrais. Uma comparação dos níveis de nitrito e nitrato em homogeneizados glúteos preparados a partir de 20, 50 e 200 miligramas de tecido usando um homogeneizador de contas mostrou que nem os níveis de nitrato nem nitrito foram significativamente diferentes entre os tamanhos das amostras musculares.
A comparação dos níveis de nitrato em diferentes tecidos musculares esqueléticos da perna de roedores revelou que o músculo glúteo tinha níveis de nitrato aproximadamente duas vezes maiores do que os outros três tecidos musculares. No entanto, essas diferenças não alcançaram significância estatística. Semelhante aos níveis de nitrato, a concentração de nitrato no músculo glúteo também foi maior do que na dos outros três tecidos musculares e foi significativamente maior do que a da amostra de gastrocnêmio.
Nosso método é relativamente simples e adequado para pequenas amostras, preservando nitrato e nitrito durante a preparação da amostra.
