Yazarlar kanda nitrit ölçümleri için nitrit koruyarak çözeltisinin kullanımı gelişmekte olan Dr. A. Dejam ve MM Pelletier kritik katkıları kabul etmek istiyorum.

Hayvanların kullanımını dahil olmak üzere tüm protokoller NIDDK Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından kullanılmak üzere onaylanmış ve insan kan sağlıklı donörlerden NIH Kan bankasından elde edilmiştir. 1. Numune Hazırlama <ol><li> Nitrit koruyucu çözeltisinin hazırlanması <ol><li> 890 mM potasyum ferrisiyanür ihtiva eden bir çözelti hazırlayın (K3Fe (CN) 6) ve damıtılmış su içinde 118 mM NEM (N-etilmaleimit). mevcut hiçbir kristalleri ile sarı netleşene kadar iyi çözülür. 9 oranı (h / h, NP-40 / çözelti) bir 1: NP-40 (oktil phenoxylpolyethoxylethanol) ekleyin. ) Yaklaşık bir hafta boyunca 4 ° C&#39;de köpürme ve mağaza önlemek için yavaşça karıştırın. </li></ol></li><li> Toplama ve kan örneklerinin hazırlanması <ol><li> pıhtılaşmayı (5 U / ml) önlemek için heparin ile hemoliz önlemek için en azından bir 20 G iğne kullanılarak kan toplayın. (4 oranında v: Tam kan örneği için, nitrit 1 hemen çözüm koruyarak ile kan mix/ Hac çözeltisi / kan). </li><li> plazma ve kırmızı kan hücreleri numuneler için, santrifüj, 4 ° C&#39;de 4000 x g&#39;de 5 dakika boyunca alınan kan, kırmızı kan hücrelerinin (RBC) ve plazma ayrılır. Süpernatant (plazma) almak ve plazma nitrit düzeylerinin belirlenmesi için, yukarıda tarif edildiği gibi nitrit çözeltisi korunması ile karıştırın. </li><li> Dikkatli bir kesme pipet kullanarak kan hücrelerinin diğer türlerine göre kirlenmesini önlemek için borunun alt numune ve pipet eritrosit numunesinden plazmanın ve buffy coat kalan kaldırmak ve aynı nitrit koruyucu çözeltisi içeren bir tüp içine transfer yukarıdaki gibi oranı. </li><li> 1 ya da 1: oranında 1 soğuk metanol ile her bir örnek (plazma ve RBC) karıştırın 2 (h / h örneği / metanol) ve proteinleri çökeltmek için 15 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 13,000 x g&#39;de santrifüj. -80 ° C&#39;de kuru buz ve mağaza, gerekirse, süpernatant atın ve nitrit ölçümü için kullanmak ya da hazırlanmış örnekleri dondurma. Not: Nitrit hızla reakan yapıcı nitrat oksihemoglobin (oxyHb) ile cts. oxyHb her nitrit üzerinde daha büyük miktarda mevcut olduğu için, bu reaksiyon, 10 dakika aralığında bir süre ile ana kan nitrit neredeyse tamamen yok olmasına yol açar. endojen kan nitrit en korumak amacıyla, nitrit koruyucu çözelti hemen kan alımından sonra tam kan numuneleri ilave edilir. Çözelti hızla kimyasal nitrit ile reaksiyona girmeyen hemoglobin etkin olmayan bir biçimi, kırmızı kan hücrelerinin lize edildi ve methemoglobin (metHb) içine oxyHb okside olur. </li></ol></li><li> Diğer türlü vücut sıvısı örneklerinin hazırlanması <ol><li> Uygun bir kap içine numune toplama sonra, nitrit koruyarak çözüm, deproteinate ile iyice karıştırın ve hemen ölçmek veya -80 ° C&#39;de dondurulması ve depolanması. </li></ol></li><li> Toplama ve doku örneklerinin hazırlanması <ol><li> heparinize tuzlu su çözeltisi (10 U HEPA ile perfüze hayvanlardan dokuları toplayınrin / ml). istenen dokuya tüketim 1 g homojen ya elle homojenleştirici veya otomatik homojenleştirici kullanılarak. </li><li> düz Homojenat elde etmek için gerektiği kadar çözelti koruyucu nitrit bilinen miktarda ekleyin. </li><li> 15 dakika boyunca 4 ° C &#39;de yukarıda tarif edildiği gibi (2 oranı hacim / hacim Örnek / metanol: 1 ya da 1: 1), 13000 x g hızında daha sonra santrifüj örnekleri dokusu homojenize sonra soğuk metanol kullanılarak proteinlerin çökeltilmesi. </li><li> süpernatant ve tedbir nitrit seviyelerini toplayın. Gerekirse, -80 ° C&#39;de kuru buz ve mağaza hazırlık herhangi bir aşamasında örnekleri dondurma. </li></ol></li></ol> Çözümler Azaltma 2. Hazırlık <ol><li> Tri-iyodür (I 3) nitrit ve R (x) = NO türlerinin tespiti 1,3,4 çözüm indirgeme <ol><li> Su içinde 138 mM I 2 çözeltisi ile birlikte 301 mM KI bir çözelti hazırlayın. Tüm kadar ~ 30 dakika için bir manyetik karıştırıcı üzerinde 7 oranında (hacim / hacim çözeltisi / asit): 2, buzlu asetik asit ile karıştırınKristaller eritilir. Tercihen iyodür ışığa duyarlı olarak, karanlık şişe tutmak ve hazırlık itibaren bir hafta içinde kullanın. Not: Bu çözüm NO içine Nitrit azaltacak ve aynı zamanda R-SNO, R-nHayır ve Fe-NO fonksiyonel gruplar (R (X) = NO) NO yayınlayacak, ancak nitrat etkilenmeyecektir. Yukarıdaki NO bazlı fonksiyonel grup sinyal asitleştirilmiş sülfanilamid (AS) ve AS-muamele karşılaştırılması ve işlenmemiş sinyal ile numunenin yarısının işlenerek gerçek nitrit sinyalinden ayrılabilir. Geri dönülmez bir şekilde nitrit ile diazonyum katyonu oluşturan ve bu kompleks bir 3 çözeltisi ile indirgenemez. AS tedavisi için, 1 M HCl in sülfanilamid 290 mM&#39;lik çözelti hazırlayın ve 1 oranında örneğinin bir bölümüne ekleyin: 9 (h / h AS / numune). örnek AS-tedavi edilen ve edilmeyen bölgelerinde CL sinyali ölçer. örnek AS-tedavi edilen ve edilmeyen kısmının bir fark olarak, gerçek nitrit sinyali hesaplayın. Nitrit, aynı zamanda, seçici bir NIT kullanılarak ölçülebilirayin indirgeyici parça 2.2 de tarif edildiği gibi, askorbik / asetik asit karışımı çözeltisi. Bununla birlikte, -NO tür mevcut R- (X) genellikle az miktarda AS işlenmemiş numuneler kullanılarak ölçümler toplam nitrit çok iyi bir yaklaşım çoğu durumda bağlı. </li></ol></li><li> Nitrit 2 seçici belirlenmesi için askorbik asit / asetik asit (4A) çözeltisi <ol><li> su içinde 500 mM askorbik asit hazırlayın. Reaksiyon karışımı hazırlamak için 7 (h / h, askorbik asit / asetik asit): bir oranda 1 buzlu asetik asit ile çözelti karıştırın. Not: Bu çözelti, nitrit için spesifik olan, herhangi bir R (x) = NO türlerinin ya da nitrat NO bırakmayacaktır. askorbik asit, kolay bir çözelti içinde okside Ancak, askorbik ve asetik asit solüsyonu, her gün ölçümleri yapılmadan önce taze olarak hazırlanmalıdır. nitrit azaltma tamamlanması askorbik asit konsantrasyonuna bağlıdır; ve en az 50 mm askorbik asit, tam bir R önerilirPlazma nitrit eduction. Bununla birlikte, önceki son örnek ölçümleri beklenen nitrit konsantrasyon aralığında, askorbik asit ve nitrit standartları farklı konsantrasyonları ile birkaç pilot deneyleri için tavsiye edilir. askorbik asit biraz ölçümler sırasında tüketir unutmayın, cam reaksiyon odasındaki reaksiyon karışımının çok sık değişiklikler tavsiye edilir. </li></ol></li><li> Nitrat belirlenmesi 9 Vanadyum (III) klorid indirgeme çözeltisi <ol><li> 1 M HCl içinde VCL 3 51 mM çözeltisi hazırlayın. Karanlık bir şişe 200 mikron filtre ve mağaza üzerinden filtre çözümü, iki hafta içinde kullanın. Not: Bu çözüm nitrat, nitrit ve tüm R (X) = NO türleri azaltacaktır, böylece hesaplanacak nitrit veya diğer R- kıyaslanabilir miktarda (X) = NO türlerinin beraberce nitrat ile mevcut, son nitrat içeriği varsa vcl 3 ve I elde edilen CL sinyalleri arasındaki fark olarak3 çözüm azaltır. </li></ol></li></ol> 3. Kemilüminesans (CL) Çözümleyici Kurulumu ve Ölçümler <ol><li> Standart çözüm <ol><li> Sodyum nitrit 1 mcM çözeltisi (NaNO 2) hazırlayın. Aynı çözelti, nitrit ve nitrat belirlemeleri için kullanılabilir. </li></ol></li><li> YOK analizörü kullanarak Not: Şu anda biyolojik araştırma amaçlı yeterince duyarlı iki piyasada mevcut hiçbir analiz vardır - Sievers NOA ve Ecophysics CLD 88Y. Her ikisi de aynı prensiple çalışır; Temel fark, CLD 88Y ozon yapmak için oda havadan oksijen kullanır (O 3), NOA, bu amaç için bir dış oksijen tankı gerektiren ise. Aşağıdaki prosedür Sievers NOA için setini açıklar. <ol><li> enstrüman kurulum <ol><li> üretici tavsiyelerine göre YOK analizör ilk kurulum gerçekleştirinolarak Şekil 1&#39;de görülen. </li><li> Cihaza bağlı Açık O 2 tankı. &quot;Analizi&quot; seçin ve ön paneldeki ana menüden &quot;enter&quot;. Bir sonraki ekranda seçim &quot;start&quot; basın &quot;girin.&quot; Şekil 1 &#39;de görüldüğü gibi, cihaza (1 M NaOH içeren) asit tuzak bağlayın. </li><li> photomultiplier -12 ° C&#39;nin altında sıcaklığa soğur ve reaksiyon haznesi 6 Torr tahliye kadar bekleyin. Istikrarlı bir düz taban çizgisini ulaşmak için yaklaşık 30 dakika sürer. Bazal 1 içinde stabilize ihtiyacı - 2 mV, nominal değeri istikrarı daha az önemlidir. Not: nitrat ölçülür, soğutma (asit ve su buharları gibi soğuk tuzak hizmet veren 4 ° C&#39;de set) su banyosu ve ısıtma suyu banyosu (ana reaksiyon haznesi, 95 ° C) açın. Vcl 3 çözeltide içine nitrat indirgeme oranı sıcaklığa bağlıdır ve bu oda Tempe çok yavaşrature, sıcaklık bu nedenle önemli bir artış reaksiyon gözlemlemek için gereklidir. </li><li> O tankı açın ve Şekil 1&#39;de görüldüğü gibi asit tuzak cam reaksiyon odasına bağlayın. Uygun indirgeme çözeltisi ile reaksiyon haznesine doldurmak minimuma kabarcık oluşumunu azaltmak ve asit yakalamak için, reaksiyon odası bağlayın. deneme ve yanılma yöntemiyle, enstrüman emme oranı (Siever en NOA için genellikle ~ 200 ml / dk) eşleşecek O köpürme oranını ayarlayın. </li><li> Cihazı kontrol Bilgisayarı açın ve Labview tabanlı sıvı yazılımını başlatın. alet ve satın alma yazılımı, basın arasındaki iletişim açmak için ekran okuyana kadar &quot;veri menüsünden&quot; in &quot;çıkış aktif&quot;, o zaman &quot;net&quot; tuşuna veri ekranına geri dönmek için &quot;enter&quot;. </li><li> Ekranda istikrarlı bir temel iz bekleyin ve septum yoluyla çözüm azaltarak içine örnekleri ve nitrit standartlarını enjekte başlar. Her zaman istikrarlı bir temel kıç ulaşmak için sabırsızlanıyorumzirveye er. Bu 2 dakika kadar sürebilir. Sıvı yazılım enjeksiyon bir seçenek için &quot;işareti&quot; kat vardır ve enjeksiyon açıklama ve veri dosyası (filename.data) için yararlı bir tamamlayıcısı olarak ayrı bir dosya (filename.info) içine bu yorumları ihraç edecek. </li><li> Numuneler ve standartlar ölçülür kez, seçim Sıvı yazılım menüsünde &quot;dur&quot; - bu &quot;filename.data&quot; olarak bilinen kalıcı bir dosyaya geçici bir dosyaya veri yazar. Basmak &quot;iptal&quot; seçeneği kalıcı dosyaya edinilen verileri yazmadan ölçüm sonlanacaktır. </li><li> Deney sona reaksiyon kabının üzerine musluğunu kapatarak reaksiyon kabından makine kesin ve asit tutucu ve reaksiyon kabı arasındaki boru bağlantısını kesmek için (Şekil 1 e bakınız). Şimdi NOA analizörü durdurmak - Basın &quot;net&quot;, &quot;bekleme&quot; ve &quot;onayla&quot; bekleme makineyi koymak &quot;analiz&quot;, gidin. Düzenli olarak kullanıldığındaenstrüman birkaç hafta bekleme modunda kalabilir. oksijen kaynağını kapatın. Daha sonra reaksiyon haznesi, kesmek gelen azaltılması çözüm yıkayın ve cam reaksiyon kabından O tankı kapatın ve reaksiyon kabı temizliği bitirmek. </li></ol></li><li> Standartlar ve örnek enjeksiyonları <ol><li> iyi yıkandı, Hamilton şırıngası kullanarak reaksiyon karışımı içerisindeki 1 uM nitrit çözeltisinin 50 ul enjekte edilir. piklerin iyi bir şekilde ayrılmasını sağlamak için enjeksiyonlar arasında 2 dakika - en az 1 bekleyin. 50 ul enjeksiyon tekrarlayın her bir veri noktasına kopyalarını elde etmek. Her enjeksiyondan sonra, iyonu giderilmiş su ile şırınga yıkayın. </li><li> 1 uM nitrit çözeltisi 100, 150 ul yinelenen enjeksiyonları ile devam standart eğri için veri tam set elde etmek için (nitrit veya nitrat yüksek konsantrasyonlarda bekleniyor, ek 200 ul gerektirir). Her durumda, sinyal başlangıca geri düşene kadar beklemek özen ve sonra 1 kazanmak - 2 milBaşlangıçta n zirvelerinden iyi ayrılmasını sağlamak için. Not: Nitrit standartları deneyler sırasında herhangi bir zamanda ölçülebilir. Ayrıca, gösterge işlevselliği bağımsız bir kontrol olarak hizmet eder Ancak, veri ölçümü önce standart bir eğri elde etmek için tercih edilir. verilerin toplandığı zaman, numune miktarı iyi telaffuz zirveleri gitmelidir enjekte edilir. Ancak photomultiplier, sadece ~ 800 mV kadar doğrusal olduğu akılda tutulmalıdır böylece zirve hiçbiri ~ 700 mV daha yüksek olmalıdır. Bu miktar enjekte numunenin azaltılması ya da deiyonize su ile örnek seyreltilmesi yoluyla elde edilebilir. Her bir nokta iki kez, en azından ölçülmelidir. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Piknova, B., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Nitrite+in+Blood+Samples+Using+the+Ferricyanide-Based+Hemoglobin+Oxidation+Assay.">Measurement of Nitrite in Blood Samples Using the Ferricyanide-Based Hemoglobin Oxidation Assay.</a> Methods Mol Biol. 704, 39-56 (2011).</li><li>Nagababu, E., Rifkind, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+plasma+nitrite+by+chemiluminescence+without+interference+of+S-,+N-nitroso+and+nitrated+species.">Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species.</a> Free Radic Biol Med. 42, 1146-1154 (2007).</li><li>Pinder, A. G., Rogers, S. C., Khalatbari, A., Ingram, T. E., James, P. E., Hancock, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+of+nitric+oxide+and+its+metabolites+in+biological+samples+by+ozone-based+chemiluminescence.">The measurement of nitric oxide and its metabolites in biological samples by ozone-based chemiluminescence.</a> Methods in Molecular Biology, Redox-Mediated Signal Transduction. 476, 11-28 (2008).</li><li>Pelletier, M. M., Kleinbongard, P., Ring-wood, L., Hito, R., Hunter, C. J., Schechter, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+of+blood+and+plasma+nitrite+by+chemiluminescence:+pitfalls+and+solutions.">The measurement of blood and plasma nitrite by chemiluminescence: pitfalls and solutions.</a> Free Radic Biol Med. 41, 541-548 (2006).</li><li>Mac Arthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+circulating+nitrite+and+S-nitrosothiols+by+reductive+chemiluminescence.">Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence.</a> J Chromatogr B. 851, 93-105 (2007).</li><li>Bryan, N. S., Grisham, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+detect+nitric+oxide+and+its+metabolites+in+biological+samples.">Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples.</a> Free Radic Biol Med. 43, 645-657 (2007).</li><li>Hendgen-Cotta, U., Grau, M., Rasaaf, T., Gharinin, P., Kelm, M., Kleinbongard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductive+gas-phase+chemiluminescence+and+flow+injection+analysis+for+measurement+of+nitric+oxide+pool+in+biological+matrices.">Reductive gas-phase chemiluminescence and flow injection analysis for measurement of nitric oxide pool in biological matrices.</a> Method Enzymol. 441, 295-315 (2008).</li><li>Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+for+the+sensitive+and+specific+measurement+of+S-nitrosothiols,+iron-nitrosyls+and+Nitrite+in+biological+samples.">Methodologies for the sensitive and specific measurement of S-nitrosothiols, iron-nitrosyls and Nitrite in biological samples.</a> Free Radic Res. 37, 1-10 (2003).</li><li>Sm&#225;rason, A. K. 1., Allman, K. G., Young, D., Redman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+serum+nitrate,+a+stable+end+product+of+nitric+oxide,+in+women+with+pre-eclampsia.">Elevated levels of serum nitrate, a stable end product of nitric oxide, in women with pre-eclampsia.</a> Br J Obstet Gynaecol. 104 (5), 538-543 (1997).</li><li>Beckman, J. S., Congert, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Measurement+of+Dilute+Nitric+Oxide+in+Solution+with+an+Ozone+Chemiluminescent+Detector.">Direct Measurement of Dilute Nitric Oxide in Solution with an Ozone Chemiluminescent Detector.</a> Methods: A companion to Methods in Enzymology. 7, 35-39 (1995).</li><li>Bates, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+measurements+by+chemiluminescence+detection.">Nitric oxide measurements by chemiluminescence detection.</a> Neuroprotocols: A companion to Methods in Neuroscience. 1, 141-149 (1992).</li></ol>

Dr Alan Schechter kardiyovasküler hastalıkların tedavisi için nitrit tuzlarının kullanılması Ulusal Sağlık Enstitüleri verilen çeşitli patentler ortak mucidi olarak listelenir. O klinik gelişim ama başka tazminat Bu patentlerin NIH lisans dayalı telif alır.

Protokol çerçevesinde kritik adımlar orijinal numune hazırlanması, seyreltik ya da tedavi etmek için kullanılabilir (su dahil) çözeltiler alikoları kaydedilmesi gerekir ve olası nitrit ya da (daha çok) nitrat kirlenme kontrol etti. Çoğu kirlenme su gelir ve bir çok kimyasal endojen nitrat belirlenmesine müdahalede bulunan bir çok nitrat kirlilik önemli bir miktarını ihtiva örnek (özellikle ferrisiyanür) tedavisinde kullanılan bulundu. Biz düzenli deneyde kullanmadan ön...

Nitrit ve daha az uzatmak nitrat, kandaki düzeyleri vücutta genel devlete YOK metabolizmasını yansıtmaktadır. mikromolar - nitrit kandaki konsantrasyonu ve en çok organ ve dokuların sadece yüksek nanomolar ya da düşük mikromolar, nitrat çok daha yüksek miktarlarda, genellikle mevcut bulunmaktadır. nedeniyle hastalığın ilerlemesi nitrit düzeylerindeki değişiklikler veya diyet alışkanlıklarındaki değişiklikler oldukça küçük ve sadece çok hassas bir yöntem kullanılarak ölçülebilir. Çünkü onların çok farklı düzeylerde ve farklı metabolik süreçlerin, nitrit ve nitrat düzeyleri ayrı belirlenmesi esastır. Nitrit ve nitrat birlikte ölçülen çok az değere sahip olan &quot;NO x belirlenmesi&quot; olarak adlandırılan. Çeşitli biyolojik numunelerde nitrit ölçülmesi için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir - En yaygın başlangıçta bile, modern modificatio ile 1879 yılında açıklanan olmuştu Griess reaksiyonu dayalı, eski bir varlıkNS, Griess &#39;yöntemiyle elde edilebilen nitrit duyarlılık sınırı düşük mikromolar arasındadır. Tri-iyodür çözeltisi azaltılması ile birlikte Kemilüminesans (CL), şu anda nitrit konsantrasyonlarının 1-8,10,11 düşük nanomolar aralığında sayılmasına olanak tanıyan, en hassas yöntem olarak kabul edilir. Vanadyum (III) klorür çözeltisi azaltılması ile birlikte, aynı CL yöntem olup, nanomolar aralıkta 9 hassasiyetle, nitrat, hassas ölçümler için de kullanılabilir. CL ücretsiz gaz NO algılar. Bu nedenle, nitrit, nitrat, R-nitrozo tiyol (R TARGET), R NİTROSOAMİNLERİN (R NNO), ya da metal-NO bileşikleri (daha sonra el yazması olarak anılacaktır &quot;R- (X) = NO&quot;), dönüştürülmelidir CL aracılığıyla kendi özgün miktarlarda ölçmek için NO gazı boşaltın. NO dönüşüm NO metabolitin doğasına bağlı olarak, çeşitli indirgeyici çözüm kullanılarak elde edilir. Dönüştürmeden sonra, kuru NO gazı bir taşıyıcı gaz (O, N, reaksiyon kabından temizlenir2 veya ozon (O 3), azot dioksit oluşturmak üzere NO ile birleştirilir CL analizörünün reaksiyon haznesine, Ar) (NO 2), aktive edilmiş bir halde. Zemin durumuna dönüşü ile, NO 2 * kızılötesi bölgede yayar ve yayılan foton CL aracının photomultiplier (PMT) tarafından tespit edilir. yayılan ışığın yoğunluğu, uygun bir kalibrasyon eğrisi kullanılarak, orijinal türlerin konsantrasyonunun hesaplanmasını sağlar tepkime haznesi NO konsantrasyonu ile doğrudan orantılıdır. Protokolde, biz en çok kullanılan klinik ortamlarda nitrit ve nitrat ilk bugünkü CL-bazlı tayininin - kan ve plazmada, ve sonra biz doku örneklerinde bu iyonları nasıl belirleneceği tartışmak. Biz de böyle bir kan ve bölmeleri, plazma ve kırmızı kan hücreleri olarak nitrit-reaktif ortamlarda, orijinal fizyolojik nitrit konsantrasyonunu korumak için nasıl ayrıntılı olarak açıklar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:351px;">potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">702587</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEM; N-ethylmaleimide</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td>4260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sulfanilamide; AS&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td>S9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HCl</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">acetic acid, glacial</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ascorbic acid&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">potassium iodide; KI</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">60399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">iodine; I2</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">207772</td>
			<td>light sensitive, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">sodium nitrite; NaNO2</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td>563218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">vanadium(III) chloride; VCl3</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">208272</td>
			<td>ligt sensitive, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GentleMac</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sievers NOA 280i</td>
			<td style="width:135px;">GE</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CLD 88Y</td>
			<td style="width:135px;">&#160;Ecophysics&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring nitrite and nitrate, metabolites in the nitric oxide pathway, in biological materials using the chemiluminescence method

Nitrik oksit (NO) damar homeostazının ve aynı zamanda bir nörotransmiter ana düzenleyici moleküllerin biridir. Enzimatik olarak üretilen NO çeşitli oksi-heme proteinleri ve diğer hala iyi bilinmemektedir yollar ile etkileşimleri tarafından nitrit ve nitrat içine oksitlenir. Ters işlem, NO içine nitrit ve nitrat indirgeme son on yılda memelilerde keşfedildi ve o önlemek veya düşünülen kardiyovasküler, metabolik ve kas hastalıklarının bir dizi kolaylaştırmak için ya olası yolların biri olarak dikkat kazanıyor NO azalan düzeyleri ile bağlantılı olabilir. kan, vücut sıvıları ve çeşitli dokularda - Farklı vücut bölümlerinde NO ve metabolitlerinin miktarını tahmin etmek önemlidir. Kan, nedeniyle kolay erişilebilirlik, NO metabolitlerinin tahmini için kullanılan tercih edilen bölme olduğunu. Nedeniyle kısa ömrü (birkaç milisaniye) ve düşük alt nanomolar konsantrasyonu NO kan direkt güvenilir ölçümler &lt;em&gt; in vivo mevcut büyük bir teknik zorluklar. Böylece YOK kullanılabilirlik genellikle oksidasyon ürünleri, nitrit ve nitrat miktarına dayalı tahmin edilmektedir. Bu iki metabolitler her zaman ayrı ayrı ölçülür. biyolojik sıvılar ve dokular konsantrasyonlarını belirlemek için çeşitli iyi bilinen yöntem bulunmaktadır. Burada, sırasıyla üç iyodür veya vanadyum (III) klorür çözeltileri, nitrit veya nitrat indirgeme sonrası NO spektrofotometrik tespit göre, kemilüminesans yöntemi (CL) için bir protokol mevcut. nitrit ve nitrat tespiti için duyarlılık YOK metabolik yollarda değişiklikleri belirlemek için şu anda mevcut en hassas yöntem olarak CL setleri düşük nanomolar aralığında yer almaktadır. Biz örneklerinde kendi miktarlarını belirlemek için toplanması ve nasıl sırasında nitrit ve nitrat mevcut orijinal miktarda korumak için biyolojik sıvılarda ve dokulardan örnekler nasıl hazırlanacağını ayrıntılı olarak açıklar. CL tekniğinin sınırlamalar da exp vardırLained.

Şekil 2, standart ve beş farklı numune toplanmıştır Örnek sonuçlarını gösterir. Bu Şekilde gösterildiği gibi, photomultiplier gerilim artar nitrit içeren çözelti (standartları veya numune) çözümü azaltılması enjekte edilir hemen sonra başlangıç ​​değerine ve getiri enjekte kez tüm nitrit mevcut (enjeksiyon kez kırmızı eğrinin altında oklarla gösterilir) çözelti düşürülmüştür. Ayrıca, doğru hacim ölçümü yüksek tekrarl...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method at JoVE.com

Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

Kemilüminesans Yöntemi kullanılarak biyolojik Malzemeleri, Nitrik Oksit Yolu&#39;ndaki nitrit ve nitrat, Metabolitler Ölçme

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

measuring-nitrite-nitrate-metabolites-nitric-oxide-pathway-biological

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Signaling Networks of G Protein-coupled Receptors

SCIENTISTS IN ACTION

22.4K Görüntüleme.  NIDDK, NIH. Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

Video: Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Saflaştırılması M. magneticum Deformasyon AMB-1 Magnetosome İlişkili Protein MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Biyoloji

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Biyolojik Tahliller Manyetik Modülasyon Biyoalgılayıcı Sistemi kullanarak hızlı Homojen Algılama

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

Ölçme Caenorhabditis elegans 96 Şey microtiter Tabaklar Ömrü

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

Nitrik Oksit ve hücreler arası Elektron Paramanyetik Rezonans Spektroskopisi ile süperoksit Radikal Anyon tespiti Spin Tuzakları kullanarak

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Ozmotik Su Geçirgenliği Katsayısı (P Ölçme<sub&gt; F</sub&gt;) Küresel Hücreleri: Bir Örnek olarak İzole Bitki protoplastlan

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

Bozulmamış Arterlerin endotel katmanı Nitrik Oksit ve Süperoksit En Yüz Algılama

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Nükleik Asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı DNA izolasyonu,

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...