The authors want to thank Dr. Tadmiri Venkatesh for his encouragement to prepare this manuscript, Dova Brenman and Selwyn Chui for their constructive comments, Elyssa Burg and Wayne Rasband for designing the macro in ImageJ for all interfly distances and for nearest neighbor distances. The authors also want to thank the reviewers for their constructive comments.
A.A.A, M.C.C. and A.F.S were responsible for research design; S.N.J., A.A.A, M.N., Z.R., and A.J.M. performed the experiments. A.A.A, M.N., A.J.M. and M.C.C and A.F.S. analyzed the data; A.R.M. and A.F.S. wrote the manuscript.
This work was supported by PSC-CUNY research awards, jointly funded by The Professional Staff Congress and The City University of New York to A.F.S.; by internal funding from Western University to A.F.S.; by a Mathematics, Biology, Chemistry, and Geology majors scholarship for teachers-in-training and by a Louis Stokes Alliance for Minority Participation scholarship to A.A.A.

1. Equipamentos e Reagentes Criado In-house (Veja a lista de materiais para outros) <ol><li> Prepare um aparelho de anestesia frio Drosophila como descrito anteriormente 8. </li><li> Preparar um aspirador de mosca como previamente descrito 13. </li><li> Prepare câmaras espaço social e titulares. <ol><li> Ordenar ou fazer painéis de vidro e espaçadores de acrílico para criar as câmaras espaço social. Cada câmara de espaço social consiste em dois painéis de vidro quadrados (17,6 cm por 17,6 cm, com uma espessura de 0,3 cm), dois espaçadores de acrílico triângulo direita (com uma altura de 16,5 cm, uma base de 8,9 cm, com uma espessura de 0,3 cm ), e dois espaços rectangulares (9 cm por 1,5 cm com uma espessura de 0,3 cm) (Figura 1A). </li><li> Montar o vidro e a câmara de espaço social acrílico de tal forma que ela é idêntica à câmara na Figura 1B. Para fazê-lo, começar por colocar um espaçador triangular plana no topo de um painel quadrado de vidro de tal modo que o ângulo rectodo espaçador triangular está alinhada com um dos cantos do painel quadrado. Em seguida, coloque o segundo espaçador triangular plana na parte superior do painel quadrado, espelhando o primeiro espaçador triangular. NOTA: Certifique-se de usar luvas para não contaminar as peças com óleos e aromas de suas mãos. </li><li> Colocar duas pequenas espaçadores rectangular plana no topo do painel quadrada, ao longo do lado do painel que não é coberta. Os espaçadores de acrílico na parte superior do avião quadrado deve agora formar uma arena triangular. </li><li> Coloque um segundo painel quadrado de vidro no topo dos espaçadores acrílicos de tal forma que ele está alinhado acima do painel de vidro originais abaixo. </li><li> Use quatro grampos da pasta para fixar os painéis e espaçadores em conjunto para formar a câmara de espaço social. Coloque um grampo próximo do canto, sobre o lado mais longo de cada um dos espaçadores triangulares, prendendo-os no interior das chapas de vidro. Em relação a estes mesmos lados, coloque um clipe no canto adjacente, sobre cada um dos espaçadores rectangulares, prendendo-os emno lado as vidraças. </li><li> Montar um cavalete de suporte, e um balão de braçadeira de tal modo que o grampo irá manter a câmara de espaço social numa posição vertical, como a câmara de espaço social repousa sobre o seu bordo na parte superior da superfície de trabalho. </li><li> Para cada repetição do experimento, montar uma câmara de espaço social e apoio de pé. </li></ol></li><li> Prepare um aparelho de resposta do ensaio escalada para verificar a capacidade de escalada das moscas testados. <ol><li> Usar um aparelho em contracorrente, como anteriormente descrito 14,15. </li></ol></li><li> Assegurar que as condições de iluminação homogénea, realizando a experiência com uma superfície de trabalho coberto com uma tampa de bancada branca e em frente de um fundo branco. </li></ol> 2. Preparar as moscas antes da Experiência <ol><li> Manter moscas em frascos contendo padrão mosca Drosophila alimentos. Mantenha-os numa câmara de incubação a 25 ° C num ciclo luz / escuro de 12 horas de luz. </li><li> Um a dois dias antes de a eXperiment, recolher e sexo voa sob anestesia frio, como descrito anteriormente 8. <ol><li> Resfriar o aparelho de anestesia frio de -4 ° C. Lugar voa para 50 ml tubos de plástico. Totalmente submergir os tubos de plástico contendo moscas em gelo em um balde de gelo isolado, aguarde pelo menos 5 minutos para moscas para se tornar imóvel. </li><li> Coloque as moscas na folha de polietileno do aparelho de anestesia frio. À TA, utilizar um estereomicroscópio para separar os machos das fêmeas. Manter moscas, em grupos, em frascos contendo padrão mosca Drosophila comida, não superior a 40 moscas por frasco. </li></ol></li><li> Duas horas antes do início da experiência, assegurar que a temperatura da sala onde a experiência é realizada será entre 24-25 ° C e com uma humidade de aproximadamente 50%. </li><li> Transferir as moscas em novos frascos contendo comida, e coloque-os durante 2 horas sobre a superfície de trabalho, onde a experiência será executada. NOTA: Para estas experiments, as linhagens de moscas utilizados foram estirpes de Drosophila melanogaster: Canton-especiais ou Canton-S (CS), w 1118 Cs 10 (ou W - w 1118 outcrossed 10 vezes a Canton-S), Oregon e Samarkand moscas foram todos do nosso laboratório stocks 16; Elwood moscas foram coletadas no Outono de 2011 no bairro de Elwood de Huntington, em Long Island, Nova York, EUA 8. Além quando especificado em contrário, os resultados apresentados foram obtidos com Canton-S moscas (em tons de vermelho). </li></ol> 3. a realização do experimento <ol><li> Realizar o experimento doze horas - três horas (tempo Zeitgeber - o tempo em horas após o início da luz - de ZT 4-7). </li><li> Prepare a câmara de espaço social para a transferência de moscas. <ol><li> Coloque um apartamento câmara espaço social em uma superfície de trabalho, com o lado que contém espaçadores rectangulares mais próximos ao seu corpo. </li><li> Remover one clipe mais próximo de seu corpo e deslizar um espaçador rectangular para o exterior, criando uma lacuna de cerca de 1 cm entre os espaçadores rectangulares. </li><li> Usando fita e um marcador, rotular a câmara de espaço social em um canto superior com o sexo, estirpe, e número de repetição. Tome cuidado para garantir a fita não cobre parte da arena triangular interior. </li></ol></li><li> Transferir as moscas na câmara espaço social. <ol><li> Transferência voa de seu frasco contendo alimentos em um novo frasco vazio. Aspirar voa do frasco vazio e transferi-los para a câmara de espaço social. <ol><li> Inalar para desenhar as moscas dentro da ponta do aspirador. Colocar a ponta no 1 cm lacuna entre os espaçadores rectangulares da câmara de espaço social e exalar, a uma taxa consistente para forçar as moscas para a arena triangular interna. </li><li> Deslize imediatamente o espaçador rectangular de volta no lugar, fechando a base da arena triangular interior, e coloque o grampo da pasta novamente. </li></ol></li&gt; </ol></li><li> Em uma almofada batendo, que está localizado no banco diferente de onde o trabalho experimental tem lugar, segurar a câmara de espaço social na posição vertical de modo a que os espaçadores são rectangulares na parte inferior. Libra três vezes para assegurar que todas as moscas ter caído para a parte inferior da arena. NOTA: Devido ao espaçador acrílico saindo do menor tamanho de câmara (Figura 1D), bang cotovelos na superfície de trabalho, mantendo uma fixação segura no aparelho, para garantir as moscas caíram para o fundo. </li><li> Iniciar um temporizador. </li><li> Coloque a câmara de espaço social na superfície de trabalho e usar o apoio e suporte de balão braçadeira para mantê-lo na posição vertical. Coloque uma régua ou uma etiqueta de comprimento conhecido plana contra a câmara de espaço social, mas não abrangendo qualquer parte da arena triangular interior. <ol><li> Para experiências posicionadas horizontalmente, não coloque a câmara de espaço social no stand de apoio; em vez colocar a câmara plana espaço social na superfície de trabalho. </li></ol&gt; </li><li> Quando as moscas se instalaram, geralmente após cerca de 30 minutos, tirar uma foto da câmara de espaço social. Certifique-se que o quadro contém toda a arena interior triangular, o governante, eo rótulo. </li><li> Repita a experiência de cada genótipo e da condição (idealmente 3 repetições internas e 3 repetições independentes). </li></ol> 4. Analisando os Dados Espaço Social <ol><li> Importe os seguintes Macros em ImageJ 17 <ol><li> ImageJ está disponível aqui: http://rsbweb.nih.gov/ij/. </li><li> Você pode criar um comando &#39;Distâncias Medidas &quot;no menu Plugins, salvando as macros abaixo em um arquivo chamado&#39; Measure_Distances.txt &#39;na pasta ImageJ / plugins, na subpasta macro, e usando Ajuda&gt; comando Menus Update&#39;. </li><li> Cópia em um arquivo .txt as macros que são fornecidos em dados suplementares e foram originalmente publicados em três. </li></ol></li><li> Upload de imagens para um computador, e abra um picture usando ImageJ. <ol><li> Criar uma escala desenhando uma linha a partir dos 0 cm a 1 cm de marcas na régua na imagem, e sob a guia Analisar, escolha o recurso Escala Definir para definir uma escala de 1 cm para que a distância (mesma abordagem para o adesivo de comprimento conhecido). Escolha a opção global antes de aplicar a escala para a imagem. </li><li> Recortar a imagem usando a função Corte sob a guia Imagem de tal forma que inclui todas as moscas, ao remover tanto quanto do resto da imagem possível. </li><li> Fazer o retrato preto e branco, escolhendo 8-bit a partir da opção Tipo na guia Imagem. </li><li> Remova todo o ruído de fundo da imagem, indo para o recurso Threshold sob a opção de Ajuste da guia Imagem. Arraste as barras deslizantes para melhorar ou remover o contraste para que o corpo de cada mosca pode ser visto claramente, sem quaisquer outras marcações na imagem. Se houver marcas que não são moscas, capturá-los com a ferramenta rectangular e excluí-los. </li><li> Colocou omedições usando a ferramenta Definir Medidas sob a guia Analisar. Selecione Area, Centro de Massa, Centroid, e Rótulo de Exibição. Em seguida, escolha as partículas Analisar apresentam sob a guia Analisar para criar uma lista numerada de todos os pontos negros representam moscas. <ol><li> Ao utilizar partículas Analise; set tamanho 0,01-0,1 (não escolher unidade pixel); circularidade 0,00-1,00; mostrar contornos; apresentar resultados, e adicionar a gerente. </li><li> Certifique-se de que cada mancha preta (cada partícula) é uma representação precisa das moscas que estão na imagem original, através da comparação da lista numerada para a imagem original. NOTA: Se algumas moscas que estão muito perto em conjunto que está sendo contado como uma partícula, desenhar manualmente uma linha em branco para separar as duas moscas na imagem binária. </li></ol></li><li> Enquanto a lista está seleccionada, utilize o vizinho mais próximo - Lista Distâncias macro sob a segunda opção Macros na aba Plug-ins para criar uma nova lista contendo as distâncias, em centímetros, a partir da EAch voar para o seu vizinho mais próximo. </li></ol></li><li> Copie as distâncias vizinhos mais próximos de ImageJ e colar em uma coluna de um programa de planilha. <ol><li> Compilar todos os dados de cada repetição na mesma planilha e organizar pelo genótipo e condição. </li></ol></li><li> Executar análise de dados usando o software estatístico. Neste experimento, Graph Pad Prism (versão 6 para MacOSX, GraphPad Software, San Diego, Califórnia, EUA, www.graphpad.com) foi utilizado para realizar one-way ANOVA e testes de Kruskal-Wallis, Tukey e de post-hoc testes de Dunnet. </li><li> A distribuição das distâncias segue uma distribuição não paramétrica 1, e os dados estão representados como a caixa de bigodes e Tukey (para eliminar valores extremos). </li></ol> 5. Escalada Assay (Comportamento de Controle) <ol><li> Use um ensaio escalada como um controle para moscas de teste de escalada capacidade 14,15,18. <ol><li> Use o aparelho em contracorrente de tal forma que três ensaios cum ser executado em paralelo. </li></ol></li><li> Transferência de 50 a 100 moscas virgens de tratamento (moscas que não tenham sido testadas antes) em três frascos de ensaio diferentes, e encaixá-los no 1º, 3º e último ranhuras na parte inferior do aparelho em contracorrente, com frescos frascos vazios nos locais opostos. </li><li> Coloque fresco, em frascos vazios os espaços vazios na parte inferior do aparelho. </li><li> Toque para baixo do aparelho de três vezes, de modo a que todas as moscas estão na parte inferior de cada tubo, para iniciar a experiência. </li><li> Inicie o cronômetro para 15 segundos (tempo suficiente para ~ 100% de 3-7 dias de idade Canton-S para chegar ao topo vial - veja a Figura 3F). </li><li> Deslize a porção superior do dispositivo de contra-corrente, para deslocar os melhores frascos por uma ranhura. </li><li> Recolha moscas tocando no aparelho para baixo, para trazer todas as moscas nos frascos de fundo. <ol><li> 1º e 2 tubos nd (ou 3º e 4º, 5º </sup&gt; e 6º) correspondem, respectivamente, as moscas que não atingiram a parte superior e as moscas que atingiram o topo do frasco. </li></ol></li><li> Calcule o Índice de Desempenho (PI). <ol><li> Contar o número de moscas em cada frasco. </li><li> O PI é a percentagem de moscas capaz de subir no tubo superior. </li><li> Os meios de PI seguem uma distribuição normal 1, e os dados são representados como gráficos de coluna de média mais ou menos o erro padrão da média (SEM). NOTA: Como alternativa, o PI pode ser calculada como a percentagem de moscas que possam atingir a parte superior do frasco inferior (por moscas mais velhos, 5 segundos é o tempo suficiente para quantificar a diferença na escalada capacidade entre infectado e não infectado 12 dias de idade Canton-S quantificados a partir de uma imagem estática: ver resultados). Outros usaram diferentes medidas de desempenho em geotaxis negativos induzida por sobressalto, que também são apropriados para quantificar escalada capacidade 19-22. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Neste protocolo, um procedimento detalhado para a quantificação do espaço social foi descrita. Alguns passos cruciais para garantir o experimento for bem-sucedida são: 1) usar sempre luvas durante a limpeza e configuração do aparelho, para manter seus próprios óleos e aromas fora da câmara interna do aparelho, 2) garantir moscas são coletadas, pelo menos, um dia antes o experimento para reduzir os efeitos potenciais da anestesia frio, 3) 2 horas antes do experimento fornecer novos frascos contendo alimentos fr...

As interações sociais são cruciais para o bom desenvolvimento e saúde dos indivíduos dentro de um grupo como um todo, e pode ser observado através de numerosas espécies, a partir de seres humanos (Homo sapiens) para os organismos mais simples, como as moscas da fruta (Drosophila melanogaster) 5,6. Uma mosca da fruta indivíduo ou meios comuns de compartilhamento humano para processar a informação sensorial durante essas interações, quer seja: auditiva, visual, olfativa, tátil, ou gustação. Nós e outros a hipótese de que há uma neurocircuitry potencialmente compartilhada subjacente respostas comportamentais a interações sociais e que as células neuronais e genes envolvidos pode ser conservada evolutiva 7. Uma vez que a interação inicial ocorreu, o espaço social entre os indivíduos que interagem vão quer aumento (evitação social 8) ou diminua (formação de grupos / agregação 5). Interações mais complexas, como agressividade ou namoro, pode então ter lugar. <p cmoça = &quot;jove_content&quot;&gt; Nem ferramentas e métodos sofisticados, nem grandes investimentos em tempo e treinamento são necessários para quantificar esta forma simples de comportamento social, tornando-se uma poderosa ferramenta analítica. Aqui, nós explicar um protocolo simples que quantifica distância inter-fly, ou espaço social, para avaliar a interacção social em grupos estáveis ​​de Drosophila melanogaster, como usado nos seguintes estudos 1-4,9. O espaço social refere-se a uma medida da distância entre uma mosca e seu vizinho mais próximo 10. O espaço social é consistente para uma dada população de D. melanogaster, quando as condições experimentais são preservadas (média de aproximadamente 1-2 comprimentos dentro do corpo), e varia em relação à experiência social das moscas, aumentando, se o indivíduo tenha sido mantidos em isolamento 1. Visão adequada é necessária para manter a distância social normal, mas não odorants clássicos ou CVA percepção 1. Medida do espaço social pode, portanto, serutilizado como uma ferramenta de diagnóstico para analisar as interacções sociais e quantificar o comportamento social em D. melanogaster 1. Nós descrevemos aqui em detalhes como realizar essa quantificação, e em que medida variáveis ​​experimentais comuns afeta este comportamento. Mostra-se que a orientação da câmara em que o ensaio é realizado, bem como o número de moscas - a uma extensão - fazer afecta espaço social. Foi previamente mostrado que a geometria da câmara afeta o movimento espontâneo exploratório de moscas 11,12, e este fenômeno pode vir a ter impacto sempre que decidam estabelecer. No entanto, desde que a densidade de mosca (mosca / cm 2) e a orientação da câmara é mantida a mesma, o espaço social das moscas também permanece constante. A robustez do presente ensaio é ilustrada pelo facto de que os laboratórios independentes utilizando diferentes tamanhos de câmara, forma e orientação pode replicar o resultado apresentado por mutantes do whgene ite (que afectam a pigmentação dos olhos), que é um espaço social aumento (triângulo vertical ou horizontal em um círculo, quadrado horizontal com o fluxo de ar em 3). Nossos resultados também indicam que a manutenção do momento em que o experimento espaço social é realizada é fundamental para a consistência dos resultados, como mostramos que machos, mas não fêmeas, são mais distantes à noite. No entanto, as diferenças observadas entre diurnas e noturnas horas não são devidas às diferenças das moscas de atividade, e discutimos argumentos indicando que os níveis de atividade não são correlacionados com o espaço social. Finalmente, existem bases genéticas para a determinação do espaço social, como indicado pelo mutante branco já descrito 1,3, e as diferenças entre várias estirpes puras e selvagens capturados de moscas que apresentamos aqui. Por isso, este ensaio é uma excelente ferramenta fou estudando os efeitos da genética, bem como fatores ambientais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereo Zoom Microscope&#160;</td>
			<td>Nikon&#160;&#160;</td>
			<td>SMZ-645</td>
			<td>Any other standard scope for fly handling would work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small paint brushes&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for pushing flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jazz-mix</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>33545</td>
			<td>any other standard drosophila food would work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Alarm Timer/Stopwatch</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Sharpie pens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium size binder clips</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td>to hold the chambers together: 1-1/4&#34; (32mm) medium clips with 5/8&#34; capacity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small SupportStands</td>
			<td>Carolina&#160;</td>
			<td>707161</td>
			<td rowspan="2">to hold the chambers in a vertical orientation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buret clamps</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>707362</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>&#160;Coolpix S8000&#160;</td>
			<td>to take the still pictures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small ruler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to be able to scale the picture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trifold board and white bench cover</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to provide a white background, and a homogeneous light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pounding pad</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any mouse pad works.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 6</td>
			<td>GraphPad Software Inc.</td>
			<td>Prism 6 for Mac OS X</td>
			<td>Any statistical analysis software with t-test, one-way and two ANOVA would work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

conditions affecting social space in drosophila melanogaster

O ensaio aqui descrito espaço social pode ser utilizado para quantificar interacções sociais de Drosophila melanogaste R - ou outros insectos pequenas - de uma maneira simples. Como já foi previamente demonstrada 1, numa câmara de bi-dimensional, que primeiro forçar as moscas para formar um grupo compacto, subsequentemente, o que lhes permite levar a sua distância preferida entre si. Depois de ter resolvido as moscas, medimos a distância para o vizinho mais próximo (ou espaço social), o processamento de uma imagem estática com o software on-line gratuito (ImageJ). A análise da distância para o vizinho mais próximo permite aos pesquisadores determinar os efeitos de fatores genéticos e ambientais sobre a interação social, enquanto controlando para possíveis fatores de confusão. Diversos fatores, como capacidade de subida, hora do dia, sexo e número de moscas, pode modificar o espaçamento social das moscas. Nós, assim, propor uma série de controlos experimentais para mitigar esses efeitos de confusão. Este ensaio podeser utilizado para, pelo menos, duas finalidades. Primeiro, os pesquisadores podem determinar a forma como a sua mudança ambiental favorito (como o isolamento, temperatura, estresse ou toxinas) terá impacto social, espaçamento 1,2. Em segundo lugar, os pesquisadores podem dissecar as bases genéticas e neurais desta forma básica de comportamento social 1,3. Especificamente, ele foi usado como uma ferramenta de diagnóstico para estudar o papel de genes ortólogos que estariam envolvidas no comportamento social em outros organismos, tais como genes candidatos para o autismo em humanos 4.

A câmara de espaço social pode ser usado como uma ferramenta para quantificar o comportamento social de Drosophila melanogaster. Espaçadores acrílico e chapas de vidro são cortadas em conjunto para formar uma arena triangular interna que proporciona uma área bidimensional em que voa podem formar grupos estáveis ​​sem a presença de diversos estímulos potencialmente de confusão. Quando as moscas são transferidos para a arena vertical, eles são surpreendidos por ser batido para baixo, e eles respon...

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Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The effect of genes and environment on social space of Drosophila melanogaster can be quantified through a powerful but straightforward analytical paradigm. We show here different factors that can affect this social space, and thus need to be taken into consideration when designing experiments in this paradigm.

Condições que afetam Espaço Social em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

conditions-affecting-social-space-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

12.0K visualizações.  University of Western Ontario. The effect of genes and environment on social space of Drosophila melanogaster can be quantified through a powerful but straightforward analytical paradigm. We show here different factors that can affect this social space, and thus need to be taken into consideration when designing experiments in this paradigm.

Vídeo: Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Único Recordings Sensillum na Insetos Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Neurociência

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenética estimulação do comportamento de fuga em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Determinação da atividade locomotora espontânea em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by stressed conspecifics due to an odorant released during stress known as the Drosophila stress odorant (dSO). Through the use of the T-maze apparatus, one can quantify the avoidance of the dSO by responder flies in a very affordable and robust assay. Conditions necessary to obtain a strong performance are presented here. A stressful experience is necessary for the flies to emit dSO, as well as enough emitter flies to cause a robust avoidance response to the presence of dSO. Genetic background, but not their group size, strongly altered the avoidance of the dSO by the responder flies. Canton-S and Elwood display a higher performance in avoiding the dSO than Oregon and Samarkand strains. This behavioral assay will allow identification of mechanisms underlying this social behavior, and the assessment of the influence of genes and environmental conditions on both emission and avoidance of the dSO. Such an assay can be included in batteries of simple diagnostic tests used to identify social deficiencies of mutants or environmental conditions of interest.

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Here, we present a protocol to quantify the avoidance of stressed individuals. This paradigm is powerful yet user-friendly and can be used to assess the influence of genes and environment on one kind of social interaction in Drosophila melanogaster.

Ensaio simples para Quantificação de Prevenção Social<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

Clones em um ensaio comportamental para Mechanosensation de MarcM baseada em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral variation. The larval path-length assay was developed to measure individual differences in foraging behavior that were later linked to the foraging gene. Larval path-length is an easily scored trait that facilitates the collection of large sample sizes, at minimal cost, for genetic screens. Here we provide a detailed description of the current protocol for the larval path-length assay first used by Sokolowski. The protocol details how to reproducibly handle test animals, perform the behavioral assay and analyze the data. An example of how the assay can be used to measure behavioral plasticity in response to environmental change, by manipulating feeding environment prior to performing the assay, is also provided. Finally, appropriate test design as well as environmental factors that can modify larval path-length such as food quality, developmental age and day effects are discussed.

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

Forrageamento Protocolo Caminho de comprimento para<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larvas

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

O capilar alimentador ensaio mede ingestão alimentar em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

Despite decades of investigation, the neuronal and molecular bases of motivational states remain mysterious. We have recently developed a novel, reductionist, and scalable system for in-depth investigation of motivation using the mating drive of male Drosophila&#160;melanogaster (Drosophila), the methods for which we detail here. The behavioral paradigm centers on the finding that male mating drive decreases alongside fertility over the course of repeated copulations and recovers over ~3 d. In this system, the powerful neurogenetic tools available in the fly converge with the genetic accessibility and putative wiring diagram available for sexual behavior. This convergence allows rapid isolation and interrogation of small neuronal populations with specific motivational functions. Here we detail the design and execution of the satiety assay that is used to measure and alter courtship motivation in the male fly. Using this assay, we also demonstrate that low male mating drive can be overcome by stimulating dopaminergic neurons. The satiety assay is simple, affordable, and robust to influences of genetic background. We expect the satiety assay to generate many new insights into the neurobiology of motivational states.

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

This article describes a behavioral assay that uses male mating drive in Drosophila melanogaster to study motivation. Using this method, researchers can utilize advanced fly neurogenetic techniques to uncover the genetic, molecular, and cellular mechanisms that underlie this motivation.

Medir e alterando Acasalamento Drive em Male<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Despite decades of investigation, the neuronal and molecular bases of motivational states remain mysterious. We have recently developed a novel, ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

In vivo Optical cálcio Imaging de aprendizagem induzida por plasticidade sináptica em Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Adaptando a microrrespirometria para Drosophila - Insights sobre o metabolismo mutante CASK

Measuring O2 Consumption in Drosophila melanogaster Using Coulometric Microrespirometry

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable environment. A coulometric microrespirometer consists of an airtight chamber in which O2 is consumed and the CO2 produced by the organism is removed by an absorbent medium. The resulting pressure decrease triggers electrolytic O2 production, and the amount of O2 produced is measured by recording the amount of charge used to generate it. In the present study, the method has been adapted to Drosophila melanogaster tested in small groups, with the sensitivity of the apparatus and the environmental conditions optimized for high stability. The amount of O2 consumed by wildtype flies in this apparatus is consistent with that measured by previous studies. Mass-specific O2 consumption by CASK mutants, which are smaller and known to be less active, was not different from congenic controls. However, the small size of CASK mutants resulted in a significant reduction in O2 consumption on a per-fly basis. Therefore, the microrespirometer is capable of measuring O2 consumption in D. melanogaster, can distinguish modest differences between genotypes, and adds a versatile tool for measuring metabolic rates.

Autor em destaque: Influência da temperatura na Drosophila melanogaster e besouros adaptados ao deserto 

Coulometric respirometry is ideal for measuring the metabolic rate of small organisms. When adapted for Drosophila melanogaster in the present study, measured O2 consumption was within the range reported for wildtype D. melanogaster by previous studies. Per-fly O2 consumption by CASK mutants, which are smaller and less active, was significantly lower than the wildtype.

Mensuração do Consumo de O2 em Drosophila melanogaster Utilizando Microrrespirometria Coulométrica

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable ...

Methods Article

Condições que afetam Espaço Social em