Os autores gostariam de agradecer a Mant Acon pelas plantas utilizadas neste estudo. O financiamento foi fornecido pelo projeto CRIS 8062-22410-007-000-D do Departamento de Agricultura dos EUA (USDA) e pelo USDA NIFA grant 2020-70029-33176.

1. Produção de plantas cítricas para injeção experimental de compostos
<ol><li>Propagar pequenos vasos de citros a partir de estacas vegetativas enraizadas ou sementes. Cultivar as linhas cítricas em vaso sob um comprimento de dia claro/escuro de 16 h/8 h e a 28 °C.</li>
	<li>Selecionar plantas cítricas de tamanho adequado para o experimento. As aplicações descritas exigiram que as plantas tivessem entre 12 cm e 100 cm de altura e diâmetros de tronco de 4-14 mm. Se for necessário um novo crescimento, corte as plantas antes do experimento.</li>
</ol>2. Impressão tridimensional do dispositivo DPI e componentes do molde
<ol><li>Aplique uma fina camada de cola à base de acetato de polivinila na cama de impressão.</li>
	<li>Coloque o filamento de nylon na impressora 3D e prepare a impressora de acordo com as instruções do fabricante. Importe o arquivo desejado. Arquivo STL (Arquivo Suplementar 1, Arquivo Suplementar 2, Arquivo Suplementar 3, Arquivo Suplementar 4, Arquivo Suplementar 5, Arquivo Suplementar 6, Arquivo Suplementar 7, Arquivo Suplementar 8, Arquivo Suplementar 9, Arquivo Suplementar 10, Arquivo Suplementar 11, Arquivo Suplementar 12, Arquivo Suplementar 13 e Arquivo Suplementar 14), configurado e iniciado a impressão.</li>
	<li>Retire a peça da cama de impressão. Enxágue a cola à base de acetato de polivinila da base do componente impresso com água e remova todas as estruturas de suporte.</li>
	<li>Borrife o componente DPI com duas demãos de tinta spray de brilho transparente.</li>
</ol>3. Fabricação do molde do anel de plastisol
<ol><li>Monte uma forma de molde grande o suficiente para segurar as peças do padrão construindo um gabinete retangular usando blocos plásticos encaixados em uma base (Figura Suplementar S1A).</li>
	<li>Misture o monômero de silicone RTV e o catalisador juntos em uma proporção de 10:1 e mexa sem introduzir bolhas por 1 min. Corar adicionando corante alimentar (3 gotas/25 mL de mistura de silicone) e sabonete para as mãos (1 mL de sabão/25 mL de mistura de silicone) (Figura Suplementar S1B).</li>
	<li>Despeje uma fina camada de silicone na forma do molde que seja suficiente para cobrir completamente o fundo. Tamp para achatar a superfície, e aguardar 24 h para que o silicone se fixe (Figura Suplementar S1C).</li>
	<li>Despeje uma segunda camada de silicone, conforme descrito acima, que seja profunda o suficiente para cobrir a impressão do núcleo do orifício central no padrão (visível na parte superior do padrão na Figura Suplementar S1D). Insira o padrão no silicone líquido com a impressão do núcleo do orifício central voltada para baixo. Certifique-se de que nenhuma bolha esteja presa e que os padrões estejam bem separados e não se toquem (Figura Suplementar S1E).</li>
	<li>Fixe os padrões com um objeto pesado e/ou fita adesiva para evitar que flutuem para fora do silicone enquanto ele se ajusta. Aguarde 24 h para que a camada recém-derramada seja definida (Figura Suplementar S1F).</li>
	<li>Despeje camadas adicionais de silicone até que o nível fique nivelado com a parte superior do padrão. Aguarde 24 h para cura (Figura Suplementar S1G).</li>
	<li>Desmonte os blocos plásticos para soltar o molde. Remova os padrões (Figura Suplementar S1H). Inspecionar o molde em busca de rasgos ou deformidades (Figura Suplementar S1I).</li>
</ol>4. Fundição dos anéis de plastisol
<ol><li>Revestir o interior do molde, todos os componentes do núcleo e os O-rings com óleo de cozinha (Figura Suplementar S2A, B). Coloque um anel O ao redor do entalhe no meio do núcleo do poste central e coloque o núcleo no orifício central do molde do anel de plastisol (Figura Suplementar S2C).</li>
	<li>Insira o núcleo do canal de entrega no orifício na lateral do molde do anel de plastisol. Orientar a ponta em forma de V no final do núcleo do canal de entrega para alinhar com o anel O no núcleo do poste central (Figura Suplementar S2D,E).</li>
	<li>Aqueça o plastisol no micro-ondas para rajadas curtas de 10 s (Figura suplementar S2F, G). Mexer o plastisol suavemente para evitar bolhas (Figura Suplementar S2H). Repetir o aquecimento e a agitação até que a solução atinja uma temperatura compreendida entre 160 °C e 170 °C (figura suplementar S2I). CUIDADO: O superaquecimento do plastisol pode levar à liberação de vapores tóxicos. Realizar o procedimento em uma área bem ventilada ou exaustor. Não aquecer o plastisol a mais de 170 °C.</li>
	<li>Despeje o plastisol fundido no molde do anel de plastisol próximo à borda externa do molde sem introduzir bolhas (Figura Suplementar S2J). Aguarde 1 h para que os anéis de plastisol esfriem (Figura Suplementar S2K). Retire os anéis do molde. Garantir o ajuste adequado com o dispositivo DPI antes de usar em ensaios experimentais (Figura Suplementar S2L).</li>
</ol>5. Fixação do dispositivo DPI à planta
<ol><li>Encontre um local suave e íntegro no porta-malas para o acessório do dispositivo. Evite solavancos ou nós, pois eles podem contribuir para o vazamento do dispositivo.</li>
	<li>Use uma broca de 2 mm de diâmetro para fazer um furo horizontalmente através do centro da haste em um ângulo de 90° com a superfície do tronco (Figura Suplementar S3A). Passe a broca pelo orifício várias vezes para limpá-lo e alisá-lo para criar um furo desobstruído (Figura Suplementar S3B).</li>
	<li>Crie um corte vertical no anel de plastisol no lado oposto do canal de entrega composto (Figura Suplementar S3C). Encaixe o anel ao redor da planta e alinhe o canal de entrega com o furo previamente perfurado (Figura Suplementar S3D). OBS: O anel deve se encaixar confortavelmente ao redor do tronco para evitar vazamentos; Conjuntos de núcleos com vários diâmetros podem ser usados para fazer anéis de plastisol para hastes de plantas de tamanhos diferentes.</li>
	<li>Adicione o dispositivo DPI ao anel de plastisol, garantindo que eles se encaixem perfeitamente. Alinhar o bico do dispositivo de DPI com o canal de entrega do anel de plastisol e o furo perfurado (Figura Suplementar S3E). NOTA: Usar uma broca para alinhar o furo e o bico do dispositivo DPI pode ser útil.</li>
	<li>Enrole bem com fita adesiva de silicone para segurar o aparelho no lugar (Figura Suplementar S3F). Inspecione o dispositivo totalmente montado e acoplado para garantir o alinhamento e a orientação adequados na planta.</li>
</ol>6. Aplicação do composto de juros utilizando o dispositivo DPI
<ol><li>Use uma seringa ou pipeta para preencher o dispositivo de DPI com a solução de interesse (Figura Suplementar S3G). Use uma seringa para penetrar a fita de silicone e o anel de plastisol no lado oposto do dispositivo de IPS para puxar o ar para fora do canal interno e evitar a introdução de bolhas de ar na vasculatura da planta (Figura Suplementar S3H). Substitua qualquer composto extraído de volta para o dispositivo DPI.</li>
	<li>Adicione um pequeno pedaço adicional de fita de silicone sobre o orifício criado pela seringa para reforçar a área e evitar rasgos. Inspecione o aparelho em busca de vazamentos visíveis no ponto de fixação e inspecione o reservatório do dispositivo para obter um nível de líquido estável. NOTA: A água pode ser usada inicialmente para testar vazamentos para evitar o desperdício da solução de teste.</li>
	<li>Cubra a extremidade aberta do dispositivo DPI com filme de vedação de cera e puxe para baixo para formar uma vedação e reduzir a evaporação do composto experimental. Faça um único orifício na película de cera com uma ponta de seringa para evitar o desenvolvimento de vácuo e, posteriormente, encha novamente o dispositivo (Figura Suplementar S3I).</li>
	<li>Verifique o aparelho diariamente para garantir o alinhamento adequado dos componentes (Figura Suplementar S3J), e cubra o líquido usando uma seringa para evitar que o reservatório seque. Repita este processo até que a quantidade desejada de solução experimental tenha sido introduzida. NOTA: Os compostos podem ser introduzidos com sucesso a partir de um determinado dispositivo por até 1 mês. As durações de absorção da solução que excedam esse período de tempo devem ser testadas empiricamente antes da instalação experimental.</li>
</ol>7. Usando CFDA para observar o movimento vascular com plantas cítricas
<ol><li>Conecte o dispositivo de DPI a plantas de citrons (Citrus medica L.) de 25 cm de altura, aplique um único tratamento de 2,0 mL de DMSO a 20% no controle H2O ou CFDA ao dispositivo de DPI e permita sua absorção por 24 h. Para seguir este protocolo, prepare a solução de CFDA de trabalho adicionando 1,6 mL de H 2 O a 400 μL de solução estoque de CFDA (a solução-estoque contém 10 mM de CFDA dissolvido em 100% de dimetilsulfóxido [DMSO]) para gerar uma concentração final de CFDA de2mM e 20% de DMSO.</li>
	<li>Faça cortes transversais de vários tecidos da planta e use um estereoscópio ou microscópio composto com um filtro fluorescente que inclui o comprimento de onda de 498 nm para visualizar o CFDA nos tecidos vegetais. Comparar as imagens com o DMSO a 20% nos controles de H2O para explicar a autofluorescência no tecido.</li>
</ol>8. Medição das alterações nos títulos de CLas em amostras foliares após tratamento com estreptomicina
<ol><li>Usando plantas de 0,75 m de altura cultivadas em casa de vegetação e cultivadas em casa de vegetação de Valência (Citrus sinensis (L.) Osbeck "Valencia"), coletar o pecíolo e a nervura central de duas folhas sintomáticas do HLB de cada planta, picá-las em pequenas seções, agrupar cada tipo de tecido e armazená-las separadamente em tubos de amostra resistentes a impactos de 2 mL contendo uma esfera de aço de 6,35 mm de diâmetro.</li>
	<li>Triturar a amostra usando um homogeneizador programado para dois ciclos de 15 s a 3,4 m/s. Extrair o ácido nucleico total conforme descrito anteriormente19.</li>
	<li>Realizar qPCR nas amostras foliares infectadas por CLas usando a mistura de qPCR definida na Tabela 1 e as condições de reação definidas na Tabela 2. Use plantas que apresentem infecções robustas por CLas (infecção robusta é geralmente definida como valores de Ct baseados em qPCR < 30 para o conjunto de primers CLas 16S LasLong (LL)) para análise adicional. NOTA: O título bacteriano é estimado usando CLas 16S Las Long (LL) e primers de DNA de desidratina cítrica para estimar os equivalentes relativos do genoma, conforme descrito anteriormente20.</li>
	<li>Equipar as plantas cítricas que satisfazem o título mínimo de infecção descrito acima com dispositivos de IPS e submetê-las a um tratamento único de 2,0 mL de solução de H2O ou solução de estreptomicina na concentração desejada. Para acompanhar este estudo, use um único tratamento de 2,0 mL de estreptomicina dissolvida em H2O na dose de 2,0 mL (19 mg no total).</li>
	<li>Coletar amostras foliares aos 7 dias, 14 dias e 28 dias pós-tratamento. Testar as folhas amostradas para o título de CLas usando o mesmo protocolo descrito acima.</li>
	<li>Aos 60 dias após o tratamento, obter fotografias das plantas tratadas com H2O ou estreptomicina. Use observações visuais da infecção por CLas para pontuar a gravidade da infecção. Procure <50% das folhas apresentando clorose intervenosa e cortiça nas nervuras, juntamente com o crescimento do rubor foliar como sinais de infecção leve e mais de 50% das folhas com clorose intervenosa e rolha nas nervuras, bem como abscisão foliar e nanismo do crescimento da planta como sinais de infecções mais graves.</li>
</ol>9. Mensuração da mortalidade de D. citri após tratamento com imidaclopride
<ol><li>Puxe plantas de citron (Citrus medica L.) de 0,5 m de altura até uma altura de 12 cm para incentivar o crescimento de novos afluentes. NOTA: A velocidade de crescimento pode ser dependente da fitossanidade e da época do ano; Então, leve isso em consideração durante o planejamento experimental.</li>
	<li>Após >6 flush, 1-2 cm de comprimento, ter desenvolvido, introduzir as plantas em gaiolas contendo adultos de D. citri. Deixe as plantas nas gaiolas por 24 h para permitir a deposição de ovos.</li>
	<li>Realizar contagens representativas de ovos em três brotos de descarga 1-2 dias após a postura e, posteriormente, aplicar os dispositivos de DPI. Encher esses dispositivos com 2,0 mL de um controle de água ou a concentração desejada de imidaclopride (21,8% de ingrediente ativo). Para seguir esse protocolo, utilizar 528 μL/L, 52,8 μL/L e 5,28 μL/L de imidaclopride. NOTA: As contagens de ovos são uma medida destrutiva, de modo que as contagens nesta fase são usadas para estimar o número de ovos no fluxo não contado da mesma planta e ajudar a fornecer uma linha de base para as contagens subsequentes de emergência de ninfas que são conduzidas no final do experimento.</li>
	<li>Coletar a taxa de emergência de D. citri em pelo menos três dos brotos restantes. Adquirir fotografias representativas da planta 7 dias após a introdução do composto.</li>
</ol>

Entrega de moléculas em plantas usando um dispositivo de infusão direta

<ol>
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Os autores não têm conflitos de interesse. O uso de nomes comerciais, firmas ou corporações nesta publicação é para informação e conveniência do leitor. Tal uso não constitui um endosso ou aprovação oficial pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos ou pelo Serviço de Pesquisa Agrícola de qualquer produto ou serviço, com exclusão de outros que possam ser adequados. O Departamento de Agricultura dos EUA (USDA) proíbe a discriminação em todos os seus programas e atividades com base em raça, cor, origem nacional, idade, deficiência e, quando aplicável, sexo, estado civil, status familiar, status parental, religião, orientação sexual, informações genéticas, crenças políticas, represália ou porque toda ou parte da renda de um indivíduo é derivada de qualquer programa de assistência pública. Nem todas as bases proibidas se aplicam a todos os programas. Pessoas com deficiência que necessitem de meios alternativos para comunicação de informações do programa (Braille, letras grandes, fita de áudio, etc.) devem entrar em contato com o Centro TARGET do USDA pelo telefone (202) 720-2600 (voz e TDD). Para registrar uma queixa de discriminação, escreva para USDA, Diretor, Escritório de Direitos Civis, 1400 Independence Avenue, S.W., Washington, D.C. 20250-9410, ou ligue para (800) 795-3272 (voz) ou (202) 720-6382 (TDD). O USDA é um provedor e empregador de oportunidades iguais.

Para que o dispositivo de DPI seja considerado um método viável para a entrega de compostos exógenos em plantas, ele deve contribuir para a absorção robusta e consistente de compostos em uma variedade de tipos de tecidos. O experimento utilizando CFDA mostrou claramente movimento de compostos acropetais e basipetais, bem como no sistema vascular e nas células do mesofilo da folha. Além disso, e presumivelmente porque o furo usado neste dispositivo de IPD fornece uma grande quantidade de área superficial para a captação do composto, a CFDA estava presente em quantidades relativamente iguais em todas as seções do caule, não apenas em um pequeno subconjunto da vasculatura adjacente ao dispositivo, como foi visto em estudos anteriores de captação de corante em plantas usando injeção de tronco6. Adicionalmente, a liberação de proteína fluorescente verde e corante floral foi testada usando o dispositivo DPI, e uma distribuição desses compostos semelhante à CFDA foi observada (dados não mostrados). Esses dados sugerem que o dispositivo pode ser usado para entregar sistemicamente uma variedade de compostos que variam em tamanho e estrutura molecular. No entanto, é importante notar que houve diferenças na absorção do composto com base no estágio de desenvolvimento foliar, com folhas mais jovens em desenvolvimento ocupando mais composto do que folhas mais velhas estabelecidas. Isso pode ser devido às alterações nas propriedades vasculares presentes no tecido sumidouro versus tecido fonte e deve ser otimizado para um determinado experimento. 
O dispositivo de IPD mostrou absorção de compostos suficiente para a visualização de CFDA, GFP e corante floral, e também levou o suficiente para mostrar os efeitos antibacterianos e inseticidas da estreptomicina e imidaclopride, respectivamente. Ambos os compostos resultaram em alterações na viabilidade do organismo-alvo 1 semana após um único tratamento de 2,0 mL. Esses dados sugerem que o dispositivo de IPD pode ser usado em ensaios de planta inteira para testar a viabilidade de uma ampla variedade de compostos para o controle de pragas microbianas e de insetos. Além disso, devido ao seu contato direto com o sistema vascular, este dispositivo pode até mesmo fornecer uma oportunidade para testar compostos que não são eficientemente absorvidos pelas raízes ou células epidérmicas. De particular interesse seria a interferência de RNA (RNAi), uma vez que poderia ser usada para modular a expressão gênica dentro da planta hospedeira, patógeno ou vetor patógeno. Pesquisas anteriores que introduziram o RNA hairpin através de um orifício perfurado no tronco de macieiras e uvas mostraram que as moléculas de RNA estavam restritas ao tecido do xilema, sugerindo que essas moléculas podem ser eficazes apenas contra organismos mastigadores e alimentadores de seiva de xilema22. Dado que o dispositivo de DPI usa um sistema de entrega de furo perfurado semelhante, é lógico que o RNA hairpin entregue com este dispositivo também pode ser restrito ao tecido do xilema. No entanto, a diminuição observada no título das CLas limitadas ao floema após o tratamento com estreptomicina a partir do dispositivo de IPS sugere fortemente que esse antibiótico estava presente no floema. Portanto, é provável que a distribuição vascular dos compostos liberados usando o dispositivo de DPI seja dependente de seu tamanho e química, e cada molécula deve ser avaliada individualmente.
Embora haja uma série de dispositivos DPI disponíveis comercialmente no mercado, o dispositivo descrito aqui pode ser fabricado internamente e é modificável. Desta forma, melhorias e mudanças de tamanho podem ser feitas com base na espécie vegetal e no desenho experimental que está sendo usado, e não depende de produtos comerciais. Além disso, o dispositivo é semi-permanentemente ligado à planta, o que significa que vários tratamentos de um determinado composto podem ser realizados simultaneamente sem ter que rejuvendo a planta com várias injeções de composto. Em uma nota de advertência, o dispositivo pode vazar se não for instalado corretamente. Como resultado, o composto é perdido para o meio ambiente em vez de ser entregue à planta. Portanto, deve-se tomar cuidado para inspecionar o dispositivo em busca de quaisquer sinais de vazamento durante a configuração e nos primeiros dias depois. Embora a perfuração de um buraco na árvore seja potencialmente prejudicial, este método foi escolhido para garantir uma absorção robusta e consistente do composto. Além disso, não foram observados efeitos adversos sobre a fitossanidade com a fixação do dispositivo de IPS nesses experimentos. No entanto, plantas extras devem ser incluídas no planejamento experimental para substituir aquelas que podem perder vigor ao longo de um determinado experimento. Por fim, como esse dispositivo usa fluxo passivo para introduzir compostos, pode ser difícil prever a taxa de absorção em diferentes espécies de plantas ou estágios de desenvolvimento da mesma espécie. Isso pode complicar os experimentos se a velocidade de absorção do composto for um fator limitante. Para obter os melhores resultados, os experimentos devem ser planejados de modo que seja fornecido tempo suficiente para que a planta absorva totalmente os 2,5 mL do composto, o que pode levar até 1 semana. Em conclusão, este dispositivo de IPD é uma ferramenta eficaz para a rápida avaliação da atividade in planta de compostos antimicrobianos ou inseticidas contra CLas e seu vetor, D. citri, fornecendo assim mais informações sobre a eficácia sistêmica e influência no desempenho das plantas do que o ensaio foliar destacado apresentadoanteriormente23. Sem dúvida, a variedade de aplicações desse sistema vai muito além dos usos específicos descritos neste estudo.

O manejo de plantas em ambientes comerciais e paisagísticos muitas vezes requer o uso de compostos químicos para otimizar o crescimento e a saúde das plantas. Como essas moléculas são entregues depende do tipo de molécula, a função da molécula, o tipo de planta e o sistema de manejo em vigor. Aplicações foliares e de solo são as estratégias de entrega mais fáceis, mas limitações na absorção de algumas moléculas exigem entrega direta. Um exemplo dessas moléculas são moléculas terapêuticas que funcionam melhor quando se movem sistemicamente dentro da planta, mas não podem ser efetivamente entregues por simples aplicações tópicas1. É o caso do Huanglongbing (HLB), também chamado de doença do greening dos citros. O HLB é uma doença associada a uma bactéria limitada ao floema, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), que não pode ser cultivada fora da planta, ou de seu inseto vetor, Diaphorina citri Kuwayama (D. citri)2.
Se as moléculas terapêuticas putativas são produtos gênicos, elas podem ser testadas criando plantas transgênicas expressando esses compostos. No entanto, a produção de plantas transgênicas pode ser intensiva em tempo e recursos, é altamente dependente do genótipo e pode ser inibida pelo silenciamento gênico3. Além disso, mesmo que esses transgênicos apresentem resultados promissores, restrições regulatórias e de percepção pública reduzem a probabilidade de sua aceitação comercial 4,5. A aplicação exógena de compostos, no entanto, simplifica o teste de moléculas biológicas e sintéticas, pois não requer a produção de plantas transgênicas estáveis ou que expressam transitoriamente, o que reduz o tempo e os recursos para testar os efeitos de uma molécula. Um método para a entrega sistêmica eficaz e eficiente de compostos exógenos em plantas poderia ser usado para uma ampla variedade de propósitos de pesquisa e triagem.
Uma dessas aplicações é a análise do movimento sistêmico de moléculas dentro do sistema vascular de uma planta, que pode ser feito por meio de marcadores rastreáveis, sejam eles fluorescentes, visíveis ou isótopos químicos únicos 6,7,8,9. Um marcador fluorescente comumente utilizado é o 5,6-carboxifluoresceína-diacetato (CFDA), que é um corante permeável à membrana que é degradado por esterases intracelulares em 5,6-carboxifluoresceína (FC) e, posteriormente, torna-se fluorescente e impermeável à membrana10. A CFDA tem sido extensivamente utilizada para monitorar o transporte de floema, as relações entre o sumidouro e a fonte e o padrão da vasculatura em tecidos vegetais11,12.
Além desses marcadores, certos compostos podem alterar diretamente a fisiologia da planta para aumentar a produtividade ou matar a planta no caso de herbicidas. Tanto os inseticidas quanto os compostos antimicrobianos são um meio de aumentar a produtividade das plantas, especialmente na presença de HLB. Um exemplo de molécula antimicrobiana que é usada para controlar CLas é a estreptomicina. A estreptomicina é um antibiótico aminoglicosídeo originalmente isolado do Streptomyces griseus e demonstrou inibir o crescimento bacteriano através da inibição da biossíntese proteica13. Em termos de inseticidas, o principal alvo para a pesquisa do HLB é a D. citri, que transmite CLas de árvore para árvore14. Para tanto, neonicotinóides, como o imidaclopride, são comumente utilizados, pois são o padrão-ouro para o controle de insetos-praga15. Todos esses usos variados são aspectos importantes das estratégias atuais de manejo de plantas, e o desenvolvimento de novos produtos depende de ensaios de triagem eficientes.
Um método que é usado para a introdução de compostos em plantas lenhosas é a injeção direta no tronco. Uma variedade de sistemas foi projetada que varia em suas necessidades para locais de injeção pré-perfurados, e esses sistemas utilizam injeção baseada em pressão ou fluxo passivo16. Embora os sistemas baseados em pressão permitam a rápida introdução de um determinado composto, o dano físico potencial causado pela força de líquido através da vasculatura bloqueada ou embolizada precisa ser considerado17. Embora a aplicação foliar ou drenada de compostos seja menos demorada para ser implementada, a injeção direta na planta reduz o desperdício do composto de interesse devido a perdas para o ar ou solo e também pode prolongar o tempo em que os compostos estão em estado ativo, reduzindo a exposição ao ambiente externo18. Ambos os aspectos são importantes para preservar reagentes caros e garantir a consistência entre réplicas em ambientes de pesquisa.
Este estudo descreve o projeto, a construção e o uso de um dispositivo inovador de infusão direta de plantas (IPS), que pode ser usado para avaliar como compostos de interesse afetam uma planta hospedeira. Uma impressora 3D padrão foi usada para fabricar o dispositivo em si e vários componentes associados à sua construção. Este método de construção interno permite que os pesquisadores modifiquem o dispositivo e os componentes do dispositivo com base em suas necessidades experimentais específicas e reduz a dependência de dispositivos de injeção de plantas disponíveis comercialmente. A configuração do dispositivo é simples e eficiente, e todos os componentes auxiliares estão prontamente disponíveis e são baratos. Embora o sistema tenha sido projetado para uso com uma variedade de espécies vegetais, os exemplos aqui apresentados referem-se a plantas cítricas em vasos. Adicionalmente, este estudo demonstra que este dispositivo é capaz de entregar eficientemente múltiplos tipos de compostos sistemicamente para plantas cítricas jovens sem causar letalidade. Os compostos testados incluíram CFDA, que foi usado para avaliar a distribuição do composto na planta, e estreptomicina e imidaclopride, que foram usados para verificar que os efeitos antimicrobianos e inseticidas desses compostos foram observados quando administrados via DPI.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 cm Diameter Steel Balls</td>
			<td>Ballistic Products Inc.</td>
			<td>#SHT #T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>382903029952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G 1 Syringe Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Screw Cap Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1420-9710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/32nd Inch Black Oxide Drill Bit</td>
			<td>Sears</td>
			<td>964077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Printer</td>
			<td>Markforged</td>
			<td>F-PR-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Printing Software</td>
			<td>Markforged</td>
			<td>F-SW-FDVX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Printing Software</td>
			<td>Markforged</td>
			<td>S-FW-OEVX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(6)-CFDA (5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5/64th Inch Black Oxide Drill Bit</td>
			<td>Sears</td>
			<td>964502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well qPCR Machine</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22621408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SP-BX43-BI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>69401-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloss Clear Spray Paint</td>
			<td>Rustoleum</td>
			<td>249117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grey Lego Baseplate</td>
			<td>Lego</td>
			<td>11024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld Cordless Drill</td>
			<td>Makita</td>
			<td>6349D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidacloprid 2F</td>
			<td>Quali-Pro</td>
			<td>83080133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Plastisol Medium Hardness</td>
			<td>Fusion X Fishing Lures</td>
			<td>XSOL-505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Silicone 70 Shore A O-Ring</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>Varies by Size</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Stick Cooking Spray</td>
			<td>PAM</td>
			<td>64144030217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Plant II</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740770.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>HS234526A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly Viyl Acetate Based Glue</td>
			<td>Elmers</td>
			<td>E301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Master Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Varies by DNA sequence</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A5003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor Blade</td>
			<td>Garvey</td>
			<td>40475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent Silicone RTV Rubber</td>
			<td>Aero Marine Products</td>
			<td>AM 115T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent Silicone Tape</td>
			<td>Maxwell</td>
			<td>KE30S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truncated Oncocin 112</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Varies by peptide sequence</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White 1 x 6 Lego Piece</td>
			<td>Lego</td>
			<td>300901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Nylon</td>
			<td>Markforged</td>
			<td>F-MF-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct infusion device for molecule delivery in plants

Testar a função de compostos terapêuticos em plantas é um componente importante da pesquisa agrícola. Os métodos foliar e solo-drench são rotineiros, mas têm desvantagens, incluindo absorção variável e a degradação ambiental das moléculas testadas. A injeção de troncos de árvores está bem estabelecida, mas a maioria dos métodos para isso requer equipamentos caros e proprietários. Para selecionar vários tratamentos para Huanglongbing, um método simples e de baixo custo para entregar esses compostos ao tecido vascular de pequenas árvores cítricas cultivadas em estufa infectadas com a bactéria limitada a floema Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) ou infestadas com o inseto vetor CLas Diaphorina citri Kuwayama (D. citri) é necessário.
Para atender a esses requisitos de triagem, foi projetado um dispositivo de infusão direta da planta (DPI) que se conecta ao tronco da planta. O dispositivo é feito usando um sistema de impressão 3D baseado em nylon e componentes auxiliares de fácil obtenção. A eficácia de absorção de compostos deste dispositivo foi testada em plantas cítricas utilizando o marcador fluorescente 5,6-carboxifluoresceína-diacetato. A distribuição uniforme dos compostos do marcador ao longo das plantas foi rotineiramente observada.
Além disso, este dispositivo foi usado para fornecer moléculas antimicrobianas e inseticidas para determinar seus efeitos sobre CLas e D. citri , respectivamente. O antibiótico aminoglicosídeo estreptomicina foi liberado em plantas cítricas infectadas com CLas usando o dispositivo, o que resultou em uma redução no título de CLas de 2 semanas para 4 semanas após o tratamento. A entrega do inseticida neonicotinóide imidaclopride em plantas cítricas infestadas por D. citri resultou em um aumento significativo na mortalidade de psilídeos após 7 dias. Estes resultados sugerem que este dispositivo de DPI representa um sistema útil para a entrega de moléculas em plantas para testes e facilitar a pesquisa e fins de triagem.

The management of plants in commercial and landscape settings often requires the use of chemical compounds to optimize the plant growth and health. How these molecules are delivered depends on the type of molecule, the function of the molecule, the type of plant, and the management system in place. Foliar and soil applications are the easiest delivery strategies, but limitations in the uptake of some molecules necessitate direct delivery. An example of these molecules is therapeutic molecules that function best when they move systemically within the plant but cannot be effectively delivered by simple topical applications1. This is the case with Huanglongbing (HLB), also called citrus greening disease. HLB is a disease associated with a phloem-limited bacterium, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), which cannot be cultured outside of the plant, or its insect vector, Diaphorina citri Kuwayama (D. citri)2.
If the putative therapeutic molecules are gene products, they can be tested by creating transgenic plants expressing these compounds. However, transgenic plant production can be time- and resource-intensive, is highly genotype-dependent, and can be inhibited by gene silencing3. In addition, even if these transgenics show promising results, regulatory and public perception constraints reduce the likelihood of their commercial acceptance4,5. The exogenous application of compounds, however, simplifies the testing of biological and synthetic molecules because it does not require the production of stable or transiently expressing transgenic plants, which reduces the time and resources for testing a molecule&#39;s effects. A method for the effective and efficient systemic plant delivery of exogenous compounds could be used for a wide variety of research and screening purposes.
One of these applications is the analysis of systemic molecule movement within a plant&#39;s vascular system, which can be done using trackable markers, whether they are fluorescent, visible, or unique chemical isotopes6,7,8,9. One commonly used fluorescent marker is 5,6-carboxyfluorescein-diacetate (CFDA), which is a membrane-permeable dye that is degraded by intracellular esterases into 5,6-carboxyfluorescein (CF) and, subsequently, becomes fluorescent and membrane-impermeable10. CFDA has been extensively used to monitor phloem transport, sink and source relationships, and vasculature patterning in plant tissue11,12.
In addition to these markers, certain compounds may directly alter the plant&#39;s physiology to increase the productivity or kill the plant in the case of herbicides. Both insecticides and antimicrobial compounds are a means of increasing plant productivity, especially in the presence of HLB. An example of an antimicrobial molecule that is used to control CLas is streptomycin. Streptomycin is an aminoglycoside antibiotic that was originally isolated from Streptomyces griseus and has been shown to inhibit bacterial growth through the inhibition of protein biosynthesis13. In terms of insecticides, the main target for HLB research is D. citri, which transmits CLas from tree to tree14. For this purpose, neonicotinoids, such as imidacloprid, are commonly utilized, as they are the gold standard for controlling insect pests15. All these varied uses are important aspects of current plant management strategies, and the development of novel products is dependent on efficient screening assays.
One method that is used for the introduction of compounds into woody plants is direct injection into the trunk. A variety of systems have been designed that vary in their needs for predrilled injection sites, and these systems utilize either pressure-based injection or passive flow16. Although pressure-based systems allow for the quick introduction of a given compound, the potential physical damage caused by forcing liquid through blocked or embolized vasculature needs to be considered17. Although the foliar or drench application of compounds is less time-intensive to implement, direct plant injection reduces waste of the compound of interest due to losses to the air or soil and can also lengthen the time that compounds are in an active state by reducing the exposure to the outside environment18. Both these aspects are important for preserving expensive reagents and ensuring consistency among replicates in research settings.
This study describes the design, construction, and use of an innovative direct plant infusion (DPI) device, which can be used to assess how compounds of interest affect a host plant. A standard 3D printer was used to manufacture both the device itself and several components associated with its construction. This in-house construction method allows researchers to modify the device and device components based on their specific experimental needs and reduces the reliance on commercially available plant injection devices. The device setup is simple and efficient, and all the auxiliary components are readily available and inexpensive. Although the system was designed for use with a variety of plant species, the examples presented here pertain to potted citrus plants. Additionally, this study demonstrates that this device is capable of efficiently delivering multiple types of compounds systemically to young citrus plants without causing lethality. The compounds tested included CFDA, which was used to assess the compound distribution in the plant, and streptomycin and imidacloprid, which were used to verify that the antimicrobial and insecticidal effects of these compounds were observed when delivered via DPI.

Autor em destaque: dispositivo de infusão direta para entrega de moléculas em plantas  

Dispositivo de Infusão Direta para Entrega de Moléculas em Plantas

Delivering a therapeutic molecule to where a pathogen resides in a plant can be challenging. Treating Candidatus Liberibacter asiaticus, or CLas, a bacteria that is limited to the phloem, poses one of the biggest challenges in delivering molecules against it, especially when using conventional methods such as spray applications. The ease of printing the direct plant infusion device and its simple implementation makes it accessible to anyone.This enables the widespread screening of molecules for their potential therapeutic effect in trees. An added benefit is that the diffusion of molecules utilizes the natural process of plant transpiration. Our research improved efficiency and precision of molecular delivery in plants, which can be used for a range of research applications.By screening hundreds of molecules on small plants, we can eliminate the need for larger trees, leading to a reduction in cost and space utilization.

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Este manuscrito descreve um novo dispositivo de infusão direta de plantas para triagem da eficácia de moléculas contra a bactéria (Candidatus Liberibacter asiaticus) ou seu inseto vetor (Diaphorina citri, Kuwayama) que, em combinação, estão associadas à doença dos citros de Huanglongbing.

Testing the function of therapeutic compounds in plants is an important component of agricultural research. Foliar and soil-drench methods are routine but ...

Entregar uma molécula terapêutica para onde um patógeno reside em uma planta pode ser um desafio. O tratamento da Candidatus Liberibacter asiaticus, ou CLas, uma bactéria limitada ao floema, representa um dos maiores desafios na entrega de moléculas contra ela, especialmente quando se usa métodos convencionais, como aplicações de spray. A facilidade de impressão do dispositivo de infusão direta da planta e sua implementação simples o tornam acessível a qualquer pessoa.Isso permite a triagem generalizada de moléculas para seu potencial efeito terapêutico em árvores. Um benefício adicional é que a difusão de moléculas utiliza o processo natural de transpiração das plantas. Nossa pesquisa melhorou a eficiência e a precisão da entrega molecular em plantas, que podem ser usadas para uma variedade de aplicações de pesquisa.Ao selecionar centenas de moléculas em plantas pequenas, podemos eliminar a necessidade de árvores maiores, levando a uma redução no custo e na utilização do espaço.

direct-infusion-device-for-molecule-delivery-in-plants

Research

JoVE Journal

Biology

Direct Infusion Device for Molecule Delivery in Plants

1.3K visualizações.  United States Department of Agriculture Agricultural Research Service U.S. Horticultural Research Laboratory. Entregar uma molécula terapêutica para onde um patógeno reside em uma planta pode ser um desafio. O tratamento da Candidatus Liberibacter asiaticus, ou CLas, uma bactéria limitada ao floema, representa um dos maiores desafios na entrega de moléculas contra ela, especialmente quando se usa métodos convencionais, como aplicações de spray. A facilidade de impressão do dispositivo de infusão direta da planta e sua implementação simples o tornam acessível a qualquer pessoa.Isso...

Vídeo: Autor em destaque: dispositivo de infusão direta para entrega de moléculas em plantas  

Testing the function of therapeutic compounds in plants is an important component of agricultural research. Foliar and soil-drench methods are routine but have drawbacks, including variable uptake and the environmental breakdown of tested molecules. Trunk injection of trees is well-established, but most methods for this require expensive, proprietary equipment. To screen various treatments for Huanglongbing, a simple, low-cost method to deliver these compounds to the vascular tissue of small greenhouse-grown citrus trees infected with the phloem-limited bacterium Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) or infested with the phloem-feeding CLas insect vector Diaphorina citri Kuwayama (D. citri) is needed.
To meet these screening requirements, a direct plant infusion (DPI) device was designed that connects to the plant&#39;s trunk. The device is made using a nylon-based 3D-printing system and easily obtainable auxiliary components. The compound uptake efficacy of this device was tested in citrus plants using the fluorescent marker 5,6-carboxyfluorescein-diacetate. Uniform compound distribution of the marker throughout the plants was routinely observed.
Furthermore, this device was used to deliver antimicrobial and insecticidal molecules to determine their effects on CLas and D. citri respectively. The aminoglycoside antibiotic streptomycin was delivered into CLas-infected citrus plants using the device, which resulted in a reduction in the CLas titer from 2 weeks to 4 weeks post treatment. Delivering the neonicotinoid insecticide imidacloprid into D. citri-infested citrus plants resulted in a significant increase in psyllid mortality after 7 days. These results suggest that this DPI device represents a useful system for delivering molecules into plants for&#160;testing and facilitate research and screening purposes.

This manuscript describes a novel direct plant infusion device for screening the effectiveness of molecules against the bacteria (Candidatus Liberibacter asiaticus) or its insect vector (Diaphorina citri, Kuwayama) that, in combination, are associated with Huanglongbing citrus disease.

Biologia

﻿3D-Printing of Direct Plant Infusion (DPI) Device and Fabrication of Plastisol Rings

3D-Printing of Direct Plant Infusion (DPI) Device and Fabrication of Plastisol Rings  

To begin 3D printing the direct plant infusion or DPI device and mold components, apply a thin layer of polyvinyl acetate-based glue on the print bed of the printer. Load nylon filament into the printer and prepare the printer per the manufacturer's instructions. After importing the desired STL files, set up the printer and start printing.Once the piece is removed from the print bed after printing, rinse the polyvinyl acetate-based glue from the base of the printed component with water. Spray the printed DPI device and other components with two coats of clear gloss spray paint. To fabricate the plastisol ring mold, assemble a mold form by building a rectangular enclosure using snap-together plastic blocks on a base.It should be large enough to hold the pattern pieces. Mix the room temperature vulcanizing silicone or RTV silicone monomer and the catalyst together at a 10:1 ratio by stirring for one minute. Color the solution by adding three drops of food coloring and one milliliter of hand soap per 25 milliliters of silicone mixture.Then, pour a thin layer of the silicone solution into the mold form sufficiently to fully cover the bottom of the mold form. Tamp to flatten the surface of the poured silicone, and wait for 24 hours to set the silicone. Once the silicone is set, pour another layer of silicone deep enough to cover the center hole core print of the pattern.Insert the pattern into the liquid silicone with the center hole core print facing down. Ensure that no bubbles are trapped and the patterns are well separated and not touching each other. Secure the patterns with either a heavy object or tape to prevent them from floating out of the silicone while it sets.Once set, pour additional layers of silicone into the mold form until the level is flush with the top of the pattern. Let the silicone cure for 24 hours. Disassemble the snap-together plastic blocks to release the mold.Then, remove the patterns from the mold and inspect the mold for tears or deformities. For casting the plastisol rings, coat the interior of the mold, all the core components, and the O-rings with cooking oil. Place an O-ring around the notch in the middle of the center post core, and place the core in the center hole of the plastisol ring mold.Insert the delivery channel core into the space on the side of the plastisol ring mold. Orient the V-shaped tip at the end of the delivery channel core to align with the O-ring on the center post core. Next, heat plastisol in the microwave for short bursts of 10 seconds till the solution reaches 160 to 170 degrees Celsius.In between, stir the plastisol gently to avoid bubbles. Pour the molten plastisol into the plastisol ring mold near the outside edge of the mold without introducing bubbles. Wait one hour for the plastisol rings to cool.Then, remove the rings from the mold. The DPI device was eight centimeters in height and three centimeters in width. It had a single central reservoir contiguous with the spout.The total volume that can be contained within these components is 2.0 milliliters. The 1.8 centimeter tall and 2.7 centimeter wide plastisol ring also contained two channels. One to accommodate the DPI device spout and another of variable diameter for fitting around the trunk of the tree.When assembled properly, the plastisol ring should be flush against the DPI device and the spout should line up with the hole drilled in the tree.

Impressão 3D de Dispositivo de Infusão Direta de Planta (DPI) e Fabricação de Anéis de Plastisol

Attachment of the Direct Plant Infusion (DPI) Device to Citrus Plants for Compound Injection

Propagate small potted citrus trees from rooted vegetative cuttings or seeds. Grow the potted citrus lines at 28 degrees Celsius, maintaining a proper day length. Select citrus plants of the appropriate size for the experiment.To attach the 3D-printed Direct Plant Infusion or DPI device to the trunk of the plant, find a smooth, healthy site on the trunk without bumps or knots. Using a two-millimeter-diameter drill bit, horizontally drill a hole through the center of the stem at an angle of 90 degrees to the trunk surface. Run the drill bit through the hole several times to create an unobstructed, smooth hole.Then create a vertical slice in the plastisol ring on the opposite side of the compound delivery channel. Fit the ring around the plant, aligning the delivery channel with the previously-drilled hole. Attach the DPI device to the plastisol ring, ensuring they fit snugly together, and align the DPI device spout with the plastisol ring delivery channel and the drilled hole.Wrap it tightly with silicone tape to hold the apparatus in place. Inspect the fully assembled and attached device to ensure proper alignment and orientation. The groove around the vertical channel allowed additional compound uptake through the bark.When assembled properly, the plastisol ring flushed against the DPI device and the spout lined up with a hole drilled in the tree.

Fixação do dispositivo de infusão direta de plantas (DPI) a plantas cítricas para injeção de compostos

Applying Compounds to Citrus Plants Using a Novel 3D-Printed Direct Plant Infusion (DPI) Device

To apply compounds to the plants using the Novel 3D-Printed Direct Plant Infusion, or DPI device, ensure the device is properly fitted to the plants. When assembled properly, the plastisol ring should be flush against the DPI device and the spout should line up with the hole drilled in the tree. Use a syringe or pipette to fill the DPI device with the compound solution of interest.Using a syringe, penetrate the silicone tape and plastisol ring opposite to the DPI device to extract air from the interior channel. Replace any extracted compound back into the DPI device. Add an additional small patch of silicone tape over the hole created by the syringe to reinforce the area and prevent tears.Inspect the apparatus for visible leakages at the attachment point and inspect the device reservoir for a stable liquid level. Cover the open end of the DPI device with a wax sealing film and pull it down to form a seal to reduce the evaporation of the experimental compound. Poke a single a hole in the wax film with a syringe tip to prevent the development of a vacuum, and subsequently refill the device.Check the apparatus daily to ensure proper alignment of the components, and top off the liquid using a syringe to avoid the reservoir running dry til the desired amount is delivered. When two milliliters of two millimolar CFDA dye was introduced to the plant using the DPI device, a fluorescent signal was detected in the vasculature of the treated plant, but was absent in the controlled plant treated with 20%DMSO in water. This signal was observed within 24 hours of treatment, evenly throughout the dissected plant tissue types.Treatment of streptomycin on Candidatus Liberibacter Asiaticus or CLass positive plants showed a reduction in the mean bacterial titer to 28 days after treatment compared to the control. The treated plants showed a lower mean CLas titer over all combined time points. The streptomycin treated plants as compared to the controls showed an occasional increase in new healthy flush growth after 60 days.Imidacloprid treatment on plants significantly reduced nymph emergence at the highest Imidacloprid concentration compared to the corresponding egg count. This was visually apparent in the reduction in nymph honeydew production.