Name: 3d whole-heart myocardial tissue analysis
Uploaded: 2017-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
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Os autores gostariam de agradecer Marlijn Jansen, Joyce Visser, e Martijn van Nieuwburg por sua assistência com as experiências com animais. Nós reconhecemos muito Martijn Froeling e Anke Wassink por sua assistência com a imagem de ressonância magnética.

A experiência in vivo foi conduzida de acordo com o Guia para o Cuidado e Utilização de Animais de Laboratório preparado pelo Institute of Laboratory Animal Research. O experimento foi aprovado pela Comissão de Experimentação Animal local. 1. Preparação de injectáveis ​​e incorporação Solução <ol><li> Prepara-se o gel injectável. <ol><li> Preparar 1 mL de ureído-pirimidinona gel (UPy) de acordo com protocolos anteriormente descritos 12, 13. </li><li> Adicionar partículas de óxido de ferro superparamagnético (SPIOs) à solução para obter uma concentração de 15 ug / mL e agita-se a mistura durante 5 min para distribuição uniforme. </li><li> Adicionar as microesferas fluorescentes à solução para obter uma concentração de 10.000 contas / ml e agita-se a mistura durante 5 min para distribuição uniforme. </li><li> Armazenar a mistura resultante à temperatura ambiente em um ambiente escuro. Quente e vortex ou agitação tele solução pouco antes do procedimento de injeção. </li></ol></li><li> Preparar a solução de embebimento. <ol><li> Comece com água da torneira à temperatura ambiente e adiciona-agarose (agar) a uma concentração de 4% em peso. </li><li> Lentamente aquecer a solução para o ponto de ebulição usando um forno de microondas e mexa com freqüência durante o aquecimento. Ao atingir o ponto de ebulição, armazenar e manter a solução de agar superior a 70 ° C durante 2 h para permitir que o ar preso para a superfície. </li><li> Permitir que a agar de arrefecer à temperatura ambiente, a uma temperatura entre 50 e 60 ° C até ao momento da incorporação. </li></ol></li></ol> 2. Injeção Procedimento <ol><li> Realizar uma pré-medicação (agentes anti-arrítmicos, a terapia anti-plaquetas, e medicação para a dor), anestesia, o acesso venoso, e intubação, tal como previamente descrito 14. </li><li> Realizar injecções, usando um cateter de injeco intramiocardial (Tabela de Materiais). Para cada injecção, 0.2 ml da mistura é injectada em um bólus a uma velocidade constante de cerca de 0,3 mL / min, utilizando um dispositivo de injecção. Coloque as injecções em diferentes posições ao longo da IBZ 12. </li><li> Administrar 0,2 ml / kg (1,0 mmol / mL) de uma base de gadolínio-agente de contraste de 15 min antes da eutanásia do animal. </li><li> Administrar 20 mL de cloreto de potássio a 7,5% por via intravenosa, para eutanásia do animal. </li><li> Acesso seguro mediastino seguinte protocolo passos 8,2-8,3, tal como descrito por Koudstaal et al. 14. Cortar a veia cava inferior a 5 cm da aurícula direita e remover efusão de sangue com um dispositivo de sucção. Excisar o coração e lave-o com 0,9% de soro fisiológico à temperatura ambiente. </li></ol> 3. Embedding Procedimento <ol><li> Prepare o coração. <ol><li> Remover o pericárdio do coração, mantendo os átrios e ventrículos intacta. Dissecar a aorta ascendente ± 1 cm acima da válvula aórtica utilizando Klinkenbergtesouras. Cortar a veia cava inferior ± 1 cm desde o átrio, e fazer o mesmo para as veias pulmonares. </li><li> Suturar o vértice do coração para o fundo de um recipiente de plástico incorporando (17 x 15 x 15 cm, W x D x H), utilizando um fio de sutura 2-0 para evitar a flutuação do coração durante a incorporação (Figura 1A). </li><li> Suturar a parte restante da aorta aos aros do recipiente usando 2-0, certificando-se de que o coração está centrado e não tocar as paredes do recipiente (Figura 1B). </li></ol></li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54974/54974fig1.jpg" /> Figura 1: Vista geral esquemática e fotografia da incorporação de recipiente. (A) vista geral esquemática do processo de embebimento. O coração (vermelho) é fixado no recipiente (azul) utilizando suturas. Após o enchimento do coração com a solução de agar, o espaço em torno do coração está cheio. Finalmente,dois tubos de plástico rígida (amarelo) estão posicionados no recipiente, ao lado de, mas não tocando o coração, para servir como uma referência durante o registo de imagens. (B) fotografia de um coração fixado no recipiente de incorporação. As suturas são presas até a borda do recipiente utilizando grampos de mosquito. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54974/54974fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="2"><li> Incorporar o coração em uma geometria diastólica final-like. NOTA: A prevenção da criação de bolhas de ar é necessária. Se grandes bolhas de ar presentes na solução de agar, manter o agar a 40 ° C, permitindo que as bolhas de ar à superfície. <ol><li> Prender o cava inferior veia usando braçadeiras de mosquito. Lentamente injectar o líquido de agar utilizando uma seringa de 50 ml no átrio direito, através da veia cava superior, até que tanto a aurícula e o ventrículo direito são completamente preenchido. </li><li> Fixar as veias pulmonares usando MosquitO grampos. Suavemente passar uma seringa cheia de agar-50-mL retrogradamente através das válvulas aórticas. Lentamente, injectar a solução no ventrículo esquerdo (VE) até que o LV e o átrio esquerdo está completamente cheia. Após o enchimento do VE, prender a aorta para manter o agar no VE. </li><li> Verter a ágar remanescente para dentro do recipiente até que o coração está totalmente coberta. Colocar dois tubos de plástico rígido no interior do recipiente incorporando a servir como estruturas de referência para o registo de imagem mais tarde (Figura 1A). Certifique-se os tubos não toque nas paredes do recipiente ou o coração. </li><li> Deixar o agar solidificar a 2-7 ° C. </li></ol></li></ol> 4. Aquisição de Imagem <ol><li> Execute transversais ex vivo exames de ressonância magnética do coração que está incorporado no recipiente. <ol><li> Colocar o recipiente com o coração encaixado no interior de uma bobina de cabeça (Tabela de Materiais). </li><li> Angulate as fatias paralelas ao fundo do recipiente. Usara mesma orientação e angulação em cada sequência ex vivo de ressonância magnética. </li><li> Para visualizar miocárdio, executar uma recuperação inversa atenuada-fluido sequência (DOM) com os seguintes parâmetros: tempo de repetição [TR] / tempo de eco [TE] = 10 s / 140 ms, ângulo aleta = 90 °, o tamanho de pixel = 0,5 x 0,5 mm, campo de visão [FOV] = 169 x 169 mm, 320 x 320 da matriz, e a espessura do corte de 3 mm. </li><li> Para visualizar o enfarte do miocárdio, realizar um fim de gadolínio sequência (LGE) com os seguintes parâmetros: [TR] / [TE] = 5,53 ms / 1,69 ms, ângulo aleta = 25 °, o tamanho de pixel = 1,0 x 1,0 mm, [ FOV] = 169 x 169 mm, 176 x 176 da matriz, e de 3 mm de espessura de corte. </li><li> Para visualizar SPIOs, executar um gradiente ponderadas em T2 * sequência de eco com os seguintes parâmetros: [TR] / [TE] = 88,7 ms / 15 EA igualmente distribuídos com uma gama de 1,9 - 24,6 ms, ângulo aleta = 15 °, de pixel tamanho = 0,5 x 0,5 mm, [FOV] = 169 x 169 mm, 320 x 320 da matriz, e de 3 mm de espessura de corte. </li></ol></li><li> proces tecidocantar <ol><li> Fazer rodar o recipiente de cabeça para baixo e permitir que o ar entre o agar e os lados do recipiente para remover a solução de agar sólido, incluindo o coração, a partir do recipiente. Retirar as hastes de plástico a partir do agar sólido. </li><li> Secção do bloco de agar contendo o coração em fatias de 5 mm a partir do vértice para a base do coração utilizando um cortador de carne. Manter a angulação das fatias cortadas da mesma forma que nas imagens de RM adquiridos por corte paralelo à parte inferior do bloco de agar. </li><li> Manchar as fatias de agar (incluindo o coração) durante 15 min em 1% em peso de 2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride (TTC) dissolvido em 0,9% de solução salina a 37 ° C, e fotografar as fatias de ambos os lados a partir de uma vista perpendicular (Figura 2A). Em seguida, lavar cuidadosamente as fatias em 0,9% de soro fisiológico. NOTA: Neste estudo, foi utilizada uma configuração de DSLR com uma lente / objetivo for o caso, um tripé e iluminação uniforme. No entanto, as fotografias só serviu como um controle para a avaliação da região da cicatriz,portanto, poderíamos ter usado uma configuração diferente. </li></ol></li><li> imagens de fluorescência NOTA: Dependendo das excitação e emissão de comprimentos de onda das microesferas fluorescentes, seleccionar os blocos de filtro e de excitação lasers apropriados (por exemplo, as microesferas vermelhos usados aqui têm excitação e emissão de comprimentos de onda de 580 nm e 605 nm, respectivamente e, portanto, o laser de excitação seleccionado e filtros de banda de passagem foram ajustados para 532 nm, 580/30 nm e 610/30 nm, respectivamente). <ol><li> Selecionar imagens em modo de fluorescência no scanner de modo variável. Definir o tubo fotomultiplicador para 430 V ou equivalente e o tamanho do pixel de 100 x 100 mm. Selecione um laser de excitação (532 nm) mais próximo ao comprimento de onda de excitação das microesferas fluorescentes. </li><li> Para o primeiro bloco de filtragem, selecionar um filtro passa-banda (nm 580/30) que se sobrepõe com o comprimento de onda de emissão de fluorescência das esferas injectados (canal 1). Seleccionar um filtro passa-banda para o segundo bloco de filtro (610/30) do lado de fora da ecomprimento de onda missão (canal 2). NOTA: O segundo bloco de filtro serve como um controlo negativo e para remover auto-fluorescência, mantendo os locais de injecção intacta. </li><li> Digitalizar ambos os lados das fatias de agar no modo de fluorescência do scanner a laser de modo variável usando os dois canais. Certifique-se de que cada fatia é completamente digitalizado, incluindo os furos de referência. </li></ol></li></ol> 5. Pós-processamento NOTA: O primeiro passo para pós-processamento é a segmentação manual do miocárdio usando scripts in-house desenvolvidos para traçar a endo e fronteiras do epicárdio, bem como os locais de injecção. Este é o mesmo para ambos ressonância magnética e exames de fluorescência. <ol><li> Segmento do miocárdio nos exames de ressonância magnética. <ol><li> Segmento do endocárdio e LV borders epicárdio nas imagens da sequência FLAIR ressonância magnética. </li><li> Copiar a segmentação LV do passo 5.1.1 ao conjunto de dados LGE-MRI e segmento a cicatriz na sequência LGE MRI. </li><li> Copie a segmentação do miocárdio do passo 5.1.1 do T2 * conjunto de dados ponderadas e segmento dos depoimentos SPIO no miocárdio LV. </li></ol></li><li> Processar as imagens de fluorescência e realizar segmentações. <ol><li> Carregar os arquivos obtidos a partir do scanner de modo variável e fazer uma imagem separada de cada fatia coração transversal. </li><li> Virar as fatias que foram digitalizados em base para o ápice orientação e classificar as imagens de fluorescência para uma pilha para ambos os canais que é orientada a partir do vértice para a base. </li><li> Segmento do endocárdio e LV borders epicárdio nas imagens de fluorescência. </li><li> Segmento da cicatriz manualmente nas imagens de fluorescência e utilizar a LGE-exame de ressonância magnética e as fotografias para confirmar a morfologia da cicatriz. </li><li> Subtrair a pilha de imagens do canal 2 a partir da pilha de imagem de um canal de excluir auto-fluorescência. segmento manualmente os depoimentos e microbead fluorescentes usar o T2 * imagens para confirmação. </li></ol></li><li> Para criaruma geometria 3D-anatomicamente correcto, executar um registo rígida das fatias na pilha de imagem com base nas estruturas de referência (os furos criados pelos tubos rígidos). Calcular e armazenar a tradução aplicada e rotação de cada imagem. </li><li> Aplicar as transformações armazenados para as pilhas de imagens e as segmentações. Linearmente interpolar os segmentações de ambos os lados das fatias para reconstruir a espessura da fatia original e para criar um modelo 3D dos dados. </li></ol> 6. Análise <ol><li> Realizar medições 2D e / ou 3D da distância entre os centros dos locais de injecção e do IBZ para avaliar a precisão da injeção. Medir a distância ao longo da fronteira endocárdica da segmentação LV. Na Figura 2C e 2F, um exemplo das medições de 2D e 3D é indicado pela linha vermelha. </li></ol>

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+infarction+and+functional+outcome+assessment+in+pigs.">Myocardial infarction and functional outcome assessment in pigs.</a> J. Vis. Exp. (86), (2014).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Total de coração de processamento de tecido do miocárdio 3D de acordo com este protocolo proporciona um método estruturado que permite a análise 3D do enfarte, o IBZ, e as injecções realizadas com respeito à anatomia cardíaca. O volume de enchimento do coração depende da análise desejada. Neste estudo, para avaliar a precisão da injeção, que teve como objetivo preencher o coração para assemelhar-se a geometria diastólica final, tanto quanto possível. Para aplicar este, o apex LV é fixado ao fundo do ...

Doença cardíaca isquêmica tem sido a principal causa de morte no mundo nas últimas décadas 1. O tratamento agudo após enfarte do miocárdio tem como objectivo restaurar o fluxo sanguíneo ao miocárdio através de intervenção coronária percutânea ou enxerto de bypass da artéria coronária. Em infartos graves, uma grande área do miocárdio está cicatrizada, e nestes casos, muitas vezes resultar em insuficiência cardíaca isquêmica (IC) 2. opções de tratamento atuais para foco HF na prevenção e na preservação da função cardíaca dos pacientes com IC, mas não sobre a regeneração. Na última década, terapias regenerativas cardíacos têm sido investigados como uma opção de tratamento para HF 3. Esta terapia tem como objectivo entregar produtos biológicos, tais como células estaminais ou factores de crescimento, directamente para o miocárdio lesionado para induzir revascularização, protecção de cardiomiócitos, a diferenciação, o crescimento e 4. para um óptimoefeito terapêutico, se a hipótese de que a biológica deve ser injectado na zona de fronteira do enfarte (IBZ) para facilitar uma boa perfusão de tecidos para a sobrevivência da biológica e para um efeito óptimo para a zona alvo 5, 6. Várias técnicas têm sido desenvolvidas para realizar a identificação e visualização do IBZ para guiar injecções intramiocárdicos 7, 8, 9, 10, 11. Além identificação e visualização do IBZ, a entrega também depende dos biomateriais e cateteres de injecção utilizados. Para validar a precisão injecção das técnicas de entrega, um método de quantificação precisas e reprodutíveis é necessária. Nós desenvolvemos um protocolo para todo o coração de processamento de tecido do miocárdio que oferece bidimensional (2D) e três dimensional de imagem (3D), o qual pode ser usado para o estudo qualitativo e quantitativo visa. O protocolo abrange o processo de incorporação e da análise de imagem digital. Neste trabalho, nós demonstramos um protocolo para a avaliação da exactidão segmentação de injecções intramiocárdicos na IBZ em um grande modelo porcino de enfarte do miocárdio crónicas.

<table><tbody><tr><td>0.9% Saline</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Roche Diagnostics</td><td></td><td>Scientific grade multipurpose agar</td></tr><tr><td>Biomolecular fluorescence scanner Typhoon 9410&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Embedding container</td><td></td><td></td><td>Plastic, dimensions 17 x 14.5 x 14 cm</td></tr><tr><td>FluoSpheres Polystyrene Microspheres</td><td>Invitrogen</td><td>F8834</td><td>red, 10 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Gadolinium</td><td>Gadovist</td><td></td><td>1.0 mmol/mL</td></tr><tr><td>dS 32 channel head coil</td><td>Philips</td><td></td><td>Or similar</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>To insure compatability 2015a or newer</td></tr><tr><td>Meat slicer</td><td>Berkel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myostar injection catheter</td><td>Biosense Webster</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Super paramagnetic iron oxide particles</td><td>Sinerem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triphenyl-tetrazolium chloride</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UPy-PEG10k</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 2-0</td><td>Ethicon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

3d whole-heart myocardial tissue analysis

terapias regenerativas cardíacos visam proteger e reparar o coração ferido em pacientes com doença isquêmica do coração. Por injecção de células estaminais ou outros produtos biológicos que aumentam a angio- ou vasculogénese para a zona de fronteira do enfarte (IBZ), a perfusão de tecido é melhorada, e o miocárdio pode ser protegido de danos adicionais. Para efeito terapêutico máximo, é a hipótese de que a substância regenerativa é melhor entregue ao IBZ. Isso requer injeções precisas e levou ao desenvolvimento de novas técnicas de injeção. Para validar estas novas técnicas, criamos um protocolo de validação com base na análise de tecido do miocárdio. Este protocolo inclui o processamento do tecido do miocárdio do coração de todo-que permite detalhada bidimensional (2D) e análise tridimensional (3D) da anatomia cardíaca e injecções intramiocárdicos. Em um porco, enfarte do miocárdio foi criado por uma 90-min a oclusão da artéria coronária descendente anterior da artéria coronária. Quatro semanas mais tarde, um mixture de um hidrogel com partículas superparamagnéticas de óxido de ferro (SPIOs) e esferas fluorescentes foi injectado no IBZ usando uma abordagem minimamente invasiva endocárdico. 1 h após o procedimento de injecção, o porco foi sujeito a eutanásia, e o coração foi excisado e embebidas em agarose (agar). Depois da solidificação do agar, foram realizadas de imagiologia por ressonância magnética (IRM), o corte do coração, e imagens de fluorescência. Depois de pós-processamento, análise 3D foi realizada para avaliar a precisão da focalização IBZ. Este protocolo fornece um método estruturado e reprodutível de avaliação da precisão de segmentação de injecções intramiocárdicos no IBZ. O protocolo pode ser facilmente utilizado, quando o processamento do tecido cicatricial e / ou de validação da precisão injecção de todo o coração é desejada.

Embedding Tissue Através do processo de incorporação, uma geometria diastólica final semelhante foi estabelecido. O ágar aderido com sucesso ao tecido do coração, permitindo que o tecido a ser cortado no desejado angulação com espessuras iguais (Figura 2A e 2C). Avaliação Scar- e no local da injecção <p class="jove_conten...

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3D Whole-heart Myocardial Tissue Analysis

Este protocolo descreve um novo método para a comparação 3D do tecido do miocárdio todo-coração com a RM. Este é concebido para a avaliação precisa de injecções intramiocárdicos na zona de fronteira do enfarte de um modelo suíno crónica de enfarte do miocárdio.

Análise Tecidos do Miocárdio Whole-coração 3D

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other ...

3d-whole-heart-myocardial-tissue-analysis

Research

JoVE Journal

Medicine

8.7K visualizações.  University Medical Center Utrecht.  Este protocolo descreve um novo método para a comparação 3D do tecido do miocárdio todo-coração com a RM. Este é concebido para a avaliação precisa de injecções intramiocárdicos na zona de fronteira do enfarte de um modelo suíno crónica de enfarte do miocárdio. 

Vídeo: 3D Whole-heart Myocardial Tissue Analysis

Ultrasonic Assessment of Myocardial Microstructure

Echocardiography is a widely accessible imaging modality that is commonly used to noninvasively characterize and quantify changes in cardiac structure and function. Ultrasonic assessments of cardiac tissue can include analyses of backscatter signal intensity within a given region of interest. Previously established techniques have relied predominantly on the integrated or mean value of backscatter signal intensities, which may be susceptible to variability from aliased data from low frame rates and time delays for algorithms based on cyclic variation. Herein, we describe an ultrasound-based imaging algorithm that extends from previous methods, can be applied to a single image frame&#160;and accounts for the full distribution of signal intensity values derived from a given myocardial sample. When applied to representative mouse and human imaging data, the algorithm distinguishes between subjects with and without exposure to chronic afterload resistance. The algorithm offers an enhanced surrogate measure of myocardial microstructure and can be performed using open-access image analysis software.

Echocardiography is commonly used to noninvasively characterize and quantify changes in cardiac structure and function. We describe an ultrasound-based imaging algorithm that offers an enhanced surrogate measure of myocardial microstructure and can be performed using open-access image analysis software.

Avaliação ultrassônica da microestrutura miocárdio

Echocardiography is a widely accessible imaging modality that is commonly used to noninvasively characterize and quantify changes in cardiac structure and ...

Medicina

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.

In Vivo quantitativa Avaliação da Estrutura do miocárdio, função, perfusão e viabilidade Usando Cardiac Micro-Tomografia Computadorizada

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Bioengenharia

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in cardiac injury, primarily in the form of an acute myocardial infarction. With little resilience following injury, the once healthy cardiac tissue will be replaced by fibrous, non-contractile scar tissue and often be a prelude to heart failure. To identify novel treatment options in regenerative medicine, research has focused on vertebrates with innate regenerative capabilities. One such model organism is the neonatal mouse, which responds to cardiac injury with robust myocardial regeneration. In order to induce an injury in the neonatal mouse that is clinically relevant, we have developed a surgery to occlude the left anterior descending artery (LAD), mirroring a myocardial infarction triggered by atherosclerosis in the human heart. When matched with the technology to track changes both within cardiomyocytes and non-myocyte populations, this model provides us with a platform to identify the mechanisms that guide heart regeneration. Gaining insight into changes in cardiac cell populations following injury once relied heavily on methods such as tissue sectioning and histological examination, which are limited to two-dimensional analysis and often damage the tissue in the process. Moreover, these methods lack the ability to trace changes in cell lineages, instead providing merely a snapshot of the injury response. Here, we describe how technologically advanced methods in lineage tracing models, whole organ clearing, and three-dimensional (3D) whole-mount microscopy can be used to elucidate mechanisms of cardiac repair. With our protocol for neonatal mouse myocardial infarction surgery, tissue clearing, and 3D whole organ imaging, the complex pathways that induce cardiomyocyte proliferation can be unraveled, revealing novel therapeutic targets for cardiac regeneration.

Cardiomyocyte proliferation following injury is a dynamic process that requires a symphony of extracellular cues from non-myocyte cell populations. Utilizing lineage tracing, passive CLARITY, and three-dimensional whole-mount confocal microscopy techniques, we can analyze the influence of a variety of cell types on cardiac repair and regeneration.

Capturando a resposta de lesão cardíaca de populações de células-alvo através de imagens tridimensionais do coração limpo

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

Biologia do Desenvolvimento

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. Human-induced pluripotent stem-cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs), human cardiac fibroblasts (HCFs), and human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) are isolated and used to generate a cell suspension with 70% iPSC-CMs, 15% HCFs, and 15% HUVECs. They are co-cultured in an ultra-low attachment "hanging drop" system, which contains micropores for condensing hundreds of spheroids at one time. The cells aggregate and spontaneously form beating spheroids after 3 days of co-culture. The spheroids are harvested, seeded into a novel mold cavity, and cultured on a shaker in the incubator. The spheroids become a mature functional tissue approximately 7 days after seeding. The resultant multilayered tissues consist of fused spheroids with satisfactory structural integrity and synchronous beating behavior. This new method has promising potential as a reproducible and cost-effective method to create engineered tissues for the treatment of heart failure in the future.

This protocol describes a net mold-based method to create three-dimensional scaffold-free cardiac tissues with satisfactory structural integrity and synchronous beating behavior.

Um método baseado em molde líquido de criação livre de andaime tridimensional de tecido cardíaco

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided a unique opportunity to study the complex interplay among different cardiovascular cell types that drives tissue development and disease. In the area of cardiac tissue models, several sophisticated three-dimensional (3D) approaches use induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) to mimic physiological relevance and native tissue environment with a combination of extracellular matrices and crosslinkers. However, these systems are complex to fabricate without microfabrication expertise and require several weeks to self-assemble. Most importantly, many of these systems lack vascular cells and cardiac fibroblasts that make up over 60% of the nonmyocytes in the human heart. Here we describe the derivation of all three cardiac cell types from iPSCs to fabricate cardiac microtissues. This facile replica molding technique allows cardiac microtissue culture in standard multi-well cell culture plates for several weeks. The platform allows user-defined control over microtissue sizes based on initial seeding density and requires less than 3 days for self-assembly to achieve observable cardiac microtissue contractions. Furthermore, the cardiac microtissues can be easily digested while maintaining high cell viability for single-cell interrogation with the use of flow cytometry and single-cell RNA sequencing (scRNA-seq). We envision that this in vitro model of cardiac microtissues will help accelerate validation studies in drug discovery and disease modeling.

Here, we describe an easy-to-use methodology to generate 3D self-assembled cardiac microtissue arrays composed of pre-differentiated human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells. This user-friendly and low cell requiring technique to generate cardiac microtissues can be implemented for disease modeling and early stages of drug development.

Fabricação de matrizes microtissue cardíacas 3D usando Cardiomiócitos derivados do iPSC humano, fibroblastos cardíacos e células endoteliais

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

Desenvolvimento de tecido cardíaco humano organizado 3D dentro de uma plataforma microfluida

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...

Tissue Preparation Techniques for Contrast-Enhanced Micro Computed Tomography Imaging of Large Mammalian Cardiac Models with Chronic Disease

Structural remodeling is a common consequence of chronic pathological stresses imposed on the heart. Understanding the architectural and compositional properties of diseased tissue is critical to determine their interactions with arrhythmic behavior. Microscale tissue remodeling, below the clinical resolution, is emerging as an important source of lethal arrhythmia, with high prevalence in young adults. Challenges remain in obtaining high imaging contrast at sufficient microscale resolution for preclinical models, such as large mammalian whole hearts. Moreover, tissue composition-selective contrast enhancement for three-dimensional high-resolution imaging is still lacking. Non-destructive imaging using micro-computed tomography shows promise for high-resolution imaging. The objective was to alleviate sufferance from X-ray over attenuation in large biological samples. Hearts were extracted from healthy pigs (N = 2), and sheep (N = 2) with either induced chronic myocardial infarction and fibrotic scar formation or induced chronic atrial fibrillation. Excised hearts were perfused with: a saline solution supplemented with a calcium ion quenching agent and a vasodilator, ethanol in serial dehydration, and hexamethyldisilizane under vacuum. The latter reinforced the heart structure during air-drying for 1 week. Collagen-dominant tissue was selectively bound by an X-ray contrast-enhancing agent, phosphomolybdic acid. Tissue conformation was stable in air, permitting long-duration microcomputed tomography acquisitions to obtain high-resolution (isotropic 20.7 &#181;m) images. Optimal contrast agent loading by diffusion showed selective contrast enhancement of the epithelial layer and sub-endocardial Purkinje fibers in healthy pig ventricles. Atrial fibrillation (AF) hearts showed enhanced contrast accumulation in the posterior walls and appendages of the atria, attributed to greater collagen content. Myocardial infarction hearts showed increased contrast selectively in regions of cardiac fibrosis, which enabled the identification of interweaving surviving myocardial muscle fibers. Contrast-enhanced air-dried tissue preparations enabled microscale imaging of the intact large mammalian heart and selective contrast enhancement of underlying disease constituents.

Here, we present a protocol to obtain high resolution micro computed tomography images of healthy and pathological large mammalian whole hearts with collagen-selective contrast enhancement.

Técnicas de preparação de tecidos para imagens de tomografia microcomputante aprimorada de contraste de grandes modelos cardíacos de mamíferos com doença crônica

Structural remodeling is a common consequence of chronic pathological stresses imposed on the heart. Understanding the architectural and compositional ...

Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart

Both genetic and non-genetic cardiac diseases can cause severe remodeling processes in the heart. Structural remodeling, such as collagen deposition (fibrosis) and cellular misalignment, can affect electrical conduction, introduce electromechanical dysfunctions and, eventually, lead to arrhythmia. Current predictive models of these functional alterations are based on non-integrated and low-resolution structural information. Placing this framework on a different order of magnitude is challenging due to the inefficacy of standard imaging methods in performing high-resolution imaging in massive tissue. In this work, we describe a methodological framework that allows imaging of whole mouse hearts with micrometric resolution. The achievement of this goal has required a technological effort where advances in tissue transformation and imaging methods have been combined. First, we describe an optimized CLARITY protocol capable of transforming an intact heart into a nanoporous, hydrogel-hybridized, lipid-free form that allows high transparency and deep staining. Then, a fluorescence light-sheet microscope able to rapidly acquire images of a mesoscopic field of view (mm-scale) with the micron-scale resolution is described. Following the mesoSPIM project, the conceived microscope allows the reconstruction of the whole mouse heart with micrometric resolution in a single tomographic scan. We believe that this methodological framework will allow clarifying the involvement of the cytoarchitecture disarray in the electrical dysfunctions and pave the way for a comprehensive model that considers both the functional and structural data, thus enabling a unified investigation of the structural causes that lead to electrical and mechanical alterations after the tissue remodeling.

We report a method for mesoscopic reconstruction of the whole mouse heart by combining new advancements in tissue transformation and staining with the development of an axially scanned light-sheet microscope.

Imagem óptica mesoscópica do coração de todo o rato

Both genetic and non-genetic cardiac diseases can cause severe remodeling processes in the heart. Structural remodeling, such as collagen deposition ...

Biologia

Mixed Reality Technology and Three-Dimensional Printing in Teaching: Heart Anatomy as an Example

Mixed reality technology and three-dimensional (3D) printing are becoming more and morecommon in the field of medicine. During the COVID-19 pandemic and immediately after the restrictions had beeneased, many innovations were implemented in the teaching of future doctors. There was also interest in immersive techniques and 3D printing technology in anatomy teaching. However, these are not common implementations. In 2023, 3D prints and holograms in mixed reality technology were prepared for classes focused on the structure of the heart. They were used to teach students, who, with the support of engineers, could learn about the detailed structure of the heart and familiarize themselves with the new technologies that support the traditional model of learning on human cadavers. Students findthis possibility to be highly valuable. The article presents the process of preparing materials for classes and further implementation possibilities. The authors see an opportunity for the development of the presented technologies in students'teaching at various levels of education and the justification for increasingly widespread implementation.

Here, we describe a protocol for constructing a heart model from scratch based on computed tomography and present it to medical students using three-dimensional (3D) printing and mixed reality technology to learn anatomy.

Mixed reality technology and three-dimensional (3D) printing are becoming more and morecommon in the field of medicine. During the COVID-19 pandemic and ...

Análise 3D abrangente de corações humanos de micro a macro escalas

Pipeline for Multi-Scale Three-Dimensional Anatomic Study of the Human Heart

Detailed study of non-failing human hearts rejected for transplantation provides a unique opportunity to perform structural analyses across microscopic and macroscopic scales. These techniques include tissue clearing (modified immunolabeling-enabled three-dimensional (3D) imaging of solvent-cleared organs) and immunohistochemical staining. Mesoscopic examination procedures include stereoscopic dissection and micro-computed tomographic (CT) scanning. Macroscopic examination procedures include gross dissection, photography (including anaglyphs and photogrammetry), CT, and 3D printing of the physically or virtually dissected or whole heart. Before macroscopic examination, pressure-perfusion fixation may be performed to maintain the 3D architecture and physiologically relevant morphology of the heart. The application of these techniques in combination to study the human heart is unique and crucial in understanding the relationship between distinct anatomic features such as coronary vasculature and myocardial innervation in the context of the 3D architecture of the heart. This protocol describes the methodologies in detail and includes representative results&#160;to illustrate progress in the research of human cardiac anatomy.

Autor em destaque: Avançando a anatomia cardíaca humana por meio da análise multiescala de corações

This protocol presents a comprehensive pipeline to analyze samples obtained from human hearts that span the microscopic and macroscopic scales.

Pipeline para estudo anatômico tridimensional em várias escalas do coração humano

Detailed study of non-failing human hearts rejected for transplantation provides a unique opportunity to perform structural analyses across microscopic ...