Name: 3d whole-heart myocardial tissue analysis
Uploaded: 2017-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
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著者は、動物実験とその支援のためマーライン・ジャンセン、ジョイスフィッセル、およびマルタインバンNieuwburgに感謝したいと思います。我々は大幅にMRI画像とその支援のためマルタインFroelingとアンケ・ウォッシンク認めます。

in vivoでの実験は、実験動物研究所により調製実験動物の管理と使用に関する指針に従って実施しました。実験は、地元の動物実験委員会によって承認されました。 注射と埋め込みソリューションの調製<ol><li>注射用ゲルを準備します。 <ol><li>前述のプロトコル12,13に応じてウレイド-ピリミジノン（UPy）ゲル1mLのを準備します。 </li><li> 15μgの/ mLの濃度を取得し、均一な分布のために5分間混合物を撹拌した溶液に超常磁性酸化鉄粒子（SPIOs）を加えます。 </li><li>万個のビーズ/ mLの濃度を取得し、均一な分布のために5分間混合物を撹拌した溶液に、蛍光マイクロビーズを加えます。 </li><li>暗い環境で得られた混合物を室温で保管してください。暖かく、ボルテックスまたは攪拌トンまもなく注入手順の前に、彼は、ソリューション。 </li></ol></li><li>埋め込みソリューションを準備します。 <ol><li>室温で水道水で開始し、4重量％の濃度になるようにアガロース（寒天）を加えます。 </li><li>ゆっくりマイクロ波オーブンを用いて沸点まで溶液を加熱し、加熱中に頻繁に撹拌しました。沸点に達すると、店舗及び閉じ込められた空気が表面にできるように2時間70℃以上の寒天溶液を保ちます。 </li><li>寒天は、埋め込み時まで50〜60℃の間の温度に室温で冷却することを可能にします。 </li></ol></li></ol> 2.注入手順<ol><li>以前に14を説明したように、前投薬（抗不整脈薬、抗血小板療法、および鎮痛薬）、麻酔、静脈アクセス、及び挿管を行います。 </li><li>心筋内注入カテーテル（ 材料の表 ） を使用して注射を行います。各注入、0の場合。混合物の2mLを注射器を用いて約0.3 mL /分の一定速度で1回のボーラスで注入されます。 IBZ 12に沿った異なる位置で注射を置きます。 </li><li>前に動物を安楽死へのガドリニウムベースの造影剤15分の0.2ミリリットル/キログラム（1.0ミリモル/ ml）を投与します。 </li><li>静脈内に動物を安楽死させるために7.5％の塩化カリウムを20mLの管理。 </li><li> Koudstaal らによって記載されているように、8.3 -プロトコルは8.2ステップ以下縦隔のアクセスを確保します。 14。右心房から下大静脈5センチカットし、吸引装置で流出血液を除去。心を切除し、室温で0.9％生理食塩水でそれをすすいでください。 </li></ol> 3.埋め込み手順<ol><li>心の準備をします。 <ol><li>そのまま心房と心室を維持しながら、心臓から心膜を削除します。 ±1センチメートルKlinkenbergを用いて大動脈弁の上に上行大動脈を解剖はさみ。心房から下大静脈に±1cmにカットして、肺静脈のために同じことを行います。 </li><li>プラスチック包埋容器（17×15×15センチ、幅×奥行×高さ）の埋め込み中に心臓の浮上を防止するために、2-0縫合糸を用いた（ 図1A）の底部に心尖を縫合。 </li><li>心を中心とすることを確認し、容器（ 図1B）の壁に触れていない、2-0を使用して容器のリムに大動脈の残りの部分を縫合。 </li></ol></li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54974/54974fig1.jpg" /> 図1：概要図と埋め込みコンテナの写真。 （A）埋め込み処理の概略図。心臓（赤色）が縫合糸を使用して、コンテナ（青）に固定されます。寒天液で心を満たした後、心臓の周囲の空間が満たされています。最後に、2本の剛性プラスチックチューブ（黄色）は、画像登録時の基準として機能するように、心臓に接触次へではなく、容器内に配置されています。 （B）埋め込み容器内に固定心臓の写真。縫合糸は、蚊のクランプを使用して、容器のリムにクランプされます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54974/54974fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="2"><li>拡張末期のような形状で心を埋め込みます。 注：気泡生成の防止が必要です。大空気は寒天溶液中に存在する気泡場合、気泡が表面にできるように、40℃で、寒天を保ちます。 <ol><li>蚊のクランプを使用して静脈下大をクランプします。右心房と心室の両方が完全に満たされるまで、ゆっくりと優れた大静脈血管を介して右心房に50-mLのシリンジを用いて液体寒天を注入します。 </li><li> mosquitを使用して肺静脈をクランプOクランプ。穏やかに大動脈弁を通して逆行寒天を充填した50mLのシリンジを通過させます。 LVおよび左心房が完全に満たされるまで、ゆっくりと左心室（LV）中の溶液を注入します。 LVを充填した後、LVに寒天を保つために大動脈をクランプします。 </li><li>心が完全に覆われるまで容器に残った寒天を注ぎます。後で画像登録（ 図1A）のための参照構造として機能する埋め込み容器内に2本の剛性プラスチックチューブを置き。チューブは、コンテナや心臓の壁に触れないようにしてください。 </li><li> 7°C - 寒天は2で固化してみましょう。 </li></ol></li></ol> 4.画像取得<ol><li>容器の中に埋め込まれた心臓の横断ex vivoで MRIスキャンを実行します。 <ol><li>頭部コイル内に埋め込まれ、心臓（ 材料の表 ）を有する容器を置き。 </li><li>スライスは、容器の底に平行Angulate。つかいます各ex vivoでのMRIシーケンスで同じ向きと角度。 </li><li>心筋を視覚化するために、流体減衰反転回復以下のパラメータを有する（FLAIR）配列行う：繰り返し時間[TR] /エコー時間[TE] = 10秒/ 140秒、フリップ角= 90°、画素サイズ= 0.5×0.5 MM、ビュー[FOV] = 169 X 169ミリメートルの分野、320×320のマトリックス、及び3mmのスライス厚。 </li><li> [TR] / [TE] = 5.53 MS / 1.69ミリ秒、フリップ角= 25°、ピクセルサイズ= 1.0×1.0ミリメートル、[：心筋梗塞を視覚化するために、以下のパラメータで後期ガドリニウム増強（LGE）シーケンスを実行FOV = 169 X 169ミリメートル、176×176のマトリックス、及び3mmのスライス厚。 </li><li> - 24.6ミリ秒、フリップ角= 15°、画素[TR] / [TE] = 88.7 MS / 1.9の範囲が15に等しく分布のTE：SPIOsを視覚化するために、以下のパラメータを用いてT2 *強調グラディエントエコーシーケンスを実行サイズ= 0.5×0.5 mmで、[FOV] = 169 X 169ミリメートル、320×320のマトリックス、及び3mmのスライス厚。 </li></ol></li><li>組織プロセスへ歌う<ol><li>逆さま容器を回して容器から、心臓を含む、固体寒天溶液を除去するために、寒天と容器の側面との間の空気を可能にします。固体寒天からプラスチック製の棒を取り外します。 </li><li>セクションスライサーを用いて心臓の基部の頂点から5 mmのスライスにおける心臓を含む寒天ブロック。寒天ブロックの底部と平行に切断することによって取得されたMR画像と同じカットスライスの角度を保ちます。 </li><li> 37℃での0.9％生理食塩水に溶解した2,3,5- triphenyltetrazoliumchloride（TTC）の1重量％で15分間（心臓を含む）寒天切片を染色し、垂直ビューから両側のスライスを撮影する（ 図2A）。次に、慎重に0.9％生理食塩水でスライスをすすぎます。 注：本研究では、適切なレンズ/目的としたデジタル一眼レフのセットアップ、三脚、かつ均一な照明を使用しました。しかし、写真だけで傷領域の評価のための制御を務め、私たちは、さまざまな設定を使用することもできました。 </li></ol></li><li>蛍光イメージング 注：あるので、選択された励起レーザー蛍光マイクロビーズの励起波長および発光波長に応じて、（ 例えば、ここで使用される赤のマイクロビーズを、それぞれ580 nmおよび605 nmでの励起および発光波長を有しているが、適切なフィルタブロックと励起レーザーを選択バンドパスフィルタは、532nmで、30分の580 nmおよび30分の610 nmで、それぞれ）に設定しました。 <ol><li>可変モードスキャナの蛍光モードイメージングを選択します。 430 Vまたは同等の光電子増倍管と100×100ミクロンの画素サイズを設定します。蛍光マイクロビーズの励起波長に最も近い励起レーザー（532 nm）を選択します。 </li><li>第一のフィルタブロックについて、注入蛍光ビーズ（チャネル1）の発光波長と重複するバンドパスフィルタ（30分の580 nm）を選択します。すなわち外側の第2フィルタ・ブロック（30分の610）のためのバンドパスフィルタを選択ミッション波長（チャンネル2）。 注：第二フィルタブロックが無傷の注射部位を維持しながら自家蛍光を除去するための陰性対照として機能し。 </li><li> 2つのチャネルを用いた可変モードレーザスキャナの蛍光モードで寒天のスライスの両面をスキャンします。各スライスが完全に基準穴を含め、スキャンされていることを確認します。 </li></ol></li></ol> 5.ポスト処理注：画像後処理の最初のステップは、エンド - および心外膜の境界線だけでなく、注射部位をトレースするには、自社開発のスクリプトを使用して心筋の手動セグメンテーションです。これは、MRIおよび蛍光スキャンの両方で同じです。 <ol><li>セグメントMRIスキャンにおける心筋。 <ol><li>セグメントFLAIR MRIシーケンス画像上の心内膜および心外膜のルブ・ボーダーズ。 </li><li> LGE MRIシーケンスに傷ステップ5.1.1からLGE-MRIデータセットおよびセグメントにLVセグメンテーションをコピーします。。 </li><li> LV心筋における*強調データセットとセグメントSPIOの堆積T2にステップ5.1.1から心筋セグメンテーションをコピーします。 </li></ol></li><li>蛍光画像を処理してセグメンテーションを行います。 <ol><li>可変モードスキャナから得られたファイルをロードし、各断面心臓スライスの別の画像を作成します。 </li><li>向きを頂点と頂点から基部に配向されている両方のチャンネルのためにスタックに蛍光画像をソートするベースでスキャンされたスライスを裏返し。 </li><li>蛍光画像上のセグメント心内膜および心外膜のルブ・ボーダーズ。 </li><li>蛍光画像上で手動セグメント瘢痕および瘢痕の形態を確認するために、LGE-MRIスキャン及び写真を使用。 </li><li>自己蛍光を除外するために、チャネル1の画像スタックからチャネル2の画像スタックを引きます。手動セグメント蛍光マイクロビーズ沈着、確認のためにT2 *画像を使用しています。 </li></ol></li><li>作成するには解剖学的に正しい3Dジオメトリは、参照構造（硬質管によって作成された穴）に基づく画像スタック内のスライスの剛体位置合わせを行います。各画像の適用並進及び回転を計算して格納します。 </li><li>画像スタックとセグメンテーションに格納された変換を適用します。直線元のスライス厚を再構築し、データの3Dモデルを作成するために、スライスの両側のセグメンテーションを補間します。 </li></ol> 6.分析<ol><li>注入精度を評価するために、注射部位とIBZの中心間距離の2Dおよび/または3D測定を行います。 LVセグメンテーションの心内膜の境界線に沿った距離を測定します。 図2C及び2Fに、2Dおよび3D測定の例は、赤線で示されています。 </li></ol>

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著者は、開示することは何もありません。

このプロトコルによれば、全心臓の3D心筋組織の処理は、梗塞、IBZ、心臓の解剖学的構造に対して行わ注射の3次元解析を可能にする構造化された方法を提供します。心臓の充填量は、所望の分析に依存します。本研究では、注入精度を評価するために、我々はできるだけ密接に拡張末期形状に似ていると心を埋めることを目的としました。これを強制するために、LVの頂点は、容器の底部に?...

虚血性心疾患は、過去数十年の1のために死の世界の主要な原因となっていました。心筋梗塞後の急性期治療は、経皮的冠動脈インターベンションまたは冠動脈バイパス術を経由して 、心筋への血流を回復することを目指しています。重度の梗塞では、心筋の大面積が傷され、これらのケースは、多くの場合、虚血性心不全（HF）2をもたらします。 HF予防に焦点を当て、HF患者の心機能の維持のための現在の治療選択肢ではなく、再生に関する。 この10年間、心臓再生治療は、HF 3のための治療選択肢として検討されています。この治療法は、血管再生、心筋細胞の保護、分化を誘導するために、直接怪我を心筋には、そのような幹細胞や成長因子などの生物学的製剤を、提供することを目指し、成長4。最適のための治療効果は、生物は、生物の生存のために、ターゲット・ゾーン5,6に最適な効果のための良好な組織灌流を容易にするために、梗塞境界域（IBZ）に注入されなければならないと仮定されます。複数の技術は、心筋内注射の7、8、9、10、11を案内するIBZの識別および可視化を行うために開発されてきました。 IBZの識別および可視化に加えて、送達も使用生体材料および注入カテーテルに依存しています。送達技術の噴射精度を検証するために、正確かつ再現可能な定量方法が要求されます。 我々は、全心臓の心筋組織の2次元（2D）を提供しています処理と三dimensioためのプロトコルを開発しました定性的および定量的研究のために使用することができるNAL（3D）イメージングは​​、目的としています。プロトコルは、埋め込み処理及びデジタル画像解析をカバーします。本稿では、慢性心筋梗塞の大ブタモデルにおけるIBZにおける心筋内注射の標的に正確さを評価するためのプロトコルを示しています。

<table><tbody><tr><td>0.9% Saline</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Roche Diagnostics</td><td></td><td>Scientific grade multipurpose agar</td></tr><tr><td>Biomolecular fluorescence scanner Typhoon 9410&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Embedding container</td><td></td><td></td><td>Plastic, dimensions 17 x 14.5 x 14 cm</td></tr><tr><td>FluoSpheres Polystyrene Microspheres</td><td>Invitrogen</td><td>F8834</td><td>red, 10 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Gadolinium</td><td>Gadovist</td><td></td><td>1.0 mmol/mL</td></tr><tr><td>dS 32 channel head coil</td><td>Philips</td><td></td><td>Or similar</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>To insure compatability 2015a or newer</td></tr><tr><td>Meat slicer</td><td>Berkel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myostar injection catheter</td><td>Biosense Webster</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Super paramagnetic iron oxide particles</td><td>Sinerem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triphenyl-tetrazolium chloride</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UPy-PEG10k</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 2-0</td><td>Ethicon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

3d whole-heart myocardial tissue analysis

心臓再生治療は、虚血性心疾患の患者で負傷心を保護し、修復することを目指しています。幹細胞または梗塞境界域（IBZ）にangio-又は脈管形成を増強する他の生物学的製剤を注入することにより、組織灌流が向上し、心筋をさらなる損傷から保護することができます。最大の治療効果を得るために、再生物質が最高IBZに配信されると仮定されます。これは、正確な注射を必要とし、新たな注入技術の開発につながっています。これらの新しい技術を検証するために、我々は、心筋組織の分析に基づいて検証プロトコルを設計しています。このプロトコルは、詳細な二次元（2D）および心臓の解剖学的構造と心筋内注射の3次元（3D）解析を可能にする全心臓の心筋組織処理を含みます。ブタにおいて、心筋梗塞は、左冠動脈前下行枝の90分間の閉塞により作成されました。 4週間後、MIXT超常磁性酸化鉄粒子（SPIOs）および蛍光ビーズを有するヒドロゲルのUREは、低侵襲性心内膜アプローチを使用して、IBZに注入しました。 1時間の注入手順の後、ブタを安楽死させ、心臓を切除し、アガロース中に埋め込まれた（寒天）。寒天が固化した後に、磁気共鳴画像（MRI）、心臓のスライス、および蛍光イメージングを行いました。画像後処理後、3D分析がIBZターゲティング精度を評価するために行きました。このプロトコルは、IBZ中への心筋内注射のターゲティング精度の評価のための構造と再現性のある方法を提供します。瘢痕組織および/または心臓全体の噴射精度の検証の処理が望まれる場合にプロトコルを容易に使用することができます。

組織の埋め込み埋め込みプロセスを介して、拡張終期のような幾何学的形状は、確立されました。寒天は、正常等しいスライス厚（ 図2Aおよび2C）で所望の角度でスライスされるべき組織を可能にする、心臓組織に接着します。 Scar-と注射部位の評価<p ...

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3D Whole-heart Myocardial Tissue Analysis

このプロトコルは、MRIと全心心筋組織の3次元比較するための新規な方法を説明します。これは、心筋梗塞の慢性ブタモデルの梗塞境界域における心筋内注射の正確な評価のために設計されています。

3Dホール・ハート心筋組織の分析

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other ...

3d-whole-heart-myocardial-tissue-analysis

Research

JoVE Journal

Medicine

8.7K ビュー.  University Medical Center Utrecht. このプロトコルは、MRIと全心心筋組織の3次元比較するための新規な方法を説明します。これは、心筋梗塞の慢性ブタモデルの梗塞境界域における心筋内注射の正確な評価のために設計されています。 

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Ultrasonic Assessment of Myocardial Microstructure

Echocardiography is a widely accessible imaging modality that is commonly used to noninvasively characterize and quantify changes in cardiac structure and function. Ultrasonic assessments of cardiac tissue can include analyses of backscatter signal intensity within a given region of interest. Previously established techniques have relied predominantly on the integrated or mean value of backscatter signal intensities, which may be susceptible to variability from aliased data from low frame rates and time delays for algorithms based on cyclic variation. Herein, we describe an ultrasound-based imaging algorithm that extends from previous methods, can be applied to a single image frame&#160;and accounts for the full distribution of signal intensity values derived from a given myocardial sample. When applied to representative mouse and human imaging data, the algorithm distinguishes between subjects with and without exposure to chronic afterload resistance. The algorithm offers an enhanced surrogate measure of myocardial microstructure and can be performed using open-access image analysis software.

Echocardiography is commonly used to noninvasively characterize and quantify changes in cardiac structure and function. We describe an ultrasound-based imaging algorithm that offers an enhanced surrogate measure of myocardial microstructure and can be performed using open-access image analysis software.

心筋微細構造の超音波評価

Echocardiography is a widely accessible imaging modality that is commonly used to noninvasively characterize and quantify changes in cardiac structure and ...

医学

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.

心筋の構造、機能の in vivo定量的評価では 、灌流および生存率は、心臓マイクロコンピュータ断層撮影法を使用しました

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

生物工学

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in cardiac injury, primarily in the form of an acute myocardial infarction. With little resilience following injury, the once healthy cardiac tissue will be replaced by fibrous, non-contractile scar tissue and often be a prelude to heart failure. To identify novel treatment options in regenerative medicine, research has focused on vertebrates with innate regenerative capabilities. One such model organism is the neonatal mouse, which responds to cardiac injury with robust myocardial regeneration. In order to induce an injury in the neonatal mouse that is clinically relevant, we have developed a surgery to occlude the left anterior descending artery (LAD), mirroring a myocardial infarction triggered by atherosclerosis in the human heart. When matched with the technology to track changes both within cardiomyocytes and non-myocyte populations, this model provides us with a platform to identify the mechanisms that guide heart regeneration. Gaining insight into changes in cardiac cell populations following injury once relied heavily on methods such as tissue sectioning and histological examination, which are limited to two-dimensional analysis and often damage the tissue in the process. Moreover, these methods lack the ability to trace changes in cell lineages, instead providing merely a snapshot of the injury response. Here, we describe how technologically advanced methods in lineage tracing models, whole organ clearing, and three-dimensional (3D) whole-mount microscopy can be used to elucidate mechanisms of cardiac repair. With our protocol for neonatal mouse myocardial infarction surgery, tissue clearing, and 3D whole organ imaging, the complex pathways that induce cardiomyocyte proliferation can be unraveled, revealing novel therapeutic targets for cardiac regeneration.

Cardiomyocyte proliferation following injury is a dynamic process that requires a symphony of extracellular cues from non-myocyte cell populations. Utilizing lineage tracing, passive CLARITY, and three-dimensional whole-mount confocal microscopy techniques, we can analyze the influence of a variety of cell types on cardiac repair and regeneration.

クリアされた心臓3次元イメージングによる標的細胞集団の心臓損傷応答のキャプチャ

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

発生生物学

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. Human-induced pluripotent stem-cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs), human cardiac fibroblasts (HCFs), and human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) are isolated and used to generate a cell suspension with 70% iPSC-CMs, 15% HCFs, and 15% HUVECs. They are co-cultured in an ultra-low attachment "hanging drop" system, which contains micropores for condensing hundreds of spheroids at one time. The cells aggregate and spontaneously form beating spheroids after 3 days of co-culture. The spheroids are harvested, seeded into a novel mold cavity, and cultured on a shaker in the incubator. The spheroids become a mature functional tissue approximately 7 days after seeding. The resultant multilayered tissues consist of fused spheroids with satisfactory structural integrity and synchronous beating behavior. This new method has promising potential as a reproducible and cost-effective method to create engineered tissues for the treatment of heart failure in the future.

This protocol describes a net mold-based method to create three-dimensional scaffold-free cardiac tissues with satisfactory structural integrity and synchronous beating behavior.

スキャフォールド フリー三次元心筋組織構築純金型ベース方式

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided a unique opportunity to study the complex interplay among different cardiovascular cell types that drives tissue development and disease. In the area of cardiac tissue models, several sophisticated three-dimensional (3D) approaches use induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) to mimic physiological relevance and native tissue environment with a combination of extracellular matrices and crosslinkers. However, these systems are complex to fabricate without microfabrication expertise and require several weeks to self-assemble. Most importantly, many of these systems lack vascular cells and cardiac fibroblasts that make up over 60% of the nonmyocytes in the human heart. Here we describe the derivation of all three cardiac cell types from iPSCs to fabricate cardiac microtissues. This facile replica molding technique allows cardiac microtissue culture in standard multi-well cell culture plates for several weeks. The platform allows user-defined control over microtissue sizes based on initial seeding density and requires less than 3 days for self-assembly to achieve observable cardiac microtissue contractions. Furthermore, the cardiac microtissues can be easily digested while maintaining high cell viability for single-cell interrogation with the use of flow cytometry and single-cell RNA sequencing (scRNA-seq). We envision that this in vitro model of cardiac microtissues will help accelerate validation studies in drug discovery and disease modeling.

Here, we describe an easy-to-use methodology to generate 3D self-assembled cardiac microtissue arrays composed of pre-differentiated human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, cardiac fibroblasts, and endothelial cells. This user-friendly and low cell requiring technique to generate cardiac microtissues can be implemented for disease modeling and early stages of drug development.

ヒトiPSC由来心筋細胞、心臓線維芽細胞、内皮細胞を用いた3次元心臓ミクロ組織アレイの作製

Generation of human cardiomyocytes (CMs), cardiac fibroblasts (CFs), and endothelial cells (ECs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) has provided ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

マイクロ流体プラットフォーム内での3D組織化ヒト心臓組織の開発

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...

Tissue Preparation Techniques for Contrast-Enhanced Micro Computed Tomography Imaging of Large Mammalian Cardiac Models with Chronic Disease

Structural remodeling is a common consequence of chronic pathological stresses imposed on the heart. Understanding the architectural and compositional properties of diseased tissue is critical to determine their interactions with arrhythmic behavior. Microscale tissue remodeling, below the clinical resolution, is emerging as an important source of lethal arrhythmia, with high prevalence in young adults. Challenges remain in obtaining high imaging contrast at sufficient microscale resolution for preclinical models, such as large mammalian whole hearts. Moreover, tissue composition-selective contrast enhancement for three-dimensional high-resolution imaging is still lacking. Non-destructive imaging using micro-computed tomography shows promise for high-resolution imaging. The objective was to alleviate sufferance from X-ray over attenuation in large biological samples. Hearts were extracted from healthy pigs (N = 2), and sheep (N = 2) with either induced chronic myocardial infarction and fibrotic scar formation or induced chronic atrial fibrillation. Excised hearts were perfused with: a saline solution supplemented with a calcium ion quenching agent and a vasodilator, ethanol in serial dehydration, and hexamethyldisilizane under vacuum. The latter reinforced the heart structure during air-drying for 1 week. Collagen-dominant tissue was selectively bound by an X-ray contrast-enhancing agent, phosphomolybdic acid. Tissue conformation was stable in air, permitting long-duration microcomputed tomography acquisitions to obtain high-resolution (isotropic 20.7 &#181;m) images. Optimal contrast agent loading by diffusion showed selective contrast enhancement of the epithelial layer and sub-endocardial Purkinje fibers in healthy pig ventricles. Atrial fibrillation (AF) hearts showed enhanced contrast accumulation in the posterior walls and appendages of the atria, attributed to greater collagen content. Myocardial infarction hearts showed increased contrast selectively in regions of cardiac fibrosis, which enabled the identification of interweaving surviving myocardial muscle fibers. Contrast-enhanced air-dried tissue preparations enabled microscale imaging of the intact large mammalian heart and selective contrast enhancement of underlying disease constituents.

Here, we present a protocol to obtain high resolution micro computed tomography images of healthy and pathological large mammalian whole hearts with collagen-selective contrast enhancement.

慢性疾患を有する大型哺乳類心臓モデルのコントラスト増強マイクロコンピュータ断層撮影イメージングのための組織調製技術

Structural remodeling is a common consequence of chronic pathological stresses imposed on the heart. Understanding the architectural and compositional ...

Mesoscopic Optical Imaging of Whole Mouse Heart

Both genetic and non-genetic cardiac diseases can cause severe remodeling processes in the heart. Structural remodeling, such as collagen deposition (fibrosis) and cellular misalignment, can affect electrical conduction, introduce electromechanical dysfunctions and, eventually, lead to arrhythmia. Current predictive models of these functional alterations are based on non-integrated and low-resolution structural information. Placing this framework on a different order of magnitude is challenging due to the inefficacy of standard imaging methods in performing high-resolution imaging in massive tissue. In this work, we describe a methodological framework that allows imaging of whole mouse hearts with micrometric resolution. The achievement of this goal has required a technological effort where advances in tissue transformation and imaging methods have been combined. First, we describe an optimized CLARITY protocol capable of transforming an intact heart into a nanoporous, hydrogel-hybridized, lipid-free form that allows high transparency and deep staining. Then, a fluorescence light-sheet microscope able to rapidly acquire images of a mesoscopic field of view (mm-scale) with the micron-scale resolution is described. Following the mesoSPIM project, the conceived microscope allows the reconstruction of the whole mouse heart with micrometric resolution in a single tomographic scan. We believe that this methodological framework will allow clarifying the involvement of the cytoarchitecture disarray in the electrical dysfunctions and pave the way for a comprehensive model that considers both the functional and structural data, thus enabling a unified investigation of the structural causes that lead to electrical and mechanical alterations after the tissue remodeling.

We report a method for mesoscopic reconstruction of the whole mouse heart by combining new advancements in tissue transformation and staining with the development of an axially scanned light-sheet microscope.

マウス心臓全体のメゾスコピック光学イメージング

Both genetic and non-genetic cardiac diseases can cause severe remodeling processes in the heart. Structural remodeling, such as collagen deposition ...

生物学

Mixed Reality Technology and Three-Dimensional Printing in Teaching: Heart Anatomy as an Example

Mixed reality technology and three-dimensional (3D) printing are becoming more and morecommon in the field of medicine. During the COVID-19 pandemic and immediately after the restrictions had beeneased, many innovations were implemented in the teaching of future doctors. There was also interest in immersive techniques and 3D printing technology in anatomy teaching. However, these are not common implementations. In 2023, 3D prints and holograms in mixed reality technology were prepared for classes focused on the structure of the heart. They were used to teach students, who, with the support of engineers, could learn about the detailed structure of the heart and familiarize themselves with the new technologies that support the traditional model of learning on human cadavers. Students findthis possibility to be highly valuable. The article presents the process of preparing materials for classes and further implementation possibilities. The authors see an opportunity for the development of the presented technologies in students'teaching at various levels of education and the justification for increasingly widespread implementation.

Here, we describe a protocol for constructing a heart model from scratch based on computed tomography and present it to medical students using three-dimensional (3D) printing and mixed reality technology to learn anatomy.

Mixed reality technology and three-dimensional (3D) printing are becoming more and morecommon in the field of medicine. During the COVID-19 pandemic and ...

ミクロスケールからマクロスケールまでの人間の心臓の包括的な3D分析

Pipeline for Multi-Scale Three-Dimensional Anatomic Study of the Human Heart

Detailed study of non-failing human hearts rejected for transplantation provides a unique opportunity to perform structural analyses across microscopic and macroscopic scales. These techniques include tissue clearing (modified immunolabeling-enabled three-dimensional (3D) imaging of solvent-cleared organs) and immunohistochemical staining. Mesoscopic examination procedures include stereoscopic dissection and micro-computed tomographic (CT) scanning. Macroscopic examination procedures include gross dissection, photography (including anaglyphs and photogrammetry), CT, and 3D printing of the physically or virtually dissected or whole heart. Before macroscopic examination, pressure-perfusion fixation may be performed to maintain the 3D architecture and physiologically relevant morphology of the heart. The application of these techniques in combination to study the human heart is unique and crucial in understanding the relationship between distinct anatomic features such as coronary vasculature and myocardial innervation in the context of the 3D architecture of the heart. This protocol describes the methodologies in detail and includes representative results&#160;to illustrate progress in the research of human cardiac anatomy.

著者スポットライト:心臓のマルチスケール分析によるヒト心臓解剖学の進歩

This protocol presents a comprehensive pipeline to analyze samples obtained from human hearts that span the microscopic and macroscopic scales.

ヒト心臓のマルチスケール3次元解剖学的研究のためのパイプライン

Detailed study of non-failing human hearts rejected for transplantation provides a unique opportunity to perform structural analyses across microscopic ...

3Dホール・ハート心筋組織の分析

要約

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心筋微細構造の超音波評価

心筋の構造、機能の in vivo定量的評価では、灌流および生存率は、心臓マイクロコンピュータ断層撮影法を使用しました

クリアされた心臓3次元イメージングによる標的細胞集団の心臓損傷応答のキャプチャ

スキャフォールドフリー三次元心筋組織構築純金型ベース方式

ヒトiPSC由来心筋細胞、心臓線維芽細胞、内皮細胞を用いた3次元心臓ミクロ組織アレイの作製

マイクロ流体プラットフォーム内での3D組織化ヒト心臓組織の開発

慢性疾患を有する大型哺乳類心臓モデルのコントラスト増強マイクロコンピュータ断層撮影イメージングのための組織調製技術

マウス心臓全体のメゾスコピック光学イメージング

Mixed Reality Technology and Three-Dimensional Printing in Teaching: Heart Anatomy as an Example

ヒト心臓のマルチスケール3次元解剖学的研究のためのパイプライン

3Dホール・ハート心筋組織の分析

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心筋微細構造の超音波評価

心筋の構造、機能の in vivo定量的評価では 、灌流および生存率は、心臓マイクロコンピュータ断層撮影法を使用しました

クリアされた心臓3次元イメージングによる標的細胞集団の心臓損傷応答のキャプチャ

スキャフォールド フリー三次元心筋組織構築純金型ベース方式

ヒトiPSC由来心筋細胞、心臓線維芽細胞、内皮細胞を用いた3次元心臓ミクロ組織アレイの作製

マイクロ流体プラットフォーム内での3D組織化ヒト心臓組織の開発

慢性疾患を有する大型哺乳類心臓モデルのコントラスト増強マイクロコンピュータ断層撮影イメージングのための組織調製技術

マウス心臓全体のメゾスコピック光学イメージング

Mixed Reality Technology and Three-Dimensional Printing in Teaching: Heart Anatomy as an Example

ヒト心臓のマルチスケール3次元解剖学的研究のためのパイプライン

心筋の構造、機能の in vivo定量的評価では、灌流および生存率は、心臓マイクロコンピュータ断層撮影法を使用しました

スキャフォールドフリー三次元心筋組織構築純金型ベース方式