This paper is based on work supported by the National Health Research Institutes (NHRI) in Taiwan under the Innovative Research Grant (IRG) (EX105-10523EI), the Taiwan Ministry of Science and Technology (MOST 103-2221-E-001-001-MY2, 104-2221-E-001-015-MY3, 105-2221-E-001-002-MY2), the Academia Sinica Thematic Project (AS-105-TP-A06), and the Research Program in Nanoscience and Nanotechnology. The authors would like to thank Ms. Rachel A. Lucas for proofreading the manuscript.

1. Fabricação do dispositivo micro NOTA: O dispositivo microfluídico inteira é fabricado usando o processo de moldagem suave litografia réplica 13. <ol><li> A fabricação de moldes para as camadas de PDMS no dispositivo de microfluidos <ol><li> Projetar os padrões de canais microfluídicos usando comercialmente disponível ilustração ou desenho de software. Envie o arquivo para uma empresa com alta resolução photomask transparência imprimir 14. </li><li> Bolachas de silício limpas com acetona (≥99.5%), álcool isopropílico (IPA; ≥99.9%), e óxido de etch tamponada (BOE; 6: 1 de NH 4 F.HF). Enxágüe com água deionizada (DI) de água e desidratar o wafer com uma arma de azoto. </li><li> revestimento da rotação de aproximadamente 20 g de material fotosensitivo tom negativo, SU-8 de 2050, para as pastilhas a 500 rpm durante 15 segundos e, em seguida, 2.000 rpm durante 30 seg. NOTA: A condição spin coating deve render SU-8 2050 photoresistir a camadas com uma espessura de aproximadamente 75 um sobre as pastilhas após a litografia óptica. </li><li> coza macio as bolachas sobre uma placa de aquecimento de 65 ° C durante 3 minutos e, em seguida, a 95 ° C durante 9 min. Após a cozer macio, expor as bolachas usando um alinhador de máscara com as máscaras de transparência concebidas sob luz UV; a energia total de exposição deve ser de cerca de 300 mJ / cm 2. coza pós-exposição (PEB) as pastilhas a 65 ° C durante 2 minutos e depois a 95 ° C durante 7 min. </li><li> Depois do PEB, mergulhar os wafers em SU-8 desenvolvedor com forte agitação ou num banho de ultra-sons (37 kHz e 180 W de potência ultra-sônica efetiva) para 7 min. Lavar a bolacha com acetona e IPA para remover o residual SU-8. </li><li> Coloque a bolacha e 100 ul de silano (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltrichlorosilane) para a 6 cm de diâmetro, uma placa de Petri em um exsicador ligado a uma bomba de vácuo de diafragma para silanização superfície da bolacha a fim de evitar ligação indesejável. Ligue a bomba durante 15 minutos, desligue-oE selar o exsicador com vácuo durante 30 min. </li><li> Tome as bolachas silanizadas fora do secador e gravá-los a 15 cm de diâmetro pratos de Petri para o seguinte processo de litografia suave: </li></ol></li><li> Fabricação e montagem de camadas de PDMS <ol><li> Preparação do pré-polímero de PDMS <ol><li> Misture PDMS monómero (base) e o agente de cura a uma proporção de 10: 1 (v / v). Desgaseificar a mistura na configuração exsicador durante 60 min. </li></ol></li><li> Fabrico da camada superior incorporado-PC <ol><li> Transferência de 2 g do PDMS de pré-polímero para o molde com a camada superior padrões de canal de fluidos para fazer uma fina camada de PDMS. Coloque o molde na configuração do secador para desgaseificar as PDMS para 60 min. </li><li> Coloque o molde durante a noite numa estufa a 60 ° C durante PDMS cura. Certifique-se de que o molde está num plano horizontal. </li><li> Arrefecer o molde à temperatura ambiente. Pour um adicional de 13 g de PDMS de pré-polímero para o molde e desgaseificar o PDMS no the configuração do secador durante 60 min. </li><li> Lentamente incorporar um 1 milímetro de filme PC de espessura para a camada de PDMS fresco como uma barreira de difusão de gás; expulsar as bolhas de se necessário. </li><li> Coloque a noite molde no forno a 60 ° C, e certifique-se de que ele está em um plano horizontal. </li><li> Arrefecer os PDMS curadas à temperatura ambiente. Cortar o dispositivo com um bisturi para uma área de aproximadamente 5,5 x 5 cm 2, que podem cobrir todos os padrões de canal, e descolar da laje de PDMS do molde. </li><li> Faça furos para entradas e saídas usando uma biópsia 2 mm de diâmetro. Armazenar a camada de PDMS-PC superior fabricada longe da poeira ambiente para montagem posterior. </li></ol></li><li> Fabricação da camada de PDMS de fundo <ol><li> Pour 11 g do pré-polímero de PDMS para o molde para a camada inferior. Coloque o molde no exsicador para desgaseificar as PDMS para 60 min. Manter o molde durante a noite numa estufa a 60 ° C para curar o PDMS. Certifique-se de que ele está deitado sobre um plano horizontal. </li><li> Arrefecer the PDMS à temperatura ambiente. Cortar o dispositivo a uma área de aproximadamente 5,5 x 5 cm 2, que podem cobrir todos os padrões de canal, e retire-a do molde. Armazenar a camada de PDMS inferior fabricada longe da poeira ambiente para montagem posterior. </li></ol></li><li> Fabricação da membrana PDMS <ol><li> Rotação revestimento aproximado de 4 g de PDMS pré-polímero em uma pastilha em branco silanizada a 100 rpm durante 90 segundos e, em seguida, 3000 rpm durante 4 seg. Assar o wafer revestido-spin em um 60 ° C forno durante a noite. </li></ol></li><li> Montagem do dispositivo <ol><li> Coloque a camada superior PDMS-PC fabricado eo wafer com a membrana PDMS revestido de giro em um O máquina de tratamento de superfície 2 de plasma com as superfícies de ligação virado para cima. Trate as superfícies de PDMS com 90 W de O 2 de plasma para 40 seg. </li><li> Ligar a camada de topo sobre a membrana PDMS logo após o tratamento da superfície no plasma de O 2. Coloque um peso (cerca de 600 g) no topo das camadas ligadas e colocá-los numa60 ° C forno durante a noite para promover a ligação. </li><li> Arrefecer as camadas ligadas a temperatura ambiente e cortar a membrana ligada à camada de topo com um bisturi para uma área de aproximadamente 5,5 x 5 cm 2, que podem cobrir todos os padrões de canal. Descolar a estrutura ligada a partir do wafer de silício e furos nas entradas e saída do canal gradiente químico utilizando uma biópsia mm de diâmetro 2. </li><li> Coloque a camada superior ligada à membrana e a camada inferior PDMS fabricadas na máquina de tratamento de superfície S 2 de plasma, com as superfícies de ligação virado para cima, para activar as superfícies PDMS usando o plasma a 90 W durante 40 seg. </li><li> Anexar as camadas superior e inferior em conjunto para a ligação imediatamente a seguir a tratamento de superfície. Coloque um peso (cerca de 600 g) no topo de todo o dispositivo ligado e colocá-lo num forno de 60 ° C durante a noite. </li><li> Tome todo o dispositivo fabricado fora do forno e esfriar à temperatura ambiente. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Ensaio de migração celular Microfluidic NOTA: Neste trabalho, usamos uma linha comumente usado celular, alveolar celular epitelial basal humana adenocarcinomic (A549), e uma das quimiocinas, factor de células estromais derivadas (SDF-1α), como exemplos. Para os pesquisadores que trabalham em outras células e quimiocinas, por favor ajustar os processos experimentais em conformidade. <ol><li> Dia 0: Preparação de Células <ol><li> Cultura o estoque de células A549 em meio de crescimento completo contendo DMEM F12 substituto de L-glutamina, 10% (v / v) de soro fetal de bovino (FBS), e 1% (v / v) de solução Antimicrob-antimicótico. Sub-cultura por dissociação com 0,25% de tripsina-EDTA. </li><li> Preparar suspensões de células para as experiências por centrifugação células dissociadas a 140 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente. Para as experiências Dispositivo de microfluidos, contar as células utilizando um hemocitómetro e sementes pelo menos 1 x 10 6 células num frasco T75 com 10 ml de completameio de crescimento. NOTA: Todos os processos de cultura de células são realizadas numa incubadora com uma temperatura de 37 ° C e 5% de CO2. </li></ol></li><li> Dia 1: preparação Dispositivo <ol><li> Colocar o aparelho na máquina de plasma de O 2 e tratá-lo com o O 2 no plasma a 90 W durante 40 seg para processar o canal microfluídico superfícies hidrofílicas. </li><li> Imediatamente após o tratamento da superfície, instalar duas agulhas rombas 14 G por inserção directamente as agulhas nos orifícios 2 mm de diâmetro perfurados na camada de PDMS nas entradas dos canais de gradiente químico. Certifique-se de que as agulhas não bloqueiam os canais microfluídicos. Desenhe 0,8 ml de ddH2O utilizando uma seringa de 1 ml com uma agulha G romba 14. Injetar o DDH 2 O para o canal de gradiente químico da tomada até que a água flui para fora de ambas as agulhas nas entradas. </li><li> Prepare 1 ml de solução de fibronectina de 50 ug / ml por diluição da fibronectina com Dulbecco &amp; #39; s Phosphate-Buffered Saline (DPBS). </li><li> Infundir a solução de fibronectina a partir da saída do canal de gradiente químico utilizando uma seringa de 1 ml com uma agulha G 14 sem corte até que a solução flui para fora a partir de ambas as agulhas nas entradas. </li><li> Incubar durante a noite todo o dispositivo numa incubadora de cultura celular convencional. </li></ol></li><li> Imaging semeadura de células e microscopia: Dia 2 <ol><li> sementeira celular <ol><li> Aspirar o meio das células que foram cultivadas desde o dia 0 e lava-se as células com 5 ml de DPBS 2 vezes. Aspirar o DPBS, adicionar 2 ml de tripsina-EDTA, e incuba-se as células na incubadora durante 5 minutos para separar as células da superfície do frasco. </li><li> Esperar até as células são separadas e suspensas na solução e adicionar 8 mL de meio isento de soro (DMEM F12 + 1% (v / v) Antimicrob-antimicótico solução) ao balão. Transferir todo o líquido em um tubo de 15 ml e centrifugar a 140 xg que durante 5 minutos sob temperatura ambiente. </li&gt; <li> Aspirar o sobrenadante após a centrifugação e adicionar uma quantidade adequada do meio isento de soro para fazer a densidade celular final de 1 x 10 6 células / ml. Retire o dispositivo micro preparados no Dia 1. Contar as células usando um hemocitômetro ou outro instrumento de contagem de células automático. </li><li> Injectar meio isento de soro a partir da saída do canal de gradiente químico utilizando uma seringa de 1 ml com uma agulha G 14 sem corte, até o meio flui para fora a partir de ambas as agulhas nas entradas. Injectar 200 ul da suspensão de células a partir da saída do canal de gradiente químico. </li><li> Observar a câmara de cultura celular no dispositivo sob um microscópio para confirmar que as células foram introduzidos para o canal microfluídico. Colocar o dispositivo dentro de um recipiente húmido (por exemplo, uma caixa de plástico com ddH2O para dentro) e mantê-lo numa incubadora de cultura de células durante 5 h para promover a adesão das células na superfície do dispositivo. </li></ol></li><li> Preparação de Reagentos para a geração de gradiente químico <ol><li> Prepara-se o (SDF-1α) químico, na concentração desejada (100 ng / mL) em meio isento de soro. Desenhar a meio isento de soro com ou sem o produto químico em duas separadas 3 ml seringas ligada à tubagem de alta pureza. Defina-se as seringas em uma bomba de seringa com uma taxa de fluxo de 1 mL / min para uso posterior. </li></ol></li><li> Preparação dos reagentes de geração de gradiente de oxigénio <ol><li> Adicione 15 ml de solução de NaOH 1 M e 15 ml de 200 mg / ml de solução de pirogalol. Desenhe a soluções pirogalol NaOH e em duas separadas 15 ml seringas conectadas a tubos de PTFE de alta pureza e tubos de alta pureza, respectivamente. Defina-se as seringas em uma bomba de seringa com velocidade de fluxo de 5 ul / min para uso posterior. </li></ol></li><li> configuração do dispositivo microfluídico <ol><li> Após a incubação de 5 horas, tomar o dispositivo inteiro e colocá-lo em um 15 cm de diâmetro placa de Petri. Fixar o aparelho na placa de Petri com massa adesiva. transferir oUma placa de Petri com um microscópio de imagem de células vivas em um incubador. </li><li> Ligue o tubo a partir das seringas para a geração gradiente químico para as entradas do canal de gradiente químico. Ligue a saída para tubulação que conduz a um reservatório de resíduos. Ligar a bomba de seringa com as seringas para a geração de gradiente químico. </li><li> Ligue a tubagem de alta pureza a partir das seringas contendo NaOH e pirogalol para as entradas do canal de gradiente de oxigénio. Ligar a tubagem à saída para recolher os resíduos. Ligue a bomba de seringa com as seringas para a geração de gradiente de oxigênio. </li><li> Adicionar cerca de 15 ml de ddH2O para a placa de Petri para manter o dispositivo hidratada. Configure o microscópio imagens de células vivas para captura de imagem tempo decorrido, e tirar uma foto a cada 15 minutos. </li></ol></li></ol></li><li> Dia 3: recolha e análise de dados <ol><li> Transfira os arquivos de imagens captadas para um computador. Analisar as imagens usando um uma imagem de código abertosoftware ANÁLISE, ImageJ, com um plugin de código aberto para Rastreio Manual (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html) e um software livre Quimiotaxia Tool (http://ibidi.com/xtproducts / pt / Software-e-imagem-Analysis / manual-imagem-Analysis / Quimiotaxia-and-migration-tool) 15, 16. </li></ol></li></ol> 3. Caracterização dos gradientes NOTA: Os gradientes químicos e oxigénio pode ser caracterizada antes ou após as experiências com células. <ol><li> Simulação numérica do gradiente químico <ol><li> Estimar a natureza de fluxo laminar de microfluídica usando computacionais dinâmica de fluidos de simulação (CFD). </li></ol></li><li> Caracterização experimental do gradiente de oxigênio <ol><li> Preparar um corante fluorescente sensível ao oxigénio, de tris (2,2&#39;-bipiridil) ruténio (III), cloreto de hexa-hidratado, solução em água a uma concentração de 5mg / ml. </li><li> Desenhar a solução corante sensível ao oxigénio em duas separadas 3 ml seringas ligada à tubagem de alta pureza. Defina-se as seringas em uma bomba de seringa com velocidade de fluxo de 1 mL / min (idêntico para os caudais utilizados para a geração de gradiente químico). </li><li> Ligue o tubo a partir das seringas para as entradas do canal de gradiente químico. Ligue a saída para tubulação que conduz a um reservatório de resíduos. Ligar a bomba de seringa com as seringas para a geração de gradiente químico. </li><li> Medir a intensidade de fluorescência utilizando um microscópio invertido de fluorescência com a luz de excitação que passa através de um filtro óptico 470 nm ± 20. Coletar a luz de emissão através de um filtro de emissão de passagem longa 515 nm usando uma câmera CCD legal. </li><li> Ligue a tubagem de alta pureza a partir das seringas contendo NaOH e pirogalol para as entradas do canal de gradiente de oxigénio. Ligar a tubagem à saída para recolher os resíduos. Ligar a bomba de seringa com as seringas para oxigéniogeração de gradiente. </li><li> Recolher as imagens de fluorescência do corante sensível ao oxigénio que flui na câmara de cultura de células. </li><li> Parar o fluxo para a geração de gradiente de oxigênio e desligue toda a tubulação para o canal de geração de oxigênio. Ligar a tubagem de alta pureza a partir dos cilindros de gás para a saída do canal de gradiente de oxigénio. </li><li> Recolher as imagens de fluorescência do corante sensível ao oxigénio que flui na câmara de cultura de células quando flui ar, azoto puro, e oxigénio puro através da tubagem ligada ao canal de gradiente de oxigénio. </li><li> Estimar os gradientes de oxigênio através da análise das imagens de fluorescência usando a equação de Stern-Volmer de acordo com referências 10 e 11. </li></ol></li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Os passos mais críticos para fabricar o PDMS dispositivo de microfluidos com uma película fina de PC incorporado são: (1) expelindo todas as bolhas ao inserir a película de PC em PDMS pré-polímero, enquanto a fabricação da camada de PDMS-PC superior e (2) certificando todos os processos de cura de PDMS são realizadas num plano horizontal bem nivelado. Para as experiências de migração celular, as etapas mais críticas são as seguintes: (1) eliminar as bolhas no interior do dispositivo de microfluidos, de tubos e bombas de seringa durante as experiências; (2) assegurar que o dispositivo de microfluidos é colocado sobre um plano horizontal, bem nivelada durante a imagem de células vivas para a observação a migração celular; e (3) manter o dispositivo hidratada por adição de ddH2O para a placa de Petri durante as experiências e certificando-se de que a água não é seco. De modo a fabricar com sucesso no dispositivo de microfluidos híbrido PDMS-PC sem delaminação, é crítico para remover todas as bolhas durante o PC Fiinserção lm. O filme de PC pode ser lentamente introduzida a partir de um ângulo (cerca de 15 a 30 graus de distância a partir do PDMS de superfície pré-polímero) para evitar a geração de bolhas durante a inserção da película de PC em PDMS pré-polímero. Se necessário, o PDMS inteiros pré-polímero com o filme PC incorporado podem ser colocados no exsicador ligado à bomba de vácuo durante 10 minutos para expelir as bolhas de ar. Se a película de PC flutua para cima depois do processo de vácuo, uma ponta de pipeta pode ser usado para pressionar o filme PC para baixo sobre a camada de PDMS curado. Repita os processos a vácuo e de imprensa, se necessário. Para as experiências em células, a falta de bolhas de ar é crítico para a cultura de células de microfluidos. Certifique-se que não há bolhas de ar são introduzidas em toda a configuração microfluídico (incluindo bombas de seringa, tubos, e o dispositivo microfluídico) ao fazer as conexões. Se as bolhas de ar são criados dentro da instalação de microfluidos, devido à diminuição da solubilidade do gás sob a temperatura elevada da experiments dentro da incubadora, todos os componentes experimentais (incluindo as seringas e tubos) e reagentes (incluindo o meio de crescimento, pirogalhol, e NaOH) pode ser colocado na incubadora de antemão (pelo menos 20 minutos antes do uso) para minimizar a variação de temperatura . Bombas de seringa frequentemente gerar calor a partir da operação dos motores dentro das bombas. Geralmente é aceitável para operar bombas de seringa dentro de incubadoras; No entanto, não verificar a temperatura da incubadora durante os experimentos. Se a temperatura eleva durante as experiências, os procedimentos adicionais de refrigeração precisam de ser realizadas. Vários métodos de arrefecimento viáveis ​​podem ser empregues, tais como a colocação de uma caixa de gelo na incubadora, a redução do número de bombas de seringa colocado no interior da incubadora, ou utilizando uma incubadora com um sistema de arrefecimento força. O dispositivo de cultura de células microfluídicos PDMS-PC desenvolvido neste trabalho é capaz de gerar de forma confiável gradientes químicos e oxigênio perpendiculares foestudos de migração celular r. A limitação do dispositivo desenvolvido é que os perfis de gradiente de oxigénio gerados dependem do equilíbrio entre o fluxo de oxigénio, conduzido por eliminação de reacção química, e a difusão do oxigénio a partir da atmosfera ambiente, através do dispositivo, e para o meio. Como resultado, os perfis de gradiente de oxigénio não pode ser controlada arbitrariamente dentro do dispositivo. Em comparação com plataformas de cultura de células microfluídicos existentes, o dispositivo desenvolvido neste trabalho é o primeiro capaz de realizar estudos de cultura celular sob combinações de gradientes químicos e oxigênio. Todo o dispositivo pode ser fabricado usando o processo convencional de moldagem por litografia macia réplica, sem alinhamento tedioso e instrumentação dispendiosa. Os gradientes podem ser simulado numericamente e experimentalmente caracterizado de proporcionar condições mais fisiológicas microambiente-like para estudos in vitro de células. Ao usar um método de reacção química espacialmente confinado com um filme de um PC como di gásbarreira ffusion, o gradiente de oxigênio pode ser gerada sem o uso de cilindros de gás pressurizado e unidades sofisticadas de controle de fluxo de gás. Além disso, a configuração requer apenas pequenas quantidades de produtos químicos (menos de 10 mL por dia) para manter os gradientes de oxigénio. Uma vez que o controlo da tensão de oxigénio está confinado localmente em torno do canal microfluídico, e não perturba a concentração de oxigénio ambiente, toda a instalação pode ser colocado dentro de uma incubadora de cultura de células convencional, sem adicional de temperatura, humidade, e CO 2 a instrumentação de controlo. Como resultado, o dispositivo desenvolvido tem um grande potencial para ser praticamente utilizado em laboratórios biológicos. Devido a limitações técnicas, comportamentos celulares sob tensões de oxigênio raramente têm sido estudados na literatura existente. Com a ajuda do dispositivo apresentado neste estudo, a cultura celular sob gradientes de oxigénio pode ser realizada de uma maneira fácil, que promove grandemente estudos celulares sob gradientes de oxigénio. Furthermore, um princípio de funcionamento semelhante pode ser aplicada para gerar gradientes de outros gases fisiologicamente relevantes, tais como o dióxido de carbono e óxido nítrico, para a cultura de células em estudos in vitro 17. Esses recursos demonstrar que o PDMS-PC dispositivo micro mostra grande potencial para diversas aplicações de cultura de células, incluindo testes de drogas e proliferação celular e ensaios de migração, para avançar nos estudos de cultura de células in vitro.

A distribuição espacial de factores solúveis e da tensão de oxigénio pode regular um número de funções celulares importantes in vivo 1, 2, 3, 4. Para melhor investigar o seu efeito sobre as células, in vitro plataforma de cultura de células capazes de gerar de forma estável e gradientes químicos oxigenados é altamente desejada. Vários fatores solúveis desempenham papéis fundamentais em atividades biológicas e afetar o comportamento celular. Recentemente, devido ao avanço das técnicas de microfluidos, um número de dispositivos de microfluidos capaz de gerar de forma estável gradientes químicos foram desenvolvidos para estudar a migração celular 5. Além disso, vários estudos também revelaram a necessidade de tensão de oxigênio para culturas de células in vitro 6, 7, 8. Contudo,o controle da tensão de oxigênio para cultura de células depende principalmente da adição química direta para eliminação de oxigénio ou de células incubadoras com cilindros de gás pressurizado. Além química directa altera o meio de cultura celular e afecta as respostas celulares. incubadoras de controlo de oxigénio requerem uma concepção especial incubadora, o controlo preciso do fluxo de gás, e um grande volume de gás de azoto, de modo a alcançar condições de hipoxia. Além disso, é inviável para controlar a distribuição espacial de oxigênio usando essa configuração, o que retarda o estudo do comportamento celular sob várias tensões de oxigênio e gradientes. Para superar estas limitações, um conjunto de dispositivos de microfluidos foram desenvolvidos para gerar gradientes de oxigénio para aplicações de cultura de células 9. No entanto, a maioria deles são operados usando gases pressurizados, que podem causar problemas de evaporação e de geração de bolha. Portanto, eles muitas vezes exigem instrumentação sofisticada e pode não ser confiável para Studie de cultura de células de longo prazos. Para superar os desafios e estudar ainda mais as interacções entre os gradientes químicos e oxigênio para a migração celular, foi desenvolvido um dispositivo de cultura de células microfluídico feito de polidimetilsiloxano (PDMS) com um policarbonato integrado (PC) de película fina 10. O dispositivo é composto por duas camadas de canais de microfluidos separados por uma membrana de PDMS. A camada superior é uma camada de PDMS-PC para geração gradiente de oxigénio; A camada inferior é feita de PDMS para geração gradiente químico e cultura de células. O dispositivo pode gerar simultaneamente gradientes químicos e sem a utilização de oxigénio perpendiculares cilindros de gás e de sistemas de controlo de fluxo sofisticados. No dispositivo, PDMS fornece uma grande transparência óptica, permeabilidade ao gás, e compatibilidade biológica para a cultura de células e de imagem. O filme PC incorporado serve como uma barreira de difusão de gás para o controle de tensão de oxigénio eficaz. No canal microfluídico, utilizou-se uma série de canais em forma de serpentinas para gerar gradientes químicos. O projeto tem sido amplamente explorada para gerar gradientes químicos em dispositivos microfluídicos para diversas aplicações devido à sua confiabilidade e configuração experimental fácil. Além disso, os perfis de gradiente químico pode ser concebido através da variação da geometria do canal de antemão com simulação numérica. Para a geração de gradiente de oxigênio, levamos vantagem do método de reação química espacialmente confinado que anteriormente foi desenvolvido em nosso laboratório 10, 11, 12. O oxigênio pode ser eliminado das áreas designadas sem purga de azoto. Para uso prático em laboratórios biológicos, toda a configuração experimental é compatível com incubadoras de cultura de células convencionais. Ao integrar esses métodos, podemos gerar simultaneamente gradientes químicos e oxigênio estáveis ​​sem cilindros de gás a granel e instrumentação sofisticada, a fim de estudar a migração celular.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 ml Syringe</td>
			<td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>302104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Smartgene</td>
			<td>6011-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Syringe</td>
			<td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>302151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Centrifuge Tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td>
			<td>Falcon 352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm Petri-Dish</td>
			<td>Dogger Science</td>
			<td>DP-43151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltrichlorosilane</td>
			<td>Alfa Aesar, Ward Hill, MA</td>
			<td>78560-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml Syringe</td>
			<td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>302118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;&#39; Silicon Dummy Wafer</td>
			<td>Wollemi Technical, Taoyuan, Taiwan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan</td>
			<td>AH3102-000000-72EC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AG Double Expose Mask Aligner</td>
			<td>M&#38;R Nano Technology, Taoyuan, Taiwan</td>
			<td>AG500-4D-D-V-S-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimyotic solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td>
			<td>GIBCO 15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Miltex, Plainsboro, NJ</td>
			<td>33-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle</td>
			<td>JensenGlobal, Santa Barbara, CA</td>
			<td>Gauge 14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Hemocytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>Z359629</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered Oxide Etch</td>
			<td>ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan</td>
			<td>PH3101-000000-72EC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Incubator</td>
			<td>Caron, Marietta, OH</td>
			<td>6016-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COMSOL Multiphysics</td>
			<td>COMSOL, Burlington, MA</td>
			<td>Ver. 4.3b</td>
			<td>for numerical simulation of chemical gradients in the device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td>
			<td>GIBCO 14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desicattor</td>
			<td>A-VAC Industries, Anaheim, CA</td>
			<td>35.10001.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/ F12+GlutaMax-1</td>
			<td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td>
			<td>GIBCO 10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td>
			<td>GIBCO 10082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from Human Plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>F2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DMIL LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol (IPA)</td>
			<td>ECHO Chemical, Miaoli, Taiwan</td>
			<td>CMOS112-00000-72EC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JuLi Smart Fluorescence Cell Imager</td>
			<td>NanoEnTek, Seoul, Korea</td>
			<td>DBJ01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical Convention Oven</td>
			<td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td>
			<td>Lindberg Blue M MO1450C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Showa Chemical Industry, Tokyo, Japan</td>
			<td>1943-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma tretment system</td>
			<td>Nordson MARCH, Concord CA</td>
			<td>PX-250</td>
			<td>for oxygen plasma surface treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate (PC) film</td>
			<td>Quantum Beam Technologies, Tainan Taiwan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimehtylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning, Midland, MI</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrogallol</td>
			<td>Alfa Aesar, Ward Hill, MA</td>
			<td>A13405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Removable Adhesive Putty</td>
			<td>3M</td>
			<td>860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Mach 1.6R Tabletop Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>ELS Technology, Hsinchu, Taiwan</td>
			<td>ELS 306MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050</td>
			<td>MicroChem, Westborough, MA</td>
			<td>SU-8 2050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>MicroChem, Westborough, MA</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade</td>
			<td>Feather, Osaka, Japan</td>
			<td>5005093</td>
			<td>for PDMS cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>Chemyx, Houston, TX</td>
			<td>Fusion 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Cell Culture Flask</td>
			<td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td>
			<td>Nunc 156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific,Waltham, MA</td>
			<td>GIBCO 25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon PTFE Tubing</td>
			<td>Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing</td>
			<td>Saint-Gobain Performance Plastics, Akron, OH</td>
			<td>621</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polydimethylsiloxane-polycarbonate microfluidic devices for cell migration studies under perpendicular chemical and oxygen gradients

Este artigo relata um dispositivo microfluídico feito de polidimetilsiloxano (PDMS) com um policarbonato integrado (PC) de película fina para estudar a migração de células sob combinações de gradientes químicos e oxigênio. Ambos os gradientes químicos e oxigênio pode afetar significativamente a migração de células in vivo; no entanto, devido a limitações técnicas, muito pouca pesquisa foi realizada para investigar seus efeitos in vitro. O dispositivo desenvolvido nesta pesquisa tira vantagem de uma série de canais em forma de serpentina para gerar os gradientes químicos desejados e explora um método de reacção química espacialmente confinado para a geração de gradiente de oxigénio. As direcções dos gradientes químicos e de oxigénio são perpendiculares um ao outro para permitir a interpretação simples resultado da migração. A fim de gerar de forma eficiente os gradientes de oxigénio com um consumo mínimo de produto químico, o filme fino de PC incorporado é utilizada como uma barreira de difusão de gás. O dispositivo de microfluidos desenvolvidopode ser accionado por bombas de seringa e colocada num incubador de células convencional durante as experiências de migração celular para permitir a simplificação configuração e condições de cultura de células optimizadas. Em experiências de células, foi utilizado o dispositivo para estudar migração de células alveolares humanas adenocarcinomic basais epiteliais, A549, sob combinações de quimiocina (factor derivado de células do estroma, SDF-1α) e gradientes de oxigénio. Os resultados experimentais mostram que o dispositivo pode gerar estavelmente perpendiculares de quimiocinas e de oxigénio gradientes e é compatível com as células. Os resultados do estudo indicam que os gradientes de migração de oxigénio pode desempenhar um papel essencial para orientar a migração celular, e o comportamento celular sob combinações de gradientes não pode ser previsto a partir daqueles sob gradientes individuais. O dispositivo fornece uma ferramenta poderosa e prático para pesquisadores para estudar interações entre gradientes químicos e oxigênio em cultura de células, o que pode promover melhores estudos de migração de células em mais in vivo -como microenviam-.

Fabricados PDMS-PC dispositivo de cultura de células microfluídicos híbrido. FIG. 1 mostra uma fotografia e uma ilustração do dispositivo de microfluidos. A camada inferior contém quatro níveis de canais em forma de serpentina para gerar soluções de reagentes introduzidos a partir de duas entradas separadas com seis proporções de mistura diferentes. Teoricamente, as seis diferentes razões de mistura são 1: 0, 4: 1, 3: 2, 2: 3, 1: 4, e 0: 1 (à esquerda: para a direita) entre as duas soluções introduzidas a partir das entradas. Os gradientes químicos construídos pelos seis soluções-mistura proporção diferente pode ser gerado na câmara de cultura de células, localizada a jusante. As camadas superior e inferior são separados por uma membrana de PDMS. Na camada superior, os reagentes para a reacção de eliminação de química de oxigénio são introduzidos no canal de microfluidos de duas entradas separadas. Os reagentes são misturados uns com os outros para a reacção imediatamente antes de desembocar na parte superior da câmara de cultura de células delimpam o oxigênio do canal inferior, sem contato química directa. O filme PC incorporado, com um coeficiente de difusão de gás menores em relação ao PDMS, actua como uma barreira de difusão que faz com que a eliminação de oxigénio mais eficientes. O oxigénio difunde-se gradualmente para trás para a câmara de cultura de células através do PDMS na área a jusante, para formar um gradiente de oxigénio ao longo da direcção do fluxo. Uma vez que a reacção química de eliminação de oxigénio é espacialmente confinado, apenas a tensões de oxigénio locais são afectados. Como resultado, o dispositivo pode ser utilizado num incubador celular convencional sem alterar a sua tensão global de oxigénio. Nas experiências de migração, as células são semeadas dentro da câmara de cultura de células para a observação. O meio de crescimento e de reagentes químicos são introduzidos no dispositivo utilizando bombas de seringa com velocidades de fluxo controlada com precisão. Caracterização de gradientes químicos e oxigénio gerado no interior do dispositivo. Devido à tele Fluxo Laminar natureza da microfluídica, comportamentos de fluxo pode ser previsto usando computacionais dinâmica de fluidos de simulação (CFD). Neste trabalho, construímos um modelo 3D e realizada a simulação usando um software de modelagem multifísica disponível no mercado. FIG. 2 (a) mostra uma comparação entre os perfis de concentração de f luoresceína experimentalmente caracterizadas através da largura da câmara de cultura de células com base em medições da intensidade de fluorescência e os resultados de simulação numérica. A concordância entre os resultados experimentais e de simulação sugere que o modelo CFD pode também estimar os gradientes químicos gerados no interior do dispositivo. FIG. 2 (b) representa graficamente o gradiente SDF-1α simulado gerado na câmara de cultura de células. FIG. 3 mostra os resultados da caracterização de gradiente de oxigénio que flui por o corante fluorescente sensível ao oxigénio no interior da câmara de cultura de células antes das experiências de células. O resultado indica que um gradi oxigénioent, variando de cerca de 1 a 16%, pode ser estabelecida utilizando o protocolo acima mencionado. Resultados da migração celular. Como demonstração, foram realizados estudos de migração de células A549 com menos de 4 combinações de quimiocinas (SDF-1a) e gradientes de oxigênio: (1) ausência de quimiocinas e não gradientes de oxigênio como um controle, (2) com um gradiente de quimiocinas e sem um gradiente de oxigênio, (3) com um gradiente de oxigénio e sem um gradiente de quimiocina, e (4) com dois gradientes de oxigénio e de quimiocina. FIG. 4 mostra a foto de toda a configuração experimental. Os ensaios foram todos realizados numa incubadora de cultura celular convencional, com a configuração inteira (incluindo os dispositivos de microfluidos, bombas de seringa, e microscópios de imagem de células vivas) colocado no seu interior. Os resultados da migração de células são mostradas na Fig. 5. FIG. 5 (a) mostra as imagens recolhidas durante as experiências utilizando a imagem de células vivas anaLyzer, e a Fig. 5 (b) e (c) traça as trajetórias de migração celular e movimentos médios no âmbito dos quatro combinações analisadas pelo software ImageJ com os plugins. Os resultados mostram que a média da distância de migração de células no controlo se aproxima de zero, o que sugere que o movimento aleatório das células no experimento. Em contraste, apenas com o gradiente de quimiocina, o movimento média das células é para a esquerda, onde a concentração de SDF-1α é maior. Os resultados sugerem o comportamento quimiotaxia SDF-1α de células A549, que foi previamente reportados. Na experiência com apenas gradientes de oxigénio, o movimento média das células é para cima, onde a tensão de oxigénio é inferior. Mais interessante, na experiência com quimiocinas e gradientes de oxigénio perpendiculares, o movimento média das células é para cima e sem qualquer movimento óbvio na direcção horizontal (gradiente de quimiocina direcção). Figura 1: Fabricados PDMS-PC dispositivo de cultura de células microfluídicos. (A) O foto experimental do dispositivo fabricado capaz de gerar de forma fiável gradientes químicos e oxigénio perpendiculares para estudos de migração celular. O canal de gradiente químico é preenchido com azul e amarelo corantes alimentares para demonstrar a geração de gradiente no interior da câmara de cultura de células. O canal de gradiente de oxigênio é preenchido com corante alimentício vermelho. A barra de escala é de 1 cm. (B) O esquema do dispositivo de microfluidos. A camada de topo é fabricada utilizando PDMS com uma camada de PC incorporado como uma barreira de difusão de gás para o controlo eficiente gradiente de oxigénio no interior da câmara de cultura de células. (C) Os moldes mestres para a fabricação das camadas superior e inferior. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55292/55292fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para</a>ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55292/55292fig2.jpg" /> Figura 2: gradiente químico dentro do dispositivo de cultura de células microfluídicos. (A) simulado numericamente e experimentalmente caracterizado gradiente de concentração de fluoresceína no interior da câmara de cultura de células através da largura da câmara de cultura de células (direcção de Y). A similaridade entre os gradientes simulados e medidos experimentalmente indica que a simulação pode também prever o gradiente químico. A figura inserção mostra o modelo tridimensional (3D) construída para a simulação. (B) Resultado de simulação numérica do gradiente de quimiocina SDF-1α em toda a largura da câmara de cultura de células para os estudos de migração celular. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55292/55292fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma</a>versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55292/55292fig3.jpg" /> Figura 3: gradiente de oxigênio no interior do dispositivo de cultura de células microfluídicos. Medida experimentalmente gradientes de oxigénio no interior da câmara de cultura de células ao longo da direcção do fluxo. Os gradientes foram estimados utilizando o corante fluorescente sensível ao oxigénio e análise de imagem. Os gradientes, da esquerda para a direita da câmara, são caracterizadas, e os resultados mostram perfis de gradiente consistentes em toda a largura da câmara. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55292/55292fig4.jpg" /> Figura 4: Fotos da montagem experimental. Toda a configuração, incluindo dispositivos microfluídicos, bombas de seringa, e um microscópio imagens de células vivas, é colocado dentro de uma incubadora de cultura celular convencional para otimizadocondições de cultura de células durante os experimentos. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55292/55292fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55292/55292fig5.jpg" /> Figura 5: A migração celular resultados do estudo sob perpendiculares SDF-1a e oxigênio gradientes. (A) As imagens capturadas antes e depois do estudo de migração de células de 12 h. Os caminhos de migração de células pode ser analisada a partir das imagens caducado em tempo capturados usando o microscópio de imagens de células vivas. (B) Os caminhos de migração celular e o movimento de migração média analisados a partir das imagens capturadas com menos de 4 diferentes combinações de gradiente: nenhum inclinação, única gradiente de quimiocinas, única gradiente de oxigênio, e ambos os gradientes de quimiocinas e oxigênio. As imagens foram capturadas a cada 15 min. A barra de escala é de 250 mm. (C) A parcela de as distâncias médias de migração celular no (gradiente de oxigênio) perpendicular e horizontal (gradiente de quimiocinas) instruções em quatro combinações de inclinação diferentes. Os dados são expressos como a média ± DP, obtido a partir de três conjuntos experimentais independentes, e foram analisadas 10 células em cada experiência. Os (teste-t de Student não emparelhado, p &lt;0,01) resultados estatísticos significativamente diferentes são designados por letras diferentes (A e B). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55292/55292fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

Polidimetilsiloxano-policarbonato microfluídicos para celular Estudos Migratórios Sob Perpendicular Chemical e gradientes de oxigênio

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

polydimethylsiloxane-polycarbonate-microfluidic-devices-for-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.1K visualizações.  Academia Sinica. The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

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Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

Simples dispositivos microfluídicos para<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging de<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; E Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Bioengenharia

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Criando Gradientes adesivas e solúvel para a migração celular Imaging com Microscopia de Fluorescência

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

Um chip microfluídico para a Versátil Análise Química de células individuais

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, biomedical device coatings, and drug delivery tools. Nanoporous gold (np-Au), produced by a nano-scale self-assembly process, is a relatively new material that exhibits large effective surface area, high electrical conductivity, and catalytic activity. These properties have made np-Au an attractive material to scientific community. Most studies on np-Au employ macro-scale specimens and focus on fundamental science of the material and its catalytic and sensor applications. The macro-scale specimens limit np-Au's potential in miniaturized systems, including biomedical devices. In order to address these issues, we initially describe two different methods to micropattern np-Au thin films on rigid substrates. The first method employs manually-produced stencil masks for creating millimeter-scale np-Au patterns, while the second method uses lift-off photolithography to pattern sub-millimeter-scale patterns. As the np-Au thin films are obtained by sputter-deposition process, they are compatible with conventional microfabrication techniques, thereby amenable to facile integration into microsystems. These systems include electrically-addressable biosensor platforms that benefit from high effective surface area, electrical conductivity, and gold-thiol-based surface bioconjugation. We describe cell culture, immunostaining, and image processing techniques to quantify np-Au's interaction with mammalian cells, which is an important performance parameter for some biosensors. We expect that the techniques illustrated here will assist the integration of np-Au in platforms at various length-scales and in numerous applications, including biosensors, energy storage systems, and catalysts.

We report on techniques to micropattern nanoporous gold thin films via stencil printing and photolithography, as well as methods to culture cells on the microfabricated patterns. In addition, we describe image analysis methods to characterize morphology of the material and the cultured cells using scanning electron and fluorescence microscopy techniques.

Microfabricação de Padrões de Ouro Nanoporosos para celular-primas estudos de interacção

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

Millifluidics for Chemical Synthesis and Time-resolved Mechanistic Studies

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the first, synthesis of ultra-small copper nanoclusters is described. The second example provides their utility for investigating time resolved kinetics of chemical reactions by analyzing gold nanoparticle formation using in situ X-ray absorption spectroscopy. The final example demonstrates continuous flow catalysis of reactions inside millifluidic channel coated with nanostructured catalyst.

Millifluidic devices are utilized for controlled synthesis of nanomaterials, time-resolved analysis of reaction mechanisms and continuous flow catalysis.

Millifluidics para síntese química e resolvida no tempo estudos sobre os mecanismos

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

Espremendo celular como uma plataforma de entrega intracelular Robust Microfluidic

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Camada por camada de colágeno Deposição em microfluídicos para Microtissue Estabilização

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Usando Adhesive Padronização Construir 3D de papel microfluídicos

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering

Engineering cells with active-ingredient-loaded micro/nanoparticles (NPs) is becoming an increasingly popular method to enhance native therapeutic properties, enable bio imaging and control cell phenotype. A critical yet inadequately addressed issue is the significant number of particles that remain unbound after cell labeling which cannot be readily removed by conventional centrifugation. This leads to an increase in bio imaging background noise and can impart transformative effects onto neighboring non-target cells. In this protocol, we present an inertial microfluidics-based buffer exchange strategy termed as Dean Flow Fractionation (DFF) to efficiently separate labeled cells from free NPs in a high throughput manner. The developed spiral microdevice facilitates continuous collection (&#62;90% cell recovery) of purified cells (THP-1 and MSCs) suspended in new buffer solution, while achieving &#62;95% depletion of unbound fluorescent dye or dye-loaded NPs (silica or PLGA). This single-step, size-based cell purification strategy enables high cell processing throughput (106 cells/min) and is highly useful for large-volume cell purification of micro/nanoparticle engineered cells to achieve interference-free clinical application.

This protocol describes the use of an inertial microfluidics-based buffer exchange strategy to purify micro/nanoparticle engineered cells with efficient depletion of unbound particles.

Microfluídico troca de tampão para Micro / nanopartículas celular Engenharia sem interferências

Engineering cells with active-ingredient-loaded micro/nanoparticles (NPs) is becoming an increasingly popular method to enhance native therapeutic ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other physical or chemical stimuli. They have been commonly used for in vitro cell studies by providing in vivo like surroundings. Especially, how cells response to chemical gradients, electrical fields, and shear stresses has drawn many interests since these phenomena are important in understanding cellular properties and functions. These microfluidic chips can be made of glass substrates, silicon wafers, polydimethylsiloxane (PDMS) polymers, polymethylmethacrylate (PMMA) substrates, or polyethyleneterephthalate (PET) substrates. Out of these materials, PMMA substrates are cheap and can be easily processed using laser ablation and writing. Although a few microfluidic devices have been designed and fabricated for generating multiple, coexisting chemical and electrical stimuli, none of them was considered efficient enough in reducing experimental repeats, particular for screening purposes. In this report, we describe our design and fabrication of two PMMA-based microfluidic chips for investigating cellular responses, in the production of reactive oxygen species and the migration, under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli. The first chip generates five relative concentrations of 0, 1/8, 1/2, 7/8, and 1 in the culture regions, together with a shear stress gradient produced inside each of these areas. The second chip generates the same relative concentrations, but with five different electric field strengths created within each culture area. These devices not only provide cells with a precise, controllable micro-environment but also greatly increase the experimental throughput.

Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.

Projetando microfluídicos para Estudar respostas celulares Sob único ou coexistindo Chemical / Elétrica / tensão de cisalhamento Estímulos

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...