Apresentamos um protocolo para gerar um organoide cerebral humano contendo microglia e neurônios residentes, incorporando células progênicas hematopoiéticas derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas no processo de indução e desenvolvimento de organoides neuronais. Este método fornece um modelo para estudar as interações entre a microglia e os neurônios durante o desenvolvimento do cérebro humano. Os organoides cerebrais 3D são minicérebros gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas ou iPSCs.
Como alternativa a animais e seres humanos, eles têm sido amplamente utilizados na imitação de cérebros humanos na pesquisa do desenvolvimento do cérebro e distúrbios neurológicos. Eles são ótimas ferramentas para o avanço da pesquisa em saúde humana. Os protocolos convencionais para organoides cerebrais humanos 3D raramente geram microglia, a célula imune residente do cérebro humano, pois essas células surgem de uma linhagem embrionária diferente dos neurônios.
Embora a microglia possa ser adicionada aos organoides cerebrais em um estágio posterior de diferenciação, é necessário um método para imitar melhor o desenvolvimento do cérebro humano. A maioria dos outros protocolos adiciona HPCs ou microglia no final da geração de organoides cerebrais. Geramos corpos embrióides a partir de iPSCs e HPCs mistos antes da indução neural.
Isso pode imitar melhor o desenvolvimento do cérebro humano, pois os precursores da microglia migram para o cérebro muito cedo no desenvolvimento. Além disso, o uso de HPCs economiza tempo total de diferenciação, pois os protocolos de diferenciação da microglia geralmente levam mais de 30 dias. Portanto, nosso protocolo pode economizar tempo e custos de reagentes.
Para começar, cultive células-tronco pluripotentes induzidas por humanos dissociadas ou iPSCs em uma placa de 12 poços contendo um mililitro de meio E8 Flex, incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas. No dia seguinte, verifique as colônias ao microscópio e conte o número de colônias examinando todos os campos em um poço. Substitua o meio por um mililitro de Meio A do kit hematopoiético.
Coloque a placa de volta na incubadora por 48 horas. No terceiro dia, substitua 500 microlitros do meio gasto por 500 microlitros de meio A fresco e incube por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, observe o crescimento celular e a diferenciação das colônias iPSC.
Substitua o meio por um mililitro de Medium B. Monitore a diferenciação celular ao microscópio e execute uma troca de meio meio meio com 500 microlitros de Medium B em dias alternados por seis a sete dias. No dia 10, observe a presença de células redondas únicas brilhantes com a morfologia de células progenitoras hematopoiéticas normais, ou HPCs, flutuando ou frouxamente ligadas à célula da camada plana com alguns agregados soltos. Em seguida, colete todos os HPCs diferenciados pipetando para cima e para baixo três vezes com uma ponta de pipeta de um mililitro.
Transfira as células para um tubo de 15 mililitros. Centrifugue a suspensão celular a 300G por cinco minutos e ressuspenda o pellet em um mililitro de Medium B. Adicione 20 microlitros de suspensão celular em uma câmara de contagem de células e conte as células usando um medidor de células. Ajuste a concentração celular para 1 milhão de células por mililitro usando o Meio B. A técnica de cultura de diluição em série produziu números e tamanhos apropriados de colônias de iPSC com colônias mostrando mudanças morfológicas significativas no final da cultura no Meio A. Após três dias no Meio B, a diferenciação de HPC foi observada com o aparecimento de células redondas homogêneas.
No dia 10, os HPCs formaram predominantemente aglomerados semelhantes a colônias sem detritos significativos. Após coletar HPCs diferenciados de iPSCs humanos, verifique se a cultura de um iPSC atingiu 80% de confluência. Adicione 500 microlitros de solução de enxágue antiaderente em um poço da placa de micropoço, minimizando a formação de bolhas.
Gire a placa a 2.000G por cinco minutos em um rotor de caçamba oscilante equipado com suportes de placas. Remova a solução de enxágue completamente e lave os poços duas vezes com um mililitro de DPBS e depois com um mililitro de DMEM/F-12 sem gerar bolhas. Trate as iPSCs com um mililitro de solução de ACCUTASE para iniciar a dissociação celular.
Observe as células ao microscópio, observando sinais de separação celular enquanto as células permanecem presas ao fundo. Substitua a solução de ACCUTASE por um mililitro de meio DMEM/F-12 e, em seguida, misture para cima e para baixo para dissociar as células em células individuais. Transferir as células dissociadas para um tubo de 15 mililitros e adicionar o meio DMEM/F-12 até atingir um volume final de cinco mililitros.
Centrifugue as células a 300G por cinco minutos e ressuspenda o pellet em um mililitro de meio E8 Flex. Conte as células para ajustar a concentração celular para 1 milhão de células por mililitro no meio E8 Flex. Em seguida, misture iPSCs com HPCs em uma proporção de dois para um no poço da placa de cultura de micropoço.
Adicione um microlitro de solução estoque do inibidor de ROCK Y-27632 por um mililitro de meio no sobrenadante e agite a placa de um lado para o outro. Gire a placa a 300G por cinco minutos e observe ao microscópio para confirmar se as células se acomodaram nos micropoços. Incube as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Após 48 horas, observe as células ao microscópio quanto à formação de corpos embrióides, ou EBs. Em seguida, trate uma placa de cultura de células de 24 poços com 500 microlitros de tampão de enxágue antiaderente por 15 minutos para criar uma placa de fixação baixa. Lave os poços duas vezes com um mililitro de DPBS e adicione um mililitro de meio E8 Flex a cada poço.
Usando uma ponta de pipeta de orifício de um mililitro de largura, ressuspenda os EBs na placa de cultura de micropoço. Em seguida, para cada poço da placa de 24 poços de baixa fixação, adicione 100 microlitros de meio contendo os EBs. Incube a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 48 horas.
Para começar, descongele as alíquotas da matriz da membrana basal no gelo por 30 minutos. No segundo dia após a formação da EB, usando uma ponta de pipeta pré-resfriada de 20 microlitros, adicione 15 microlitros de matriz de membrana basal gelada em pequenas gotas sobre o meio para revestir as EBs. Coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 48 horas.
No quarto dia após a formação do EB, remova cuidadosamente 500 microlitros de meio sem perturbar os EBs e repita o revestimento da matriz da membrana basal conforme demonstrado anteriormente. Em seguida, adicione 500 microlitros de meio de indução neural de células-tronco pluripotentes em cima das células. Coloque a placa em uma incubadora de células de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
No sexto e oitavo dias, execute uma troca de meio meio substituindo cuidadosamente 500 microlitros de meio por 500 microlitros de meio de indução neural fresco. Após a incubação nos dias 10, 12 e 14, faça uma mudança de meio com meio de células-tronco neurais. No dia 15, transfira as esferas que contêm o poço, juntamente com o meio, para uma nova placa de 12 poços tratada com solução de enxágue antiaderente.
Adicione 500 microlitros de meio de maturação neuronal em cima da cultura. Durante o estágio de maturação, monitore o meio em busca de sinais de esgotamento de nutrientes, como uma mudança de cor. Se for observada depleção de nutrientes, transfira o organoide para uma placa de seis poços.
No dia 17, suplemente o meio de maturação com citocinas por seis dias para facilitar a maturação microglial. Finalmente, no dia 23, colete os organoides neurais resultantes para caracterização. Misturas de HPC e iPSC de alta qualidade formaram EBs em 24 horas, mostrando crescimento contínuo e detritos mínimos.
Após a transferência para uma nova placa, a EBS continuou a crescer até atingir um platô no meio de maturação.
