Este projeto foi apoiado pelo NIH / NIBIB 1K99EB020075 a Pedro Brugarolas e um Innovation Fund Award do Chicago Innovation Exchange para Brian Popko e Pedro Brugarolas. O Prof. Brian Popko é reconhecido com gratidão por sua orientação e apoio financeiro ao projeto. O Professor Chin-Tu Chen e o Recurso Integrado de Pesquisa em Imagens de Pequenos Animais da Universidade de Chicago são reconhecidos por terem generosamente compartilhado espaço e equipamentos de laboratório. A IBA é reconhecida por patrocinar o acesso aberto deste artigo.

CUIDADO: Todos os procedimentos envolvendo o uso de materiais radioativos devem ser aprovados pelo Escritório de Segurança de Radiação local. Ao trabalhar com materiais radioativos, use um casaco de laboratório e crachás pessoais de radiação. Use duas camadas de luvas em todos os momentos e verifique as mãos com um contador Geiger após cada etapa que envolve manipulação radioatividade. Se as luvas estiverem contaminadas com radioactividade, elimine as luvas e substitua-as. Use blindagem apropriada, minimize o tempo em contato com a fonte de radiação e maximize a distância. 1. Uma semana antes da experiência: Preparação de materiais <ol><li> Seqüência de download [18F] 3F4AP: os usuários do Synthera podem fazer login no banco de dados de usuários (http://www.iba-radiopharmasolutions.com/products/chemistry) e baixar o arquivo de seqüência para o 3F4AP. Os usuários de outros sintetizadores podem precisar escrever seu próprio script com base na seqüência de etapas. Navegue pela seqüência anotada para se familiarizar com asEnvolvidos na síntese. </li><li> Certifique-se de que haja gás suficiente para a síntese. O sintetizador requer gás comprimido, hélio ou nitrogênio. Também requer&gt; 75 psi de ar comprimido. Certifique-se de que as pressões estão dentro do recomendado pelo fabricante. </li><li> Preparar a fase móvel de HPLC: preparar 1 L de fosfato de sódio 50 mM e trietilamina 10 mM. Utilizando um medidor de pH, ajustar o pH a 8,0 ± 0,1 por adição gota a gota de hidróxido de sódio saturado com agitação. Filtrar a solução através de um filtro de garrafa de 0,22 μm e adicionar 5% de volume de etanol. </li><li> Vidros secos no forno durante a noite. </li></ol> 2. Dia da Experiência: Antes da chegada do Fluor-18 <ol><li> Utilizando seringas de 1 mL, encher os frascos dos reagentes com os reagentes apropriados. Para os frascos 2 e 3, utilize frascos secos e solventes anidros mantidos sob árgon. Selar os frascos com selos de friso usando um crimper. <ol><li> Encha o frasco 1 (11 mm de diâmetro / 2 ml de volume viAl) com 400 μL de TBA-HCO 3 + 800 μl de acetonitrilo (MeCN). </li><li> Enche o frasco 2 (frasco de 13 mm / 4 mL) com 50 μL de solução precursora 1,0 mg / mL + 450 μL de MeCN. </li><li> Encha o frasco 3 (frasco de 11 mm / 2 mL) com 500 μL de MeCN. </li><li> Encher o Frasco 4 (frasco de 13 mm / 4 mL) com 4 mL de ácido oxálico a 0,2% em metanol (MeOH). </li></ol></li><li> Condição QMA (troca de anião forte) e Alumina-N cartuchos de extração em fase sólida. Utilizando uma seringa de 10 mL, passe 5 mL de NaHCO3 a 8,4% gota a gota através da QMA seguido de 5 mL de água desionizada Tipo I (18,2 ΜΩ • cm a 25 ºC). Passe 5 mL de água ultrapura gota a gota através do cartucho de Alumina-N seguido por 5 mL de MeOH + ácido oxálico a 0,2%. </li><li> Ligar a HPLC e condicionar a coluna C-18 com 4 mL por min de fase móvel durante 30 min. </li><li> Coloque um novo cartucho de catalisador no suporte do cartucho do hidrogenador e inicie um fluxo de 0,5 mL / min de MeOH a 100%. SE o regulador de hidrogénio a 50 psi e acondicionar o cartucho durante 15 min ( Figura 2 ). </li><li> Montar o Processador de Fluidos Integrado (IFP) introduzindo os frascos 1 a 4 nas suas posições, colocando os cartuchos eo frasco de recolha como mostrado na Figura 3 . Anexar um frasco de coleta com uma agulha de ventilação para a linha de saída do hidrogenador. </li><li> Inicie o software do sintetizador. Digite o login e a senha. Execute verificações prévias no sintetizador de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Clique em &quot;Seqüências&quot; e depois em &quot;Abrir&quot; para carregar a seqüência 3F4AP. </li><li> Carregue o IFP clicando no botão &quot;Carregar&quot; na tela. Digite um nome de arquivo para a execução e iniciar a seqüência clicando em &quot;Iniciar&quot;. (O sintetizador automatizado pausará automaticamente antes do passo de carregamento de 18 F.) </li><li> Veja como o sintetizador passa pelos passos de auto-verificação de rotina (parte uma da seqüência). Olhe para o screeN para garantir que não haja avisos ou alarmes. Preste atenção aos sons enquanto o sintetizador limpa as linhas e pré-aquece o recipiente de reação em preparação para a corrida. O indicador de temperatura deve subir e permanecer a 65 ºC. Aguarde o sinal (bip auditivo) indicando que o sintetizador está pronto para a transferência de 18F. </li></ol> 3. Dia do Experimento: 18 F Rotulagem <ol><li> Transferir remotamente a quantidade desejada de 18F produzido por ciclotrão do alvo de ciclotrão para o frasco de 18F. Verifique a quantidade de radioatividade e registre-a com o tempo de entrega. NOTA: Se não utilizar uma linha directa para a transferência de 18 F , utilize uma seringa pré-cheia com uma agulha presa para transferir a actividade para o frasco através do septo. A quantidade de radioactividade de partida depende dos limites estabelecidos pelo Office of Radiation Safety e da quantidade desejada de traçador final. A quantidade típica varia entre 50 e 500 mCi. </li><lI&gt; Retomar a sequência no sintetizador premindo &quot;Retomar&quot;. Isto irá iniciar a transferência do 18 F para a QMA. </li><li> Monitorar a progressão da síntese em toda a seqüência automatizada na tela do computador. <ol><li> Assista a transferência do 18 F do frasco para o QMA por 90 s. Após o aprisionamento de 18 F - em QMA, elui - se com solução de TBA - HCO 3 (frasco 1). (Parte dois da seqüência) </li><li> Monitore os traços de pressão e temperatura no sintetizador enquanto o TBA 18 F é seco sob pressão reduzida (5 kPa) e aquecido (100 ºC), seguido de passos adicionais de secagem e arrefecimento. (Parte 3 da sequência) </li><li> Observe a transferência de MeCN anidro (frasco 3) e solução precursora (frasco 2) para o reator e como ele reage durante 1 min à temperatura ambiente. A solução deve ser incolor ou muito fraco amarelo. (Parte 4 da sequência) </li><li> Preste atenção à transferência de ácido oxálico(Frasco 4) no reactor. Observe como a solução é transferida de pressão do reator através do cartucho de alumina-N para o frasco do produto final. (Parte 5 da sequência) </li></ol></li><li> No final da seqüência, imprima o relatório, ejete o IFP, desligue os tanques de gás e feche o software. </li><li> Ao primeiro estabelecer o procedimento, medir a radioactividade no cartucho de alumina-N e no frasco de recolha introduzindo separadamente o cartucho eo frasco no calibrador de dose. Registre a atividade eo tempo de medição. Coloque o cartucho usado em um recipiente de resíduos com chumbo. Coloque o frasco de recolha num recipiente blindado para transporte para o passo seguinte. </li><li> Utilizando uma seringa de 1 mL com uma agulha de 2 &quot;ligada, transfira manualmente aproximadamente 100 μL de amostra da solução do produto intermediário para um frasco padrão de HPLC para controlo de qualidade no processo Injecte 10 μL desta amostra na HPLC para avaliar a pureza e Identidade do intermeDia. NOTA: Condições de HPLC: XDB 5 μm, coluna C18 de 9,4 x 250 mm. Fluxo 4 mL / min. Fase móvel (Na2HPO4 50 mM, TEA 10 mM, EtOH a 5%). Isocrático 15 min. </li></ol> 4. Dia da Experiência: Hidrogenação CUIDADO: A injeção do produto no hidrogenador deve ser feita usando as devidas precauções de blindagem. O gás de hidrogénio deve ser manuseado e ventilado adequadamente. NOTA: o reactor de hidrogenação pode ser ligado no lugar da coluna de HPLC no sintetizador e controlado utilizando o software do sintetizador. <ol><li> Ajustar o fluxo do hidrogenador a 0,5 mL / min iniciando a sequência de HPLC do sintetizador. Ajustar manualmente a pressão do hidrogênio a 50 psi. <ol><li> Depois de terminar as etapas de marcação e de extinção o sintetizador transferirá a solução do produto intermediário para o circuito hidrogenador / HPLC. </li></ol></li><li> Quando o pico radioativo aparece no HPLC software alternar a válvula de coleta para coletar o produto. Medir a radioactividade do produto bruto utilizando um calibrador de dose. NOTA: O produto bruto deve ser injectado num sistema automatizado de HPLC dentro de uma célula quente. Após a purificação, o produto final é então recolhido e distribuído numa pilha quente de fluxo laminar de ar ISO classe 5 asséptica de acordo com os regulamentos da USP e da FDA. </li></ol> 5. Dia da Experiência: Purificação e Preparação da Dose <ol><li> Injectar o produto em bruto na HPLC e utilizar o colector de fracções automatizado para recolher as fracções correspondentes ao pico do produto final. Cada tubo contém 0,66 mL de solução. NOTA: Condições de HPLC: XDB 5 μm, coluna C18 de 9,4 x 250 mm. Fluxo 4 mL / min. Fase móvel (Na2HPO4 50 mM, TEA 10 mM, EtOH a 5%). Isocrático 15 min. Recolher 4-15 min. </li><li> Medir a radioactividade de cada fracção utilizando um calibrador de dose e registá-la. Combinar as frações com maior quantidadeS de radioactividade (tipicamente os tubos 14-18). </li><li> Desenhe a solução do produto com uma seringa de 10 ml e passe a amostra através de um filtro de 0,22 μm num frasco estéril. Registre a quantidade de radioatividade, o final do tempo de síntese eo volume da solução no rótulo do frasco. Esta é a dose final para injecção. Colocar de lado ~ 0,8 mL da solução para testes de controle de qualidade. </li></ol> 6. Dia da Experiência: Testes de Controle de Qualidade (QC) <ol><li> Antes da libertação da dose: Inspecione a dose através de vidro protegido por chumbo. A solução deve ser transparente, incolor e isenta de partículas. </li><li> Identidade radioquímica: <ol><li> Para RadioTLC: mancha uma gota da amostra em uma placa de TLC lado a lado com o padrão de referência. Executar a placa de TLC numa câmara de TLC utilizando 95% de MeOH: ácido acético a 5%. Visualize o padrão de referência sob iluminação UV e marque sua posição com lápis. </li><li> Tape a placa de TLC para o estágio do scann radioTLCTempo de gravação do pico. Os valores de Rf do padrão de referência e do pico radioativo devem corresponder a 5%. </li><li> Para RadioHPLC: executar 10 μL da dose com e sem o padrão de referência na HPLC. O tempo de retenção do padrão de referência eo pico radioativo devem coincidir. Um único pico de coeluição deve ser visto na amostra picada. </li></ol></li><li> Para a pureza radioquímica: medir a área sob curva para os picos alvo radioHPLC e radioTLC. A área do pico alvo deve ser&gt; 95% da área para todos os picos radioativos combinados. </li><li> Para a radioactividade específica: calcular a radioactividade específica como a quantidade de radioactividade no pico (medida no passo 5.2) sobre a quantidade de massa determinada a partir da área sob a curva do traçado UV HPLC utilizando uma curva de calibração pré-estabelecida. A radioactividade específica deve ser superior a 50 mCi / μmol. </li><li> Para a análise de solvente residual: medir a quantidade de solvente residualTs (MeCN, MeOH) na dose utilizando cromatografia gasosa. Os níveis de solventes devem ser &lt;0,04% para o acetonitrilo e &lt;3000 ppm para o metanol. A quantidade de EtOH deve ser inferior a 10% p / v. </li><li> Para o teste de integridade do filtro estéril (ponto de bolha): ligar o filtro utilizado no passo 5.3 a uma alimentação de azoto equipada com um regulador de pressão e submergir a agulha em água. Abra gradualmente a válvula de gás enquanto observa o manómetro. O filtro deve suportar pressões de até 50 psi sem estourar como evidenciado pela falta de um fluxo de bolhas da agulha. Aumentar a pressão para além de 50 psi até que um fluxo de bolhas sai da agulha. Registre esta pressão, é a pressão de ruptura e deve ser&gt; 50 psi. </li><li> Para a meia-vida do radionuclídeo: medir a radioactividade do produto em dois pontos de tempo ≥ 10 min entre si num calibrador de dose. Calcular a meia-vida usando a equação abaixo. A meia-vida deve coincidir com a de 18 F para dentro de 5 minutos (109 ± 5 min): T ½ calculado = 0,693 t ÷ ln (A 1 / A 2 ) Onde t é o intervalo entre as medições e A 1 , A 2 a atividade medida em cada ponto de tempo. </li><li> Para a identidade e pureza radionuclídicas: obter o espectro de raios-γ de uma amostra do produto utilizando um contador gama. O espectro deve exibir um único pico-foto a uma energia de 511 keV. Não deve haver outros picos de foto no espectro. </li><li> Para a análise de endotoxina: medir os níveis de endotoxina utilizando um ensaio de quantificação de endotoxinas cromogénicas LAL. Os níveis de endotoxina devem ser &lt;1,75 EU / mL para um produto diluído 1:10 com um volume final de 10 mL. </li><li> Documente os resultados de cada teste QC. Solte a dose para estudos com animais apenas se todos os testes forem aprovados. </li><li> Liberação pós-dose: Para o teste de esterilidade: adicionar uma amostra da dose tanto ao tioglicolato fluido como à tripticasaCaldo de soja Nenhum crescimento deve ser visto na mídia após 14 dias. </li></ol> 7. Dia da Experiência: Cálculos (Tabela 1) <ol><li> Para o rendimento radioquímico corrigido sem decaimento (ndc RCY): calcular o ndc RCY como a quantidade de radioactividade no produto final sobre a radioactividade de partida. </li><li> Para a eficiência de radiomarcação: calcular o rendimento de rotulagem como a razão de radioactividade no frasco de colheita em relação à radioactividade no cartucho de alumina-N (não incorporado [ 18 F] F-) e no frasco de recolha. </li><li> Para o rendimento de hidrogenação: calcular o rendimento de hidrogenação como a quantidade de radioactividade no pico desejado sobre a radioactividade injectada na HPLC. </li><li> Para as perdas de filtragem: calcular a filtragem perde como a radioatividade restante no filtro e seringa sobre a radioatividade antes da filtragem. </li></ol>

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	<li>Valk, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Positron emission tomography : basic science and clinical practice. , (2003).</li><li>Phelps, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PET: molecular imaging and its biological applications. , (2004).</li><li>Ametamey, S. M., Honer, M., Schubiger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+with+PET.">Molecular imaging with PET.</a> Chem Rev. 108 (5), 1501-1516 (2008).</li><li>Oriuchi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+role+and+future+prospects+of+positron+emission+tomography+in+clinical+oncology.">Present role and future prospects of positron emission tomography in clinical oncology.</a> Cancer Sci. 97 (12), 1291-1297 (2006).</li><li>Heiss, W. D., Herholz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+receptor+imaging.">Brain receptor imaging.</a> J Nucl Med. 47 (2), 302-312 (2006).</li><li>Brugarolas, P., Freifelder, R., Cheng, S. -. H., DeJesus, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+meta-substituted+[18F]3-fluoro-4-aminopyridine+via+direct+radiofluorination+of+pyridine+N-oxides.">Synthesis of meta-substituted [18F]3-fluoro-4-aminopyridine via direct radiofluorination of pyridine N-oxides.</a> Chemical Communications. , (2016).</li><li>Jones, R. E., Heron, J. R., Foster, D. H., Snelgar, R. S., Mason, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+4-aminopyridine+in+patients+with+multiple+sclerosis.">Effects of 4-aminopyridine in patients with multiple sclerosis.</a> J Neurol Sci. 60 (3), 353-362 (1983).</li><li>Davis, F. A., Stefoski, D., Rush, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orally+administered+4-aminopyridine+improves+clinical+signs+in+multiple+sclerosis.">Orally administered 4-aminopyridine improves clinical signs in multiple sclerosis.</a> Ann Neurol. 27 (2), 186-192 (1990).</li><li>Goodman, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained-release+oral+fampridine+in+multiple+sclerosis:+a+randomised,+double-blind,+controlled+trial.">Sustained-release oral fampridine in multiple sclerosis: a randomised, double-blind, controlled trial.</a> Lancet. 373 (9665), 732-738 (2009).</li><li>Brugarolas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Abstracts Of Papers Of The American Chemical Society. , (2016).</li><li>Brugarolas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+PET+tracer+for+MS.">Development of a PET tracer for MS.</a> J Nucl Med Meeting Abstracts. 55 (1), 1124 (2014).</li><li>Brugarolas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorinated+4-aminopyrdines+as+PET+tracers+for+MS.">Fluorinated 4-aminopyrdines as PET tracers for MS.</a> Journal of Nuclear Medicine. 56, 493 (2015).</li><li>Yoswathananont, N., Nitta, K., Nishiuchi, Y., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+hydrogenation+reactions+in+a+tube+reactor+packed+with+Pd/C.">Continuous hydrogenation reactions in a tube reactor packed with Pd/C.</a> Chem Comm. (1), 40-42 (2005).</li><li>St&#246;cklin, G., Pike, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Radiopharmaceuticals for Positron Emission Tomography-Methodological Aspects. 24, (1993).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+evaluation+of+a+high-affinity+18F-trifluoroborate+octreotate+derivative+for+somatostatin+receptor+imaging.">Preclinical evaluation of a high-affinity 18F-trifluoroborate octreotate derivative for somatostatin receptor imaging.</a> J Nucl Med. 55 (9), 1499-1505 (2014).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=18F-trifluoroborate+derivatives+of+[des-arg(10)]kallidin+for+imaging+bradykinin+b1+receptor+expression+with+positron+emission+tomography.">18F-trifluoroborate derivatives of [des-arg(10)]kallidin for imaging bradykinin b1 receptor expression with positron emission tomography.</a> Mol Pharm. 12 (3), 974-982 (2015).</li><li>Scott, P. J. H., Hockley, B. G., Kilbourn, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Radiochemical Syntheses, Volume 1: Radiopharmaceuticals for Positron Emission Tomography. , (2012).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A preparação de marcadores PET requer rotulagem eficiente com mínima intervenção do usuário para minimizar a exposição à radiação 14 . Aqui, descrevemos o primeiro procedimento semi-automatizado para a síntese radioquímica de [18F] 3F4AP, um marcador PET atualmente sob investigação para a desmielinização por imagem. Este método semi-automatizado produz o radiotracer com alta pureza e atividade específica suficiente para estudos em animais. Os métodos anteriores para a síntese deste composto baseavam-se na síntese manual 6 , o que limita significativamente a quantidade de marcador radioactivo que pode ser produzido. Possuir um método automatizado para a síntese também proporciona rendimentos mais reprodutíveis e facilita a transferência do procedimento para outros laboratórios com equipamento semelhante. Futuros esforços para automatizar completamente o procedimento serão fundamentais para a produção do marcador em quantidades elevadas para estudos em grandes animais ou seres humanos. <p cEste procedimento utiliza a troca nucleofílica de 19F para 18F para incorporar o radioisótopo na molécula de interesse. As vantagens desta reacção são que é rápida e produz quase exclusivamente o produto desejado sem a necessidade de realizar um passo de purificação potencialmente prolongado para remover o excesso de precursor. Uma limitação do uso de reacções de marcação por permuta de flúor, tal como a aqui utilizada, é que, devido à massa inicial do composto frio, a actividade específica final definida como quantidade de radioactividade em mCi em relação à quantidade de composto em μmol pode ser limitada. Nas nossas condições padrão, começando com 100-200 mCi de 18 F e 50 μg de precursor, a atividade específica típica no final da síntese é de até 100-200 mCi / μmol, o que parece ser suficiente para estudos pré-clínicos de PET . No entanto, a actividade específica pode melhorar, aumentando a quantidade inicial para 18 F - </suP&gt; mantendo a quantidade de massa baixa. Houve vários relatos de produção de radioligandos por troca de flúor com alta atividade específica (1-3 Ci / μmol) iniciando com alta atividade e baixas quantidades precursoras 15,16 . Tal como acontece com todas as sínteses radioquímicas dos marcadores PET, é crítico trabalhar rapidamente para minimizar a decomposição radioactiva. Também é importante minimizar o tempo de manuseio dos materiais radioativos, usar blindagem adequada e maximizar a distância entre o material radioativo eo usuário para minimizar a exposição à radiação. Estes aspectos são particularmente importantes durante a segunda metade do protocolo (purificação e controlo de qualidade) em que o utilizador tem de injectar manualmente a solução na HPLC, recolher as fracções e filtrar o produto final. Como com todas as sínteses radioquímicas dos marcadores de PET, é crítico trabalharInimizam o decaimento radioativo. Também é importante minimizar o tempo de manuseio dos materiais radioativos, usar blindagem adequada e maximizar a distância entre o material radioativo eo usuário para minimizar a exposição à radiação. Estes aspectos são particularmente importantes durante a segunda metade do protocolo (hidrogenação e purificação) em que o utilizador tem de injectar manualmente a solução no hidrogenador, recolher as fracções, configurar o processo de secagem, redissolver o produto em tampão e filtrar. Durante o passo de filtragem é fácil perder uma grande quantidade de material radioactivo nas paredes dos frascos. Assim, é importante tentar recolher todo o líquido antes da filtragem. Utilizar uma quantidade maior de tampão para dissolver pode melhorar o rendimento de recuperação, mas a sua utilização é desencorajada porque requererá a injecção de um volume maior na HPLC, fazendo com que o pico se alargue e aumente o volume da dose final. Para solucionar um problemaE otimizar o procedimento é importante para acompanhar os rendimentos de cada etapa. Para a maioria dos passos, isto é feito simplesmente medindo a quantidade de radioactividade antes e depois de qualquer passo. No caso da reacção, os rendimentos podem ser calculados através da quantificação dos picos de HPLC. A Tabela 1 na Seção de Resultados mostra os rendimentos típicos para cada etapa. A Tabela 2 abaixo lista muitas das falhas comumente encontradas com possíveis razões para a falha e como corrigi-las. Finalmente, embora o procedimento aqui demonstrado seja específico para a síntese de [18F] 3F4AP, o fluxo de trabalho geral e muitas das etapas individuais são comuns à síntese de outros compostos 17 . Neste artigo também demonstramos os testes QC típicos realizados em qualquer marcador PET.

A capacidade de rastrear um fármaco de pequena molécula de forma não-invasiva dentro do corpo humano tem grande potencial para a medicina de precisão. Entre as técnicas de imagem molecular, a tomografia por emissão de positrões (PET) tem muitas características favoráveis: a alta sensibilidade dos detectores de PET permite a detecção e quantificação de quantidades muito pequenas de material radioativo e as características dos scanners permitem um mapeamento espacial preciso da localização do fármaco 1 , , 3 . Por exemplo, PET permite a detecção e localização de tumores e metástases com base no nível de captação de um análogo de glicose radioactivo, [ 18 F] FDG 4 . PET também pode fornecer localização e quantificação de receptores específicos do cérebro e sua ocupação que pode ser valioso para o diagnóstico e compreensão neurológica e transtornos psiquiátricos 5 . Para desenvolverUm marcador de PET de pequena molécula, o composto de interesse deve ser marcado com um isótopo emissor de positrão, tipicamente 11 C ou 18 F. Entre estes dois radioisótopos, 18 F tem uma meia-vida mais longa (109 min vs. 20,3 para 11 C) , Que permite multi-dose e produção fora do local. No entanto, a adição de 18F a uma molécula pode ser desafiadora. 18 F requer reações rápidas compatíveis com automação, aliviando o químico de manipulação direta da atividade e recebendo doses de radiação de alta absorção. Recentemente descrevemos a utilização de N-óxidos de piridina como precursores para a fluoração de piridinas e a utilização desta química na síntese radioquímica de [18F] 3F4AP6, um análogo radiofluorado do fármaco aprovado pela FDA para esclerose múltipla, Aminopiridina (4AP) 7 , 8 , 9 . ºÉ novo radiotracer está atualmente sob investigação como um marcador PET para desmielinização 10 , 11 , 12 . Neste artigo de vídeo, demonstramos a síntese semi-automatizada deste composto utilizando uma Unidade de Síntese IBA Synthera (doravante referido como &quot;o sintetizador&quot;) e um dispositivo de hidrogenação de fluxo feito em casa. A síntese é baseada na reacção ilustrada na Figura 1 . A preparação para o procedimento demora cerca de 1 h, radiomarcação e purificação 1,5 h e procedimentos de controlo de qualidade 0,5 h.

<table><tbody><tr><td>Cyclotron produced [&lt;sup&gt;18&lt;/sup&gt;F]fluoride</td><td>House supplied/Zevacor</td><td>IBA Cyclone 18</td><td>100-200 mCi</td></tr><tr><td>Integrated fluid processor for production FLT/FDG</td><td>ABX</td><td>K-2715SYN</td><td>Cassette used for nucleophilic substitution</td></tr><tr><td>Anhydrous acetonitrile</td><td>Janssen</td><td>36431-0010</td><td>Transfer under nitrogen</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Janssen</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>ultrapure water</td><td>house supplied</td><td></td><td>Millipore MilliQ system</td></tr><tr><td>TBA-HCO3</td><td>ABX</td><td>808.0000.6</td><td>abx.de</td></tr><tr><td>QMA</td><td>Waters</td><td>WAT023525</td><td>Quaternary methyl ammonium: Anion exchange solid phase extraction cartridge for trap and release of &lt;sup&gt;18&lt;/sup&gt;F&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt; from the target water</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>ABX</td><td>K-28XX.03</td><td>Prefilled 5 mL syringes</td></tr><tr><td>Alumina-N</td><td>Waters</td><td>WAT020510</td><td>Alumina-N solid phase extraction cartridge (for trapping unreacted &lt;sup&gt;18&lt;/sup&gt;F&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;)</td></tr><tr><td>3-fluoro-4-nitropyridine N-oxide</td><td>Synthonix</td><td>76954-0</td><td>Store in desicator. Precursor</td></tr><tr><td>3-fluoro-4-aminopyridine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>704490-1G</td><td>Reference standard</td></tr><tr><td>Oxalic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75688-50G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>S80191-1</td><td></td></tr><tr><td>Triethyl amine</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>04885-1</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs</td><td>DSP-MD.43</td><td>USP</td></tr><tr><td>Final product vial</td><td>ABX</td><td>K28XX.04</td><td></td></tr><tr><td>Millex Filter Syringe</td><td>Millex</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>10% Pd/C cartridge</td><td>Sigma Aldrich</td><td>THS-01111-12EA</td><td></td></tr><tr><td>11 mm vials + crimp seals</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>03-250-618, 06-451-117, or equivalent</td><td></td></tr><tr><td>13 mm vials + crimp seals</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-718-992, 06-718-643, or equivalent</td><td></td></tr><tr><td>HPLC vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-391-16, 03-391-17, or equivalent</td><td></td></tr><tr><td>SEMIPREP C18 column</td><td>Agilent</td><td>990967-202</td><td></td></tr><tr><td>V-vials</td><td>Alltech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringes: 1, 3, 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-10D, 14-829-13Q, 14-829-18G, or equivalent</td><td></td></tr><tr><td>Compressed gases: N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, He, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Airgas</td><td>UHP N300, UHP HE300, UHP H300, or equivalent</td><td></td></tr><tr><td>TLC plates</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z193275, or equivalent</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synthera automated synthesizer</td><td>IBA SA, Belgium, iba-worldwide.com</td><td>Synthera, 250.001</td><td>Automatic synthesis unit</td></tr><tr><td>In-house hydrogenator</td><td>See picture</td><td></td><td>See text description</td></tr><tr><td>Hot cells</td><td>Comecer</td><td></td><td>For manipulating radioactive materials</td></tr><tr><td>RadioTLC scanner</td><td>Eckert and Ziegler</td><td></td><td>For handling sterile materials</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Dionex</td><td>Ultimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>Dose calibrator</td><td>Capintec</td><td>CRC15</td><td>Or equivalent</td></tr><tr><td>Gamma counter</td><td>Capintec, 7 Vreeland Road, Florham Park, NJ 07932</td><td>CRC 15, PET-CRC25, or equivalent</td><td>For measuring radioactivity</td></tr><tr><td>Personal dosimeters</td><td>Packard</td><td>Cobra II</td><td>For measuring gamma spectrum</td></tr><tr><td>Personal radiation badges and rings</td><td>Atlantic Nuclear</td><td>Rados Rad-60 Electronic Dosimeter, or equivalent</td><td></td></tr><tr><td>Rotavap + vacuum pump</td><td>Landauer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lead pigs + syringe shields</td><td>Heidolph</td><td></td><td>Or equivalent</td></tr><tr><td>Geiger counter</td><td>Pinestar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geiger counter</td><td>Ludlum</td><td>Model 3 + Pancake GM detector, 4801605, 47-1539, or equivalent</td><td></td></tr></tbody></table>

automated radiochemical synthesis of [18f]3f4ap: a novel pet tracer for imaging demyelinating diseases

3- [18F] fluoro-4-aminopiridina, [18F] 3F4AP, é um análogo radiofluorinado do fármaco aprovado pela FDA para a esclerose múltipla 4-aminopiridina (4AP). Este composto está actualmente a ser investigado como um marcador de PET para desmielinização. Recentemente descrevemos uma nova reação química para produzir piridinas metafluorinadas consistindo em fluoração direta de um N-óxido de piridina e a utilização desta reação para a síntese radioquímica de [18F] 3F4AP. Neste artigo, demonstramos como produzir este traçador usando um sintetizador automatizado e um reator de hidrogenação de fluxo feito em casa. Mostramos também os procedimentos padrão de controle de qualidade realizados antes de liberar o radiotracer para estudos pré-clínicos de imagem animal. Este procedimento semi-automatizado pode servir como base para a futura produção de [18F] 3F4AP para estudos clínicos.

A síntese radioquímica de [18F] 3F4AP compreende dois passos ( Figura 1 ). O primeiro passo é realizado de uma forma totalmente automatizada utilizando a unidade de síntese ( Figura 3 ). Este sistema baseado em cassete utiliza quatro frascos de reagente e um frasco de reator e tem válvulas controladas por computador que permitem transferência e mistura de reagentes, bem como aquecimento, pressurização e evacuação do reator. Além disso, suporta cartuchos padrão de extração em fase sólida para separação de reagentes. A interface do computador permite aos usuários escrever e modificar scripts para executar suas próprias sínteses. No caso de [18F] 3F4AP, o procedimento de síntese é composto por cinco partes básicas. Na primeira parte, o sintetizador executa etapas de auto-verificação, pré-aquece o reator e espera o sinal do operador de que o 18 F está pronto. Durante a segunda parte, o flúor [18F] é transferido paraM o frasco de 18F no cartucho de permuta aniónica e eluiu-se do cartucho para o reactor utilizando uma solução de bicarbonato de tetrabutilamónio. A terceira parte, o sintetizador seca azeotropicamente o flúor [18F] sob vácuo para torná-lo reativo em relação ao deslocamento nucleofílico. Na quarta parte, o precursor é automaticamente adicionado ao reactor onde reage com o 18 F - para gerar o composto marcado. Finalmente, a reacção é desactivada pela adição de ácido oxálico a 0,2% em metanol, o que evita a decomposição promovida pela base do produto e a solução final é transferida sob pressão para o frasco de recolha depois de passar através de um cartucho de alumina N que prende qualquer Fluoreto não reagido. Após o passo de marcação ser completado, uma pequena amostra pode ser tomada para controlo de qualidade. A execução de uma amostra na HPLC fornece confirmação de que a etapa de rotulagemDa pureza radioquímica ( Figura 4 ). Além disso, a partir do traçado UV na HPLC a quantidade de massa do produto pode ser calculada utilizando uma curva de calibração pré-estabelecida. Enquanto a HPLC de controlo de qualidade em processo está a decorrer, é realizado o segundo passo de reacção, redução dos grupos N-óxido e nitro. Para fazer isto, o produto marcado é injectado automati- camente num dispositivo de hidrogenação interno baseado no método publicado por Yoswathananont et ai. 13 ( Figura 2 ). Este dispositivo é constituído por uma bomba de HPLC e um tanque de hidrogénio comprimido ligado ao dispositivo de hidrogenação de fluxo através de linhas equipadas com válvulas de retenção para impedir o retrocesso. O produto é empurrado pela bomba de HPLC e misturado com hidrogénio num misturador em forma de T. Esta mistura é então passada através de um pequeno cartucho contendo catalisador Pd / C a 10% num suporte sólido. Depois de passar pela cataO produto reduzido é então recolhido em pequenas fracções. Após hidrogenação, o produto bruto é transportado e injectado manualmente na HPLC para purificação do produto final ( Figura 5 ). A fase móvel da HPLC foi seleccionada para ser compatível com a injecção animal. Os picos correspondentes ao produto são então recolhidos e esterilizados por filtração para se obter a dose final. Antes de libertar a dose para os estudos de imagem PET, são realizados testes de controlo de qualidade. Estes testes são realizados para garantir que o traçador é a entidade química que é suposto ser e que é seguro para a injeção. Alguns desses testes podem não ser necessários para injeção em animais, mas geralmente é recomendado seguir as diretrizes de uso humano. Isso garante a qualidade do produto, o que aumenta a confiança nos resultados eTransição para a fabricação do produto para injeção humana. A Tabela 1 contém os parâmetros de síntese típicos incluindo a quantidade inicial de radioactividade, a quantidade inicial de precursor, o rendimento para cada passo, a actividade específica, a filtragem perde, etc. Estes parâmetros são úteis para a resolução de falhas ocasionais e futura optimização do procedimento. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55537/55537fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema de reacção. A síntese radioquímica consiste na marcação por troca de 19 F / 18F seguida de hidrogenação catalisada por paládio. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55537/55537fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2"<html> Src = &quot;/ files / ftp_upload / 55537 / 55537fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. Sistema de hidrogenação. Esquema do dispositivo. Este dispositivo é baseado na publicação de Yoswathananont et al. (Ref. 13). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55537/55537fig3.jpg" /> Figura 3. Esquema do processador de fluidos integrado (IFP) e dos reagentes do sintetizador. O IFP contém quatro frascos de reagente, um cartucho QMA e um frasco de um reactor. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55537/55537fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55537/55537fig4.jpg" /> Figura 4. Traçadores UV e radioHPLC para produto intermediário. 3-fluoro-4-nitropiridina tem uma absorção característica a 313 nm.E.jove.com/files/ftp_upload/55537/55537fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55537/55537fig5.jpg" /> Figura 5. Traçadores UV e radioHPLC para o produto final. 3-fluoro-4-amino-piridina absorve a 254 nm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55537/55537fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Conceito </td><td> Média (n = 4) </td><td> SD </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Actividade inicial de 18 F (mCi) </td><td> 148,0 </td><td> 44,9 </td><td> Início da síntese </td></tr><tr><td> Quantidade de precursor (μg) </td><td> 50 </tD <td></td><td> Use 50 μL de estoque de 1,0 mg / mL </td></tr><tr><td> Atividade deixada em QMA (mCi) </td><td> 3,0 </td><td> 1,7 </td><td> Medido no final do passo de marcação </td></tr><tr><td> Rendimento de radiomarcação </td><td> 29,7% </td><td> 6,3% </td><td> Act_collection_vial ÷ (Act_collection_vial + Act_AluN) </td></tr><tr><td> Pureza radioquímica (HPLC-1) </td><td> &gt; 98% </td><td></td><td> De HPLC-1 QC </td></tr><tr><td> Spec. Aja. Intermediï¿½io (mCi / ï¿½ol) </td><td> 122,9 </td><td> 29,7 </td><td> A partir da HPLC-1 utilizando curva de calibração </td></tr><tr><td> Recuperação de hidrogenação (dc) </td><td> 74% </td><td> 9,0% </td><td> Corrigido para decaimento </td></tr><tr><td> Pureza radioquímica de HPLC (HPLC-2) </td><td> 90,7% </td><td> 2,9% </td><td> Calculado a partir de HPLC-2 </td></tr><tr><td> Eficiência de secagem </td><td> &gt; 98% </td><td></td><td> Corrigido para decaimento </td></tr><tr><td> Filtragem da recuperação </td><td> 93,5% </td><td> 1,7% </td><td> Corrigido para decaimento </td></tr><tr><td> Volume de dose (mL) </td><td> 3,3 </td><td></td><td> Colete as frações com maior radioatividade </td></tr><tr><td> Spec. Aja. Produto final (mCi / μmol) </td><td> 75,5 </td><td> 30,0 </td><td> A partir da HPLC-3 utilizando curva de calibração </td></tr><tr><td> Eficiência de síntese </td><td> 8,5% </td><td> 3,6% </td><td> Correção de não-decaimento </td></tr><tr><td> Tempo de síntese (min) </td><td> 104 </td><td> 11,2 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Parâmetros de síntese radioquímica. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Problemas comuns </td><td> Razões e soluções possíveis </td></tr><tr><td rowspan="3"> O fluoreto de [18F] não é eluído eficientemente a partir do QMA </td><td> · TBA-HCO 3 não foi preparado corretamente. Assegurar que a concentração é adequada. </td></tr><tr><td> · Há vazamentos no frasco TBA-HCO 3 . Certifique-se de que o vedante de aperto está apertado eo septo não é perfurado antes de instalá-lo no IFP. </td></tr><tr><td> · TBA-HCO 3 não está em boas condições. Peça um lote novo. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Rendimento de rotulagem baixo </td><td> · Há umidade na solução precursora. Precursor seco e solventes. </td></tr><tr><td> · A temperatura é muito baixa. </td></tr><tr><td rowspan="3"> A solução de reação é amarela </td><td> · O produto está em decomposição devido à base. Utilizar menos TBA-HCO 3 . </td></tr><tr><td> HáOo muito precursor. Use menos precursor. </td></tr><tr><td> · Há muito pouco solvente para a quantidade de 18 F - . Use mais solvente. </td></tr><tr><td> Picos adicionais em radioHPLC </td><td> · O grupo Nitro está sendo substituído: reduz a temperatura da reação ou encurta o tempo de reação. </td></tr><tr><td rowspan="3"> A reação de hidrogenação não funciona </td><td> · Catalisador não é bom. Use um novo cartucho. </td></tr><tr><td> · O fluxo é muito rápido e não permite contato suficiente entre o catalisador eo substrato. Diminuir o fluxo. </td></tr><tr><td> · A pressão do hidrogénio é demasiado baixa. Aumente a pressão de H2. </td></tr><tr><td> A pressão do hidrogênio aumenta dramaticamente durante o procedimento </td><td> · A integridade do cartucho está comprometida eo suporte sólido está obstruindo as linhas. Pare o fluxo e desligue o gás. Deixe a radioactividade cair. Remova o cartucho de catalisador e lave o sistema. Coloque umEw cartucho. </td></tr><tr><td> O rendimento de hidrogenação é baixo </td><td> · Demasiadas impurezas que competem pelo catalisador (MeCN, ácido oxálico). Diminuir a quantidade de impurezas ou aumentar a massa do precursor (Atenção: o aumento da quantidade de precursor reduzirá a atividade específica). </td></tr><tr><td rowspan="2"> A recuperação da radioactividade do passo de hidrogenação é baixa </td><td> · Há um vazamento no sistema. Verifique se há vazamentos e refluxo na linha de hidrogênio. </td></tr><tr><td> · O composto está defluorando no reator. Avaliar diferentes condições de reação (pressão, temperatura, fluxo, etc. ). </td></tr><tr><td rowspan="2"> Demasiada radioactividade é perdida durante a filtração </td><td> · Molhe o filtro antes de usar. </td></tr><tr><td> · Use filtro com um volume morto inferior. </td></tr><tr><td rowspan="4"> O pico do produto final na HPLC parece largo </td><td> · Muito volume injetado. Inject lower amOunt. Use coluna com maior diâmetro. </td></tr><tr><td> · A coluna não está bem condicionada. Condição da coluna para pelo menos 30 volumes de coluna. </td></tr><tr><td> · O pH da fase móvel é baixo. Certifique-se de que o pH ≥ 8. </td></tr><tr><td> · A coluna não está em boas condições. Substituir coluna. Use coluna compatível com pH básico. </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Guia de solução de problemas.

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Automated Radiochemical Synthesis of [18F]3F4AP: A Novel PET Tracer for Imaging Demyelinating Diseases

Demonstramos a síntese radioquímica semi-automatizada de [18F] 3F4AP e procedimentos de controle de qualidade.

Automotive Radiochemical Synthesis of [<sup&gt; 18</sup&gt; F] 3F4AP: Um novo marcador de PET para imagens de doenças desmielinizantes

3-[18F]fluoro-4-aminopyridine, [18F]3F4AP, is a radiofluorinated analog of the FDA-approved drug for multiple sclerosis 4-aminopyridine (4AP). This ...

automated-radiochemical-synthesis-18f3f4ap-novel-pet-tracer-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Automated Radiochemical Synthesis of [18F]3F4AP: A Novel PET Tracer for Imaging Demyelinating Diseases

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Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis remains incomplete. In vivo models are paramount for metastasis research, but require refinement. Tracking spontaneous metastasis by non-invasive in vivo imaging is now possible, but remains challenging as it requires long-time observation and high sensitivity. We describe a longitudinal combined radionuclide and fluorescence whole-body in vivo imaging approach for tracking tumor progression and spontaneous metastasis. This reporter gene methodology employs the sodium iodide symporter (NIS) fused to a fluorescent protein (FP). Cancer cells are engineered to stably express NIS-FP followed by selection based on fluorescence-activated cell sorting. Corresponding tumor models are established in mice. NIS-FP expressing cancer cells are tracked non-invasively in vivo at the whole-body level by positron emission tomography (PET) using the NIS radiotracer [18F]BF4-. PET is currently the most sensitive in vivo imaging technology available at this scale and enables reliable and absolute quantification. Current methods either rely on large cohorts of animals that are euthanized for metastasis assessment at varying time points, or rely on barely quantifiable 2D imaging. The advantages of the described method are: (i) highly sensitive non-invasive in vivo 3D PET imaging and quantification, (ii) automated PET tracer production, (iii) a significant reduction in required animal numbers due to repeat imaging options, (iv) the acquisition of paired data from subsequent imaging sessions providing better statistical data, and (v) the intrinsic option for ex vivo confirmation of cancer cells in tissues by fluorescence microscopy or cytometry. In this protocol, we describe all steps required for routine NIS-FP-afforded non-invasive in vivo cancer cell tracking using PET/CT and ex vivo confirmation of in vivo results. This protocol has applications beyond cancer research whenever in vivo localization, expansion and long-time monitoring of a cell population is of interest.

We describe a protocol for preclinical in vivo tracking of cancer metastasis. It is based on a radionuclide-fluorescence reporter combining the sodium iodide symporter, detected by non-invasive [18F]tetrafluoroborate-PET, and a fluorescent protein for streamlined ex vivo confirmation. The method is applicable for preclinical in vivo cell tracking beyond tumor biology.

Radionuclídeo-fluorescência Gene do repórter de imagem para controlar a progressão do Tumor em modelos de roedores Tumor

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Pesquisa do câncer

Automation of a Positron-emission Tomography (PET) Radiotracer Synthesis Protocol for Clinical Production

The development of new positron-emission tomography (PET) tracers is enabling researchers and clinicians to image an increasingly wide array of biological targets and processes. However, the increasing number of different tracers creates challenges for their production at radiopharmacies. While historically it has been practical to dedicate a custom-configured radiosynthesizer and hot cell for the repeated production of each individual tracer, it is becoming necessary to change this workflow. Recent commercial radiosynthesizers based on disposable cassettes/kits for each tracer simplify the production of multiple tracers with one set of equipment by eliminating the need for custom tracer-specific modifications. Furthermore, some of these radiosynthesizers enable the operator to develop and optimize their own synthesis protocols in addition to purchasing commercially-available kits. In this protocol, we describe the general procedure for how the manual synthesis of a new PET tracer can be automated on one of these radiosynthesizers and validated for the production of clinical-grade tracers. As an example, we use the ELIXYS radiosynthesizer, a flexible cassette-based radiochemistry tool that can support both PET tracer development efforts, as well as routine clinical probe manufacturing on the same system, to produce [18F]Clofarabine ([18F]CFA), a PET tracer to measure in vivo deoxycytidine kinase (dCK) enzyme activity. Translating a manual synthesis involves breaking down the synthetic protocol into basic radiochemistry processes that are then translated into intuitive chemistry &#34;unit operations&#34; supported by the synthesizer software. These operations can then rapidly be converted into an automated synthesis program by assembling them using the drag-and-drop interface. After basic testing, the synthesis and purification procedure may require optimization to achieve the desired yield and purity. Once the desired performance is achieved, a validation of the synthesis is carried out to determine its suitability for the production of the radiotracer for clinical use.

Automation of a Positron-emission Tomography PET Radiotracer Synthesis Protocol for Clinical Production

Positron-emission tomography (PET) imaging sites that are involved in multiple early clinical research trials need robust and versatile radiotracer manufacturing capabilities. Using the radiotracer [18F]Clofarabine as an example, we illustrate how to automate the synthesis of a radiotracer using a flexible, cassette-based radiosynthesizer and validate the synthesis for clinical use.

Automação de um protocolo de síntese Positron emission Tomography (PET) Radiotracer para produção clínica

The development of new positron-emission tomography (PET) tracers is enabling researchers and clinicians to image an increasingly wide array of biological ...

Química

Radiotracer Administration for High Temporal Resolution Positron Emission Tomography of the Human Brain: Application to FDG-fPET

Functional positron emission tomography (fPET) provides a method to track molecular targets in the human brain. With a radioactively-labelled glucose analogue, 18F-fluordeoxyglucose (FDG-fPET), it is now possible to measure the dynamics of glucose metabolism with temporal resolutions approaching those of functional magnetic resonance imaging (fMRI). This direct measure of glucose uptake has enormous potential for understanding normal and abnormal brain function and probing the effects of metabolic and neurodegenerative diseases. Further, new advances in hybrid MR-PET hardware make it possible to capture fluctuations in glucose and blood oxygenation simultaneously using fMRI and FDG-fPET.
The temporal resolution and signal-to-noise of the FDG-fPET images is critically dependent upon the administration of the radiotracer. This work presents two alternative continuous infusion protocols and compares them to a traditional bolus approach. It presents a method for acquiring blood samples, time-locking PET, MRI, experimental stimulus, and administering the non-traditional tracer delivery. Using a visual stimulus, the protocol results show cortical maps of the glucose-response to external stimuli on an individual level with a temporal resolution of 16 s.

This manuscript describes two radiotracer administration protocols for FDG-PET (constant infusion and bolus plus infusion) and compares them to bolus administration. Temporal resolutions of 16 s are achievable using these protocols.

Administração do radiotracer para a tomografia de emissão de positrão de alta resolução temporal do cérebro humano: aplicação para FDG-fPET

Functional positron emission tomography (fPET) provides a method to track molecular targets in the human brain. With a radioactively-labelled glucose ...

Comportamento

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands for in vivo investigations. Within this protocol, a robust and reliable remote-controlled radiosynthesis of [11C]SNAP-7941, an antagonist to the melanin-concentrating hormone receptor 1, is described. The radiosynthesis starts with cyclotron produced [11C]CO2 that is subsequently further reacted via a gas-phase transition to [11C]CH3OTf. Then, this reactive intermediate is introduced to the precursor solution and forms the respective radiotracer. Chemical as well as the radiochemical purity are determined by means of RP-HPLC, routinely implemented in the radiopharmaceutical quality control process. Additionally, the molar activity is calculated as it is a necessity for the following real-time kinetic investigations. Furthermore, [11C]SNAP-7941 is applied to MDCKII-WT and MDCKII-hMDR1 cells for evaluating the impact of P-glycoprotein (P-gp) expression on cell accumulation. For this reason, the P-gp expressing cell line (MDCKII-hMDR1) is either used without or with blocking prior to experiments by means of the P-gp substrate (&#177;)-verapamil and the results are compared to the ones observed for the wildtype cells. The overall experimental approach demonstrates the importance of a precise time-management that is essential for every preclinical and clinical study using PET tracers radiolabelled with short-lived nuclides, such as carbon-11 (half-life: 20 min).

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Here, we represent a protocol for the fully automated radiolabelling of [11C]SNAP-7941 and the analysis of the real-time kinetics of this PET-tracer on P-gp expressing and non-expressing cells.

Aspecto técnico da síntese automatizada e avaliação cinética em tempo real de [11C] SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...

Solid Phase 11C-Methylation, Purification and Formulation for the Production of PET Tracers

Routine production of radiotracers used in positron emission tomography (PET) mostly relies on wet chemistry where the radioactive synthon reacts with a non-radioactive precursor in solution. This approach necessitates purification of the tracer by high performance liquid chromatography (HPLC) followed by reformulation in a biocompatible solvent for human administration. We recently developed a novel 11C-methylation approach for the highly efficient synthesis of carbon-11 labeled PET radiopharmaceuticals, taking advantage of solid phase cartridges as disposable &#34;3-in-1&#34; units for the synthesis, purification and reformulation of the tracers. This approach obviates the use of preparative HPLC and reduces the losses of the tracer in transfer lines and due to radioactive decay. Furthermore, the cartridge-based technique improves synthesis reliability, simplifies the automation process and facilitates compliance with the Good Manufacturing Practice (GMP) requirements. Here, we demonstrate this technique on the example of production of a PET tracer Pittsburgh compound B ([11C]PiB), a gold standard in vivo imaging agent for amyloid plaques in the human brains.

Solid Phase 11C-Methylation, Purification and Formulation for the Production of PET Tracers

We report an efficient carbon-11 radiolabeling technique to produce clinically relevant tracers for Positron Emission Tomography (PET) using solid phase extraction cartridges. 11C-methylating agent is passed through a cartridge preloaded with precursor and successive elution with aqueous ethanol provides chemically and radiochemically pure PET tracers in high radiochemical yields.

Fase sólida 11C-metilação, purificação e formulação para a produção de traçadores PET

Routine production of radiotracers used in positron emission tomography (PET) mostly relies on wet chemistry where the radioactive synthon reacts with a ...

18F-Labeling of Radiotracers Functionalized with a Silicon Fluoride Acceptor (SiFA) for Positron Emission Tomography

The para-substituted di-tert-butylfluorosilylbenzene structural motif known as the silicon-fluoride acceptor (SiFA) is a useful tag in the radiochemist&#39;s toolkit for incorporating radioactive [18F]fluoride into tracers for use in positron emission tomography. In comparison to conventional radiolabeling strategies, isotopic exchange of fluorine-19 from SiFA with [18F]fluoride is carried out at room temperature and requires minimal reaction participants. The formation of by-products is thus negligible, and purification is greatly simplified. However, while the precursor molecule used for labeling and the final radiolabeled product are isotopically discrete, they are chemically identical and are thus inseparable during purification procedures. The SiFA tag is also susceptible to degradation under the basic conditions arising from the processing and drying of [18F]fluoride. The &#39;4 drop method&#39;, wherein only the first 4 drops of eluted [18F]fluoride are used from the solid-phase extraction, reduces the amount of base in the reaction, facilitates lower molar amounts of precursor, and reduces degradation.

18F-Labeling of Radiotracers Functionalized with a Silicon Fluoride Acceptor SiFA for Positron Emission Tomography

The synthesis of fluorine-18 (18F) labeled radiopharmaceuticals for positron emission tomography typically requires months of experience. When incorporated into a radiotracer, the silicon-fluoride acceptor (SiFA) motif enables a simple 18F-labeling protocol that is independent of costly equipment and preparatory training, while reducing precursor quantity needed and utilizing milder reaction conditions.

18 F-Rotulagem de Radiotracers Funcionalizado com um Acceptor de Fluoreto de Silício (SiFA) para Tomografia de Emissão de Pósitrons

The para-substituted di-tert-butylfluorosilylbenzene structural motif known as the silicon-fluoride acceptor (SiFA) is a useful tag in the ...

Radiosynthesis of 1-(2-[18F]Fluoroethyl)-L-Tryptophan using a One-pot, Two-step Protocol

The kynurenine pathway (KP) is a primary route for tryptophan metabolism. Evidence strongly suggests that metabolites of the KP play a vital role in tumor proliferation, epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric illnesses due to their immune-modulatory, neuro-modulatory, and neurotoxic effects. The most extensively used positron emission tomography (PET) agent for mapping tryptophan metabolism, &#945;-[11C]methyl-L-tryptophan ([11C]AMT), has a short half-life of 20 min with laborious radiosynthesis procedures. An onsite cyclotron is required to radiosynthesize [11C]AMT. Only a limited number of centers produce [11C]AMT for preclinical studies and clinical investigations. Hence, the development of an alternative imaging agent that has a longer half-life, favorable in vivo kinetics, and is easy to automate is urgently needed. The utility and value of 1-(2-[18F]fluoroethyl)-L-tryptophan, a fluorine-18-labeled tryptophan analog, has been reported in preclinical applications in cell line-derived xenografts, patient-derived xenografts, and transgenic tumor models.
This paper presents a protocol for the radiosynthesis of 1-(2-[18F]fluoroethyl)-L-tryptophan using a one-pot, two-step strategy. Using this protocol, the radiotracer can be produced in a 20 &#177; 5% (decay corrected at the end of synthesis, n &#62; 20) radiochemical yield, with both radiochemical purity and enantiomeric excess of over 95%. The protocol features a small precursor amount with no more than 0.5 mL of reaction solvent in each step, low loading of potentially toxic 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabicyclo[8.8.8]hexacosane (K222), and an environmentally benign and injectable mobile phase for purification. The protocol can be easily configured to produce 1-(2-[18F]fluoroethyl)-L-tryptophan for clinical investigation in a commercially available module.

Radiosynthesis of 1-2-[18F]Fluoroethyl-L-Tryptophan using a One-pot, Two-step Protocol

Here, we describe the radiosynthesis of 1-(2-[18F]Fluoroethyl)-L-tryptophan, a positron emission tomography imaging agent for studying tryptophan metabolism, using a one-pot, two-step strategy in a radiochemistry synthesis system with good radiochemical yields, high enantiomeric excess, and high reliability.

Radiosíntese de 1-(2-[18F]Fluoroethyl)-L-Triptofano usando um Protocolo de Dois Passos de Um pote e Duas etapas

The kynurenine pathway (KP) is a primary route for tryptophan metabolism. Evidence strongly suggests that metabolites of the KP play a vital role in tumor ...

Automated Production of [68Ga]Ga-FAPI-46 on the iPHASE MultiSyn Synthesizer

An Automated Radiosynthesis of [68Ga]Ga-FAPI-46 for Routine Clinical Use

[68Ga]Ga-FAPI-46 is a promising new tracer for the imaging of fibroblast activation protein (FAP) by positron emission tomography (PET). Labeled FAP inhibitors (FAPIs) have demonstrated uptake in various types of cancers, including breast, lung, prostate, pancreatic and colorectal cancer. FAPI-PET also possesses a practical advantage over FDG-PET as fasting and resting are not required. [68Ga]Ga-FAPI-46 exhibits enhanced pharmacokinetic properties, improved tumor retention, and higher contrast images than the earlier presented [68Ga]Ga-FAPI-02 and [68Ga]Ga-FAPI-04. Although a manual synthesis protocol for [68Ga]Ga-FAPI-46 was initially described, in recent years, automated methods using different commercial synthesizers have been reported.
In this work, we describe the development of the automated synthesis of [68Ga]Ga-FAPI-46 using the iPHASE MultiSyn synthesizer for clinical applications. Initially, optimization of the reaction time and comparison of the performance of four different solid phase extraction (SPE) cartridges for final product purification were investigated. Then, the development and validation of the production of 0.6-1.7 GBq of [68Ga]Ga-FAPI-46 were conducted using these optimized parameters. The product was synthesized in 89.8 &#177; 4.8% decay corrected yield (n = 6) over 25 min. The final product met all recommended quality control specifications and was stable up to 3 h post synthesis.

This work describes the automated production of up to 1.7 GBq of [68Ga]Ga-FAPI-46 on the iPHASE MultiSyn synthesizer for PET imaging of fibroblast activation protein.

[68Ga]Ga-FAPI-46 is a promising new tracer for the imaging of fibroblast activation protein (FAP) by positron emission tomography (PET). Labeled FAP ...

Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate ([18F]SFB)

Biomolecules, including peptides,1-9 proteins,10,11 and antibodies and their engineered fragments,12-14 are gaining importance as both potential therapeutics and molecular imaging agents. Notably, when labeled with positron-emitting radioisotopes (e.g., Cu-64, Ga-68, or F-18), they can be used as probes for targeted imaging of many physiological and pathological processes.15-18 Therefore, significant effort has devoted to the synthesis and exploration of 18F-labeled biomolecules. Although there are elegant examples of the direct 18F-labeling of peptides,19-22 the harsh reaction conditions (i.e., organic solvent, extreme pH, high temperature) associated with direct radiofluorination are usually incompatible with fragile protein samples. To date, therefore, the incorporation of radiolabeled prosthetic groups into biomolecules remains the method of choice.23,24
N-Succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate ([18F]SFB),25-37 a Bolton-Hunter type reagent that reacts with the primary amino groups of biomolecules, is a very versatile prosthetic group for the 18F-labeling of a wide spectrum of biological entities, in terms of its evident in vivo stability and high radiolabeling yield. After labeling with [18F]SFB, the resulting [18F]fluorobenzoylated biomolecules could be explored as potential PET tracers for in vivo imaging studies.1 Most [18F]SFB radiosyntheses described in the current literatures require two or even three reactors and multiple purifications by using either solid phase extraction (SPE) or high-performance liquid chromatography (HPLC). Such lengthy processes hamper its routine production and widespread applications in the radiolabeling of biomolecules. Although several module-assisted [18F]SFB syntheses have been reported,29-32, 41-42 they are mainly based on complicated and lengthy procedures using costly commercially-available radiochemistry boxes (Table 1). Therefore, further simplification of the radiosynthesis of [18F]SFB using a low-cost setup would be very beneficial for its adaption to an automated process.
Herein, we report a concise preparation of [18F]SFB, based on a simplified one-pot microwave-assisted synthesis (Figure 1). Our approach does not require purification between steps or any aqueous reagents. In addition, microwave irradiation, which has been used in the syntheses of several PET tracers,38-41 can gives higher RCYs and better selectivity than the corresponding thermal reactions or they provide similar yields in shorter reaction times.38 Most importantly, when labeling biomolecules, the time saved could be diverted to subsequent bioconjugation or PET imaging step.28,43 The novelty of our improved [18F]SFB synthesis is two-fold: (1) the anhydrous deprotection strategy requires no purification of intermediate(s) between each step and (2) the microwave-assisted radiochemical transformations enable the rapid, reliable production of [18F]SFB.

Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate [18F]SFB

A facile, one-pot synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate ([18F]SFB) was developed based on a non-aqueous, three-step radiochemical process. Using microwave heating, the entire procedure can be completed in less than 30 min, or 60 min with further purification by preparative HPLC. The decay-corrected radiochemical yields (RCYs) were 35-5% (n > 30).

Síntese assistida por microondas, um pote de N-Succinimidyl-4-[ 18 F] fluorobenzoate ([ 18 F] SFB)

Biomolecules, including peptides,1-9 proteins,10,11 and antibodies and their engineered fragments,12-14 are gaining importance as both potential ...

Biologia

Semi-quantitative Assessment Using [18F]FDG Tracer in Patients with Severe Brain Injury

Patients with severe traumatic brain injury (sTBI) have difficulty knowing whether they are accurately expressing their thoughts and emotions because of disorders of consciousness, disrupted higher brain function, and verbal disturbances. As a consequence of an insufficient ability to communicate, objective evaluations are needed from family members, medical staff, and caregivers. One such evaluation is the assessment of functioning brain areas. Recently, multimodal brain imaging has been used to explore the function of damaged brain areas. [18F]-fluorodeoxyglucose positron emission tomography-computed tomography ([18F]FDG-PET/CT) is a successful tool for examining brain function. However, the assessment of brain glucose metabolism based on [18F]FDG-PET/CT is not standardized and depends on several varying parameters, as well as the patient&#39;s condition. Here, we describe a series of semiquantitative assessment protocols for a region-of-interest (ROI) image analysis using self-produced [18F]FDG tracers in patients with sTBI. The protocol focuses on screening the participants, preparing the [18F]FDG tracer in the hot lab, scheduling the acquisition of [18F]FDG-PET/CT brain images, and measuring glucose metabolism using the ROI analysis from a targeted brain area.

Semi-quantitative Assessment Using [18F]FDG Tracer in Patients with Severe Brain Injury

[18F]-fluorodeoxyglucose (FDG) positron emission tomography-computed tomography is useful for studying glucose metabolism related to brain function. Here, we present a protocol for an [18F]FDG tracer set-up and semiquantitative assessment of the region-of-interest analysis for targeted brain areas associated with clinical manifestations in patients with severe traumatic brain injury.

Avaliação semi-quantitativa usando [18F] FDG Tracer em pacientes com lesão cerebral grave

Patients with severe traumatic brain injury (sTBI) have difficulty knowing whether they are accurately expressing their thoughts and emotions because of ...

Automotive Radiochemical Synthesis of [

Resumo

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Radionuclídeo-fluorescência Gene do repórter de imagem para controlar a progressão do Tumor em modelos de roedores Tumor

Automação de um protocolo de síntese Positron emission Tomography (PET) Radiotracer para produção clínica

Administração do radiotracer para a tomografia de emissão de positrão de alta resolução temporal do cérebro humano: aplicação para FDG-fPET

Aspecto técnico da síntese automatizada e avaliação cinética em tempo real de [¹¹C] SNAP-7941

Fase sólida ¹¹C-metilação, purificação e formulação para a produção de traçadores PET

¹⁸ F-Rotulagem de Radiotracers Funcionalizado com um Acceptor de Fluoreto de Silício (SiFA) para Tomografia de Emissão de Pósitrons

Radiosíntese de 1-(2-[^18F]Fluoroethyl)-L-Triptofano usando um Protocolo de Dois Passos de Um pote e Duas etapas

An Automated Radiosynthesis of [⁶⁸Ga]Ga-FAPI-46 for Routine Clinical Use

Síntese assistida por microondas, um pote de N-Succinimidyl-4-[¹⁸ F] fluorobenzoate ([¹⁸ F] SFB)

Avaliação semi-quantitativa usando [¹⁸F] FDG Tracer em pacientes com lesão cerebral grave