Este estudo foi financiado pelo Departamento de Energia dos EUA (DE-FG02-09ER09-08 e DE-PS02-09ER09-18), a Jonsson Comprehensive Cancer Center da UCLA, e da Indústria-Universidade Programa Cooperativo de Pesquisa (UC Discovery Grant, bio07 -10665). Agradecemos ao Dr. Nagichettiar Satyamurthy e equipes no Centro de UCLA Cyclotron Biomédica para fornecer o F-18 radioisótopos e discussões perspicaz muitos. Agradecemos a drs. Michael Collins, Greg Leblanc, Joseph Lambert, e Keller Barnhardt de CEM para os seus conselhos e apoio técnico. Agradecemos a Dirk Williams, Darin Williams, os drs. Joseph Lin Hong Dun, e Michael van Dam para peças de design e de usinagem para modificar o reator de microondas CEM e para os módulos de purificação SPE.

1. Preparativos iniciais <ol><li> Um frasco de V-(5-mL) RV1 (com agitação bar) é usado como vaso de reação principal para a realização de síntese de microondas. Ele é conectado a um adaptador de PEEK com sete entrada / saída portas conecta e colocado dentro da cavidade de microondas (ver figura 2). RV2 está ligado ao cartucho de SPE (I) para recolher o crude [18 F] SFB. RV3 está ligado ao cartucho de SPE (II) para coletar o final [18 F] solução SFB. Ele pode ser colocado em um banho de água quente (40 ° C) para concentrar a solução correspondente antes de reconstituir em tampão PBS, especialmente para a radiomarcação a jusante de biomoléculas. </li><li> Configuração para a recolha de crude [18 F] SFB: Encha MeCN / H 2 O [6 mL; 1:4 (v: v)] solução, 5% ácido acético aquoso (8 mL), MeCN (2 mL) para reservatório A, B e C, respectivamente. Em seguida, ativar um cartucho de SPE (I) (poliestireno, Merck LiCholut PT) com etanol (10 mL), seguido por 5% ácido acético aquoso de lavar (10 mL). </li><li> Configuração para a coleta purificada [18 F] SFB: Prepare reservatório D e E preenchida com 10 ml de H 2 O e 3 ml de éter etílico, respectivamente. O segundo cartucho de SPE (II) (poliestireno, Merck LiCholut PT) é ativado pelo mesmo procedimento mencionado acima. </li><li> Iniciar o HPLC (eluição buffer: MeCN / H 2 O, 1:1 (v / v) contendo 0,2% TFA; taxa de fluxo: 3 ml / min) para o condicionamento pré-coluna HPLC [a coluna em fase reversa semi-prep (Luna, 5 mm C18 (2) 100 A, 250 x 10 mm), Phenomenex, Torrance, CA, EUA]. </li></ol> 2. Preparação de secas [isto é, não portadora agregado, (NCA)] [18 F] flúor <ol><li> [18 F] flúor na solução [18 O] H 2 O (100 mL) foi adicionado a uma mistura de Kryptofix 222 (20 mg), 1M aquoso K 2 CO 3 (26 mL) e MeCN (0,8 mL) em um Eppendorf tubo. Toda a solução é então misturado bem antes de transferir para a via de entrada de linha RV1 1. [18 F] flúor solução também pode ser passado através de um cartucho de troca aniônica (por exemplo, QMA-light Sep-Pak de Águas) para prender o flúor-18 e, em seguida eluído com uma mistura de K 2 CO 3 e Kryptofix em MeCN. </li><li> Executar a seqüência de secagem (20W, 3 min), sob o programa de controle de microondas para remover a água residual em RV1 [no vácuo]. Após o resfriamento a temperatura do sistema está abaixo de 50 ° C, MeCN adicionais (1,0 mL) foi introduzido no reator ea seqüência é repetida uma vez. </li></ol> 3. Síntese de etil 4 - [18 F] fluorobenzoate <ol><li> Para uma solução de DMSO (0,4 mL) contendo etil 4 - (N, N, N-trimetilamônio) benzoato triflate (1,5 mg) foi adicionado em RV1 via linha de entrada 2. </li><li> Execute a seqüência de Etiquetagem (50W, 1 min) no âmbito do programa de controle de microondas com refrigeração navio mexendo, e todas as válvulas fechadas para pagar etílico 4 - [18 F] fluorobenzoate ([18 F] 2). </li></ol> 4. Síntese de 4 de potássio - [18 F] fluorobenzoate <ol><li> Para uma solução de DMSO (0,5 mL) contendo KOtBu (13 mg) foi adicionado em RV1 via linha de entrada 3. </li><li> Executar o programa desproteger (40 W, 1 min) no âmbito do programa de controle de microondas com refrigeração navio mexendo, e todas as válvulas fechadas para arcar com o 4 - [18 F] fluorobenzoate sal ([18 F] 3). </li></ol> 5. Síntese de crude [18 F] SFB <ol><li> Para uma solução de acetonitrila (2,5 mL) contendo TSTU (30 mg) foi adicionado em RV1 via linha de entrada 6. TSTU é a umidade e sensível à luz. Deve ser aliquotado em pequeno frasco e armazenados a 4 ° C em um recipiente fechado, cobertas por folhas de alumínio. </li><li> Execute seqüência de acoplamento (30W, 2 min), sob o programa de controle de Microondas com refrigeração navio mexendo, e todas as válvulas fechadas para pagar o crude [18 F] SFB. </li></ol> 6. A Preparação do SPE-purificada [18 F] SFB <ol><li> 5% ácido acético aquoso (1,0 mL) foi adicionado em RV1 via linha de entrada 7 para neutralizar a mistura de reação. A solução foi então transferida para B frasco contendo 8 ml de ácido acético 5% aquoso (Figura 2). </li><li> Passe a mistura de reação diluída através de cartucho de SPE (I) para prender crude [18 F] SFB utilizando nitrogênio (10 psi). </li><li> WASH SPE cartucho (I) com uma mistura de MeCN e H 2 O [10 mL, 1:4 (v: v)] do reservatório A. </li><li> [18 F] SFB foi eluída fora em RV2 usando MeCN (2 mL) do reservatório C. </li></ol> 7. Purificação do bruto [18 F] SFB com a Rádio-HPLC <ol><li> Diluir ou crude [18 F] SFB ou SPE-purificada [18 F] SFB com H 2 O (2 mL) em RV2 e transferir a mistura para o loop HPLC (5 mL). A solução foi injetado o rádio-HPLC [MeCN / H 2 O, 1:1 (v / v) contendo 0,2% TFA; taxa de fluxo: 3 mL / min]. </li><li> Recolher a fração purificada contendo [18 F] SFB (retenção time: 8-10 minutos) no frasco D (pré-cheias com 10 ml de H 2 O) (Figura 2). Etapa crítica: Se realizado corretamente, o volume de fracção recolhida, aqui deve ser ml 4-5. </li><li> Passe a mistura de reação diluída através de cartucho de SPE (II) para prender purificada [18 F] SFB utilizando nitrogênio (10 psi). Seque o cartucho com uma corrente de azoto por 2-3 minutos. </li><li> [18 F] SFB foi eluída com éter dietílico em RV3 usando (3 mL) do reservatório E.. </li><li> Evaporar o solvente em RV3 à secura por um fluxo suave de gás nitrogênio (10 psi), utilizando um banho de água (40 ° C). A seca final [18 F] SFB pode ser reconstituído em tampão PBS para a aplicação a jusante. </li></ol> 8. Resultados representativos: Nós desenvolvemos uma versão simplificada, rápida, um pot-método para a síntese de [18 F] SFB utilizando uma estratégia de desproteção em condições anidro e aquecimento por microondas durante cada transformação radioquímica / química. A Figura 1 apresenta os detalhes de nossa radiosynthesis. A identidade do produto final foi confirmado pela comparação de HPLC tempo de retenção com uma referência SFB não-radioativo. A purificada [18 F] SFB também foi analisada por meio de rádio-TLC e-HPLC para determinar a sua pureza radioquímica e química. O RCY de [18 F] SFB foi de 35 ± 5% em 60 min após HPLC purificação (n&gt; 30), com alta pureza radioquímica (&gt; 99%) e pureza química boa (veja o traço UV no perfil HPLC, a Figura 3 ). A atividade específica foi ca. 67-330 GBq / mmol (1,8-9,0 Ci / mmol), dependendo da radioatividade de partida. <img src="/files/ftp_upload/2755/2755fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Microondas assistida radiosynthesis um pot-de [18 F] SFB. Primeiro, o radiofluorination de etil 4 - (N, N, N-trimetilamônio) benzoato triflate (1) foi realizada sob aquecimento por microondas (50 W, 1 min) na presença de [K ⊃ 2.2.2] [18 F] F - complexos em dimetilsulfóxido (DMSO) para pagar etílico 4 - [18 F] fluorobenzoate ([18 F] 2). Sem purificação, uma solução de DMSO de potássio terc-butóxido (t BuOK) foi adicionado ea reação foi navio de microondas irradiada (40 W, 1 min) para concluir a desproteção anidro. A conversão final do [18 F] 3 em [18 F] SFB foi realizada com O-(N-succinimidyl) - N, N, N &#39;, N&#39; tetramethyluronium-tetrafluorborato ativação (TSTU). TSTU em acetonitrila foi adicionado à mistura de reação contendo o 4 - [18 F] fluorobenzoate ([18 F] 3) de sal; esta última etapa sintética rendeu bruto [18 F] SFB após o aquecimento (30 W, 2 min). <img src="/files/ftp_upload/2755/2755fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. O esquema de instalação para forno de microondas, um pot-[18 F] síntese SFB. <img src="/files/ftp_upload/2755/2755fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Radio-HPL cromatogramas da final [18 F] SFB. Top: sinal de UV a 254 nm; inferior: sinal radioativo; inset: UV sinal em 254 nm (33,3 x). <img src="/files/ftp_upload/2755/2755table1.jpg" alt="Tabela 1" /> . Tabela 1 Resumo da [18 F] radiosyntheses SFB relatados na literatura usando alquila 4 - (trimetilamônio) triflate benzoato como precursores.

Este método tem sido submetido a EUA pedido de patente.

Este simplificado de três etapas, um pot-radiosynthesis dos 18 reagente F-acilação [18 F] SFB é desenvolvido com base em não-aquosos química. Este processo tem excelente reprodutibilidade e pode ser usado de forma confiável para a produção de [18 F] SFB em módulos radioquímica automatizada, devido a duas modificações-chave descritas como seguintes: 1. Nós empregamos um passo desproteção / saponificação no sistema KOtBu / DMSO anidro para substituir a solução aquosa de...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> ácido acético em solução aquosa (5%, v / v) </td><td> Pescador </td><td> A38-500 </td><td> Preparado em nosso laboratório </td></tr><tr><td> Acetonitrila </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 75-05-8 </td><td></td></tr><tr><td> Éter etílico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 14775 </td><td></td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido (DMSO) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 472301 </td><td></td></tr><tr><td> Etílico 4 - (N, N, N-trimetilamônio) benzoato triflate </td><td> Preparadas em laboratório </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4,7,13,16,21,24-Hexaoxa-1 ,10-diazabiciclo [8.8.8] hexacosane (K222) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 29,111-0 </td><td></td></tr><tr><td> O - (N-succinimidyl) - N, N, N &#39;, N&#39; tetramethyluronium-tetrafluorborato (TSTU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 105832-38-0 </td><td></td></tr><tr><td> Carbonato de potássio em solução aquosa (1M) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 209619 </td><td> Preparado em nosso laboratório </td></tr><tr><td> Tert-butóxido de potássio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 156671 </td><td></td></tr></tbody></table>

microwave-assisted one-pot synthesis of n-succinimidyl-4-[18f]fluorobenzoate ([18f]sfb)

Biomoléculas, incluindo peptídeos, proteínas 09/01, 10,11 e anticorpos e seus fragmentos de engenharia, 12-14 estão ganhando importância tanto como terapêutica em potencial e agentes de imagem molecular. Nomeadamente, quando marcadas com radioisótopos emissores de pósitrons, (por exemplo, Cu-64, Ga-68 ou F-18), eles podem ser usados ​​como sondas para a imagem latente alvo de muitos processos fisiológicos e patológicos. 15-18 Portanto, esforço significativo tem dedicada à síntese e exploração de 18 F-rotulados biomoléculas. Embora haja exemplos elegante dos 18 F-rotulagem direta de peptídeos, 19-22 condições de reação dura (ou seja, orgânica pH, solvente extrema, alta temperatura) associado com radiofluorination diretos são geralmente incompatíveis com amostras de proteínas frágil. Até o momento, portanto, a incorporação do fármaco grupos prostéticos em biomoléculas continua sendo o método de escolha 23,24. N-Succinimidyl-4-[18 F] fluorobenzoate ([18 F] SFB), 25-37 um reagente tipo Bolton-Hunter que reage com os grupos amino primários de biomoléculas, é um muito versátil grupo prostético para os 18 F-rotulagem de um amplo espectro de entidades biológicas, em termos de sua evidente estabilidade in vivo e rendimento de radiomarcação alta. Após a marcação com [18 F] SFB, o que resulta [18 F] biomoléculas fluorobenzoylated poderiam ser exploradas como marcadores PET potencial para estudos in vivo de imagens. Most 1 [18 F] radiosyntheses SFB descrito nas literaturas atuais requerem dois ou até três reatores e purificações múltiplas usando extração em fase sólida (SPE) ou cromatografia líquida (HPLC). Tais processos longos dificultam a sua produção de rotina e aplicações difundidas na marcação radioactiva de biomoléculas. Apesar de vários módulo assistida [18 F] sínteses SFB foram relatados, 29-32, 41-42 são baseados principalmente em procedimentos complicados e demorados utilizando caro caixas disponíveis comercialmente radioquímica (Tabela 1). Portanto, uma maior simplificação do radiosynthesis de [18 F] SFB utilizando uma configuração de baixo custo seria muito benéfico para a sua adaptação a um processo automatizado. Relata-se uma preparação concisa de [18 F] SFB, com base em uma versão simplificada um pot-síntese assistida por microondas, (Figura 1). A nossa abordagem não exige purificação entre as etapas ou qualquer reagentes aquosos. Além disso, a irradiação de microondas, que tem sido usado na síntese de vários marcadores PET, 38-41 pode dá RCYs maior e melhor seletividade do que as reações correspondentes térmica ou eles fornecem rendimentos semelhantes em tempos de reação mais curtos. 38 Mais importante, quando rotulagem biomoléculas , o tempo economizado poderia ser desviado para bioconjugation subseqüente ou passo de imagem PET 28,43 novidade de nosso melhor [18 F] síntese SFB é duplo: (1). estratégia desproteção anidro não requer purificação dos intermediários (s) entre cada etapa e (2) o forno de microondas, transformações radioquímica permitir a produção rápida e confiável de [18 F] SFB.

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Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate [18F]SFB

A fácil, um pot-síntese da N-succinimidyl-4-[<sup&gt; 18</sup&gt; F] fluorobenzoate ([<sup&gt; 18</sup&gt; F] SFB) foi desenvolvido com base em um processo não aquoso radioquímica, em três etapas. Utilizando aquecimento por microondas, todo o procedimento pode ser concluído em menos de 30 min, ou 60 min, com posterior purificação por HPLC preparativa. A decadência corrigida rendimentos radioquímica (RCYs) foram 35-5% (n&gt; 30).

Síntese assistida por microondas, um pote de N-Succinimidyl-4-[ 18 F] fluorobenzoate ([ 18 F] SFB)

Biomolecules, including peptides,1-9 proteins,10,11 and antibodies and their engineered fragments,12-14 are gaining importance as both potential ...

microwave-assisted-one-pot-synthesis-n-succinimidyl-4

Research

JoVE Journal

Biology

Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate ([18F]SFB)

12.9K visualizações.  University of California at Los Angeles. A fácil, um pot-síntese da N-succinimidyl-4-[ 18 F] fluorobenzoate ([ 18 F] SFB) foi desenvolvido com base em um processo não aquoso radioquímica, em três etapas. Utilizando aquecimento por microondas, todo o procedimento pode ser concluído em menos de 30 min, ou 60 min, com posterior purificação por HPLC preparativa. A decadência corrigida rendimentos radioquímica (RCYs) foram 35-5% (n> 30).

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Optimization of the Ugi Reaction Using Parallel Synthesis and Automated Liquid Handling

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described. Triplicate runs of 48 parallel experiments are reported, varying concentration, solvent and the excess of some of the reagents. The isolation of the product was achieved by a simple filtration and wash procedure. The highest yield obtained was 66% from 0.4 M methanol with 1.2 eq. of imine. This is significantly above the 49% yield obtained from the initial reaction under equimolar concentration at 0.4 M in methanol. Methanol solutions with reagent concentrations of 0.4M or 0.2M gave superior yields while all solvent systems at 0.07M performed poorly. At 0.2M, methanol and ethanol/methanol (60/40) mixtures were statistically equally good while THF/methanol (60/40) was poor and acetonitrile/methanol (60/40) was intermediate. Good reproducibility of the precipitate yields was obtained in these replicate experiments, allowing for subtle interaction effects to be positively identified.

The Ugi reaction has proved to be a convenient way to quickly create diverse libraries of compounds. It involves the reaction of an amine, an aldehyde, a carboxylic acid and an isonitrile typically in methanol at room temperature. In this video, we utilize a 48-slot Mettler-Toledo MiniBlock equipped with filtration tubes and a Mettler-Toledo MiniMapper automated liquid handler was used to deliver the reagents and solvent. The parameters of interest were the concentration, the solvent composition and the excess of some of the reagents.

Otimização da Reação UGI Usando Síntese Paralela e manipulação de líquidos Automated

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described.  Triplicate runs ...

Biologia

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Síntese e calibração de nanossondas Phosphorescent for Imaging Oxigênio em Sistemas Biológicos

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Cellular apoptosis is a prominent feature of many diseases, and this programmed cell death typically occurs before clinical manifestations of disease are evident. A means to detect apoptosis in its earliest, reversible stages would afford a pre-clinical 'window' during which preventive or therapeutic measures could be taken to protect the heart from permanent damage. We present herein a simple and robust method to conjugate human Annexin V (ANX), which avidly binds to cells in the earliest, reversible stages of apoptosis, to superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles, which serve as an MRI-detectable contrast agent. The conjugation method begins with an oxidation of the SPIO nanoparticles, which oxidizes carboxyl groups on the polysaccharide shell of SPIO. Purified ANX protein is then added in the setting of a sodium borate solution to facilitate covalent interaction of ANX with SPIO in a reducing buffer. A final reduction step with sodium borohydride is performed to complete the reduction, and then the reaction is quenched. Unconjugated ANX is removed from the mix by microcentrifuge filtration. The size and purity of the ANX-SPIO product is verified by dynamic light scattering (DLS). This method does not require addition to, or modification of, the polysaccharide SPIO shell, as opposed to cross-linked iron oxide particle conjugation methods or biotin-labeled nanoparticles. As a result, this method represents a simple, robust approach that may be extended to conjugation of other proteins of interest.

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Early detection of apoptosis may identify at-risk cell populations in a variety of diseases. Here we demonstrate a method to link an early apoptosis-detection protein (Annexin V) to a MRI-detectable iron oxide nanoparticle (SPIO). This method may be extended to other proteins of interest to generate MRI-detectable molecular imaging probes.

Síntese de um<em&gt; Em vivo</em&gt; Sonda Apoptosis MRI-detectável

Cellular apoptosis is a prominent feature of many diseases, and this programmed cell death typically occurs before clinical manifestations of disease are ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This technique quickly proved advantageous over its solution-phase predecessor in both time and labor. Improvements concerning the nature of solid support, the protecting groups employed and the coupling methods employed over the last five decades have only increased the usefulness of Merrifield's original system. Today, use of a Boc-based protection and base/nucleophile cleavable resin strategy or Fmoc-based protection and acidic cleavable resin strategy, pioneered by R.C. Sheppard, are most commonly used for the synthesis of peptides1.
Inspired by Merrifield's solid supported strategy, we have developed a Boc/tert-butyl solid-phase synthesis strategy for the assembly of functionalized bis-peptides2, which is described herein. The use of solid-phase synthesis compared to solution-phase methodology is not only advantageous in both time and labor as described by Merrifield1, but also allows greater ease in the synthesis of bis-peptide libraries. The synthesis that we demonstrate here incorporates a final cleavage stage that uses a two-step "safety catch" mechanism to release the functionalized bis-peptide from the resin by diketopiperazine formation.
Bis-peptides are rigid, spiro-ladder oligomers of bis-amino acids that are able to position functionality in a predictable and designable way, controlled by the type and stereochemistry of the monomeric units and the connectivity between each monomer. Each bis-amino acid is a stereochemically pure, cyclic scaffold that contains two amino acids (a carboxylic acid with an &alpha;-amine)3,4. Our laboratory is currently investigating the potential of functional bis-peptides across a wide variety of fields including catalysis, protein-protein interactions and nanomaterials.

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using &quot;Safety Catch&quot; Methodology

The efficient solid-phase peptide synthesis of a functionalized bis-peptide trimer utilizing a "safety catch" cleavage procedure from HMBA resin is described.

Síntese em Fase Sólida de um funcionalizada Bis Peptide-Usando o &quot;Safety Catch&quot; Metodologia

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análise da Global RNA Síntese no nível da célula única seguinte hipóxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Medição dos Níveis de heme em células de mamíferos Síntese

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields of regenerative medicine, basic cell biology, treatment of diseases, and reprogramming of cells. Here, we describe a step by step protocol for generation of modified mRNA with reduced immune activation potential and increased stability, quality control of produced mRNA, transfection of cells with mRNA and verification of the induced protein expression by flow cytometry. Up to 3 days after a single transfection with eGFP mRNA, the transfected HEK293 cells produce eGFP. In this video article, the synthesis of eGFP mRNA is described as an example. However, the procedure can be applied for production of other desired mRNA. Using the synthetic modified mRNA, cells can be induced to transiently express the desired proteins, which they normally would not express.

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In this video article, we describe the in vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in cells.

In Vitro Síntese de ARNm de modificação para indução da expressão da proteína em células humanas

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are post-synthetically labeled by two new photostable cyanine dyes using copper-catalyzed click-chemistry. The synthesis of both donor and acceptor dye is described and is performed in three consecutive steps. With the DNA as the surrounding architecture, these two dyes undergo an energy transfer when they are brought into close proximity by hybridization. Therefore, annealing of two single stranded DNA strands is visualized by a change of fluorescence color. This color change is characterized by fluorescence spectroscopy but can also be directly observed by using a handheld ultraviolet (UV) lamp. The concept of a dual fluorescence color readout makes these oligonucleotide probes excellent tools for molecular imaging especially when the described photostable dyes are used. Thereby, photobleaching of the imaging probes is prevented, and biological processes can be observed in real time for a longer time period.

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Síntese de DNA sondas de hibridação de mudança de comprimento de onda usando fotoestável Cyanine Corantes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Preparação de amostras biológicas por congelamento de alta pressão, realce de contraste assistida por microondas e resina mínima incorporação para a imagem latente de Volume

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and degradation instigates a multitude of age-related diseases. Decline of proteostasis quality control mechanisms is a hallmark of ageing. Biochemical methods to detect de novo protein synthesis are still limited, have several disadvantages and cannot be performed in live cells or animals. Caenorhabditis elegans, being transparent and easily genetically modified, is an excellent model to monitor protein synthesis rates by using imaging techniques. Here, we introduce and describe a method to measure de novo protein synthesis in vivo utilizing fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). Transgenic animals expressing fluorescent proteins in specific cells or tissues are irradiated by a powerful light source resulting in fluorescence photobleaching. In turn, assessment of fluorescence recovery signifies new protein synthesis in cells and/or tissues of interest. Hence, the combination of transgenic nematodes, genetic and/or pharmacological interventions together with live imaging of protein synthesis rates can shed light on mechanisms mediating age-dependent proteostasis collapse.

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Here, we introduce and describe a nonradioactive and noninvasive method to assess de novo protein synthesis in vivo, utilizing the nematode Caenorhabditis elegans and fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). This method can be combined with genetic and/or pharmacological screens to identify novel modulators of protein synthesis.

Avaliação das taxas de síntese de proteínas de novo em Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...