Os autores não têm reconhecimento.

O atendimento e o tratamento dos animais neste procedimento foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal da Universidade do Colorado. 1. Preparando Soluções <ol><li> Prepare e armazene todas as soluções a temperaturas apropriadas, conforme mostrado na Tabela 1 . </li></ol> 2. Coating Wells e Slides NOTA: Os neurônios não aderem bem às superfícies de plástico ou de vidro. <ol><li> Um dia antes do isolamento dos neurônios, revestir os poços de uma placa de cultura estéril de 24 poços com 0,5 mL de poli-D-lisina (PDL, Tabela 2 ) e deixá-lo em uma camada de fluxo laminar O / N. NOTA: O método preferido é usar placas de 24 poços e revestir apenas os poços centrais, uma vez que a evaporação dos poços periféricos tende a ser mais acelerada e a resultados inconsistentes. Além disso, lâminas de vidro podem ser colocadas dentro dos poços antes de tO revestimento. Os neurônios serão anexados às lâminas de vidro revestidas e podem ser removidos posteriormente para outras imagens microscópicas . </li><li> No dia do isolamento, retire o PDL dos poços. Lave com água esterilizada por alguns minutos antes de remover a água restante e deixe secar durante 1 h (veja abaixo). </li><li> Após a secagem, cubra as lâminas com laminina ( Tabela 2 ). NOTA: Aproximadamente 10 μL de laminina (10 μg / μL) é suficiente para revestir cada poço de uma placa estéril de 24 poços. Isto é misturado com 340 μL de meio (volume total: 350 μL) para cobrir todo o poço. Deixe isso sentar-se durante 2 h à RT em um capuz de cultura e depois aspirar antes de revestir as células. </li></ol> 3. Colheita de Cordas Espinhais NOTA: Todos os instrumentos devem ser autoclavados (135 ° C e 30 psi para ciclos de 4 x 7 min) para esterilidade. <ol><li> Eutanizar cachorros de rato C57BL / 6 de um dia de um dia em uma câmara com isoflurano. Esperar30 s após a cessação do movimento e pitada a perna para confirmar a falta de resposta. </li><li> Separe a cabeça do corpo usando uma tesoura, com cachorro na posição propensa. </li><li> Estabilize as patas traseiras ou a cauda e os braços na mesa de procedimento, com o lado dorsal voltado para o usuário. </li><li> Corte a pele com uma tesoura de íris curvada. </li><li> Corte a medula espinhal da região lombar logo acima dos quadris e continue a cortar os dois lados do tórax para separá-lo do corpo. NOTA: Isso requer a dissecação cuidadosa da medula espinhal dos órgãos viscerais para evitar danos inadvertidos a outros órgãos ( Figura 1a ). </li><li> Lave sequencialmente por 10 s em placas de Petri de 3 x 10 cm contendo 5 mL de solução salina tamponada com fosfato esterilizado (PBS) esterilizado com filtro de 0,2 μm para remover o excesso de tecido. </li><li> Insira uma agulha de 22 G e uma seringa preenchida com 5 mL de PBS esterilizado em filtro na extremidade caudal da coluna vertebral e flush cranialmente, permitindo que o cordão tO saída para uma quarta placa de Petri ( Figura 1b ). </li><li> Recolher a medula espinhal em um tubo de 15 mL com 5 mL de HABG ( Tabela 1 ) em gelo. Tenha cuidado para evitar esmagar a medula espinhal. </li><li> Repita as etapas 3.1-3.8 para cada cachorro na liteira. NOTA: Idealmente, este processo deve levar menos de 30 min por medula espinhal para garantir o isolamento saudável do neurônio. </li></ol> 4. Isolando neurônios NOTA: O seguinte passo deve ser realizado em uma capa de fluxo laminar. É esperada familiaridade com a técnica estéril básica. <ol><li> Mincing de tecidos <ol><li> Pegue o tubo contendo as cordas espinhais e agite levemente para suspender o tecido. </li><li> Despeje o tecido do tubo em uma placa de Petri de vidro de 60 mm e dê com uma lâmina de barbear para criar peças finas de 0,5 mm de tamanho. </li><li> Transfira o tecido com uma pipeta de diâmetro largo para um tubo de 15 mL contendo 5 mL de HABG. </li><li> Coloque-o em um30 ° C de banho de água durante 30 min para permitir que as células se equilibrem a esta temperatura. Mantenha as células em um agitador apenas o suficiente para permitir que elas sejam suspensas no fluido. NOTA: Este passo é feito para evitar chocar as células após a transferência do gelo para o meio de digestão. Manter as células a 30 ° C ajuda a diminuir a morte celular associada a um aumento do metabolismo a 37 ° C. </li></ol></li><li> Prepare o meio de digestão ( Tabela 1 ). </li><li> Prepare o gradiente de densidade (Tabela 1). <ol><li> Prepare cada uma das 4 camadas em 4 tubos separados de 15 mL, conforme descrito na Tabela 1 . </li><li> Adicione 1 mL de cada camada a um novo tubo de 15 mL. Comece com a camada 1 na parte inferior e adicione-se sequencialmente até atingir a camada 4 no topo. Evite perturbar as camadas enquanto se adiciona. </li></ol></li><li> Lave as placas revestidas PDL do passo 2.2. Lave com água estéril por alguns minutos antes de remover qualquer água restante ePermitindo secar durante 1 h. </li><li> Transfira o tecido para o meio de digestão. <ol><li> Remova o tubo contendo tecido do banho de água do agitador a 30 ° C e deixe-o sedimentar por alguns minutos. </li><li> Remova o tubo médio de digestão do banho-maria a 37 ° C e aspirá-lo para dentro de uma seringa. </li><li> Aspirar o excesso de HABG do tubo contendo tecido. </li><li> Use um filtro de seu filtro de 0,2 μm na seringa para adicionar o meio de digestão ao tubo contendo tecido. </li><li> Coloque o tubo em um banho de água a 30 ° C durante 30 min. Mantenha as células tremendo o suficiente para permitir que elas sejam suspensas no fluido. NOTA: É importante não manter as células no meio de digestão por muito tempo ou deixar a temperatura ficar muito alta, o que pode levar à digestão excessiva e resultar em suspensão do tecido em uma mistura gelatinosa. </li></ol></li><li> Durante este período, revestir a laminina como no passo 2.3. </li> &lt;Li&gt; Realize a trituração ( ou seja, separe as células do tecido). <ol><li> Remova o tubo do banho de água agitado de 30 ° C e deixe-o se assentar durante alguns minutos. </li><li> Aspirar o excesso de meio de digestão. </li><li> Suspenda o tecido em 2 mL de HABG. </li><li> Usando uma pipeta de diâmetro estreito, triture 10x por 45 s. NOTA: Este é provavelmente o passo mais crucial e pode diminuir significativamente o rendimento se não for feito corretamente. <ol><li> Aspirar o tecido na pipeta e imediatamente esvaziar o conteúdo. </li><li> Evite a introdução de ar, pois diminuirá significativamente o rendimento viável. NOTA: A pipeta ideal é uma pipeta de vidro de 9 &quot;. A ponta da pipeta deve ser polida a fogo para suavizar superfícies rugosas. Em seguida, deve ser siliconada por colocação em uma solução 1:20 de diclorodimetilsilano (DMDCS) em clorofórmio e esquerda de O / N. A pipeta deve então ser removida e deixada secar ao ar. Posteriormente, éDeve ser autoclavado para esterilização. Atenção: o DMDCS e o clorofórmio são altamente inflamáveis ​​e a siliconização deve ser realizada em uma exaustão. </li></ol></li><li> Aspirar os 2 ml superiores de sobrenadante e colocá-lo em um novo tubo de 15 mL rotulado como &quot;coleção&quot;. </li><li> Repita as etapas 4.7.3-4.7.5 duas vezes adicionais (o tubo de coleta celular deve ter 6 mL até o final). </li><li> Transmita lentamente o conteúdo do tubo de recolha para o tubo de gradiente preparado no passo 4.2, evitando a interrupção do gradiente. </li></ol></li><li> Neste ponto, remova o meio neurobasal previamente preparado ( Tabela 1 ) da geladeira e deixe-o aquecer em um banho de 37 ° C. </li><li> Purifique os neurônios. <ol><li> Centrifugue o tubo gradiente por 15 min a 800 xg e 22 ° C. </li><li> Colecione a (s) camada (s) desejada (s) com uma pipeta ( Figura 2 ) e coloque em um novo tubo de 15 mL. Para o neurociências de maior purezaN isolação ( ou seja, 90%), coletar camada 3. Para obter mais rendimento com menos pureza ( ie &gt; 70-80%), colete as camadas 2 e 3. </li><li> Diluir o gradiente de densidade adicionando 5 mL de HABG às camadas recém-coletadas. </li><li> Centrifugar a 200 xg durante 2 min a 22 ° C. </li><li> Descarte o sobrenadante, volte a suspender em 5 mL de HABG e pique o sedimento para suspender as células. </li><li> Centrifugar durante 2 min 200 xg a 22 ° C. </li><li> Descarte o sobrenadante, ressuspenda em 3 mL de meio neurobasal e pique o sedimento para ressuspender as células. </li></ol></li><li> Conte as células. <ol><li> Pegue 10 μL da solução, agora com células em meio neurobasal, e misture com 10 μL de azul de Trypan. </li><li> Coloque 10 μL desta mistura numa câmara de contagem de vidro. </li><li> Usando uma câmara de contagem de vidro padrão, conte o número de células em cada um dos quatro quadrantes de 4 x 4. Adicione todas as células contadas (n), multiPor 2 (fator de diluição), dividir por 4 (número de quadrantes contados), multiplicar por 3 (volume de meio neurobasal) e multiplicar por 10 4 para obter a concentração de células em células / mL. <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55856/55856eq0.jpg" /></li></ol></li><li> Semear as células em placas de cultura <ol><li> Diluir a suspensão celular para 300.000 células em 1 mL de meio neurobasal. NOTA: Com base na concentração de células obtidas nas etapas acima, adiciona-se meio neurobasal adicional para obter uma concentração final de 3 * 10 5 células / mL. A equação é C 1 V 1 = C 2 V 2 , onde C 1 é a concentração inicial de células obtidas a partir da colheita; V 1 é 3 mL; E C 2 é 3 * 10 5 células / mL, como discutido acima. A equação é resolvida para V 2 . Adicione o volume do meio neurobasal necessário para tornar o volume total de células em solução igual aV 2 . </li><li> Agite suavemente para distribuir as células em solução e adicione 1 mL a cada poço nas placas revestidas de 24 poços. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não possuem divulgações.

Esta técnica permite a cultura confiável dos neurônios da medula espinhal. Uma vez alcançada a proficiência na técnica, demora cerca de 3,5 h para completar. Nós conseguimos realizar o isolamento de neurônios de 2 camadas separadas (16 camundongos totais) em aproximadamente 4 h. O passo-chave na viabilidade é poder extrair com eficiência as cordas espinhais dos ratos. O rendimento permite revestir vários poços e a capacidade de testar os neurônios em várias condições. Nós conseguimos tratar os neurônio...

<html> Compreender a patologia da medula espinhal requer o uso de vários modelos, tanto no nível macroscópico quanto microscópico. Os modelos de animais grandes e pequenos 1 , 2 , 3 são utilizados para investigações in vivo de doenças da medula espinhal e lesões. Ao estudar estas questões in vivo tem seus méritos, a análise da medula espinhal é limitada ao homogeneizado da medula espinal inteira ou às seções de tecido 4 . Isso cria alguma ambigüidade ao tentar isolar respostas e alvos específicos na medula espinhal entre seus neurônios residentes e glia circundante. A crescente disponibilidade de camundongos manipulados geneticamente permite investigações mais detalhadas da biologia em níveis celulares e moleculares. Assim, um modelo de rato neonatal é usado aqui, permitindo o estudo das propriedades únicas e biologia dos neurônios da medula espinhal in vitro . O isolamento e manutenção de neurônios in vitro não é particularmente direto. Existe uma abundância relativa de técnicas de isolamento de neurônios do tecido cortical de roedores adultos que parecem resultar em um número substancial de neurônios isolados ( ou seja, milhões) 5 , 6 , 7. Em contraste, o rendimento de neurônios do tecido da medula espinhal é menor 8 , 9 , 10 , em parte devido à menor massa de tecido. Além disso, em camundongos, há uma escassez relativa de técnicas para o isolamento de neonatologia Os neurônios da medula espinhal e os métodos existentes são limitados por menores rendimentos de neurônios ( ou seja, centenas) 9 ou técnicas pesadas e pesadas que exigem o isolamento de camundongos embrionários 10 . Neste protocolo, nósUse uma técnica que permita o isolamento efetivo de custo e recursos de um número substancial de neurônios das cordas espinhais de camundongos neonatais. Como é comum em técnicas previamente publicadas, utilizamos papaina como protease enzimática, permitindo a liberação de neurônios do tecido da medula espinhal 5 , 6 . Além disso, usamos um gradiente de densidade para a separação de células refinadas, que anteriormente foi mostrado como efetivo 6 , 10 . Embora o meio em que as células estejam incubadas possa variar, em nossa experiência e como publicado anteriormente 11 , a suplementação com suplemento de meio de cultura B27 fresco provou ser crítica para a longevidade do neurônio. Os neurônios são geralmente viáveis ​​por até 10 dias, permitindo que o tratamento seja realizado.

<table><tbody><tr><td>Hibernate A Medium - 500 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A1247501</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501</td></tr><tr><td>Hibernate A Minus Calcium - 500 mL</td><td>Brainbits</td><td>HA-Ca</td><td>http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/</td></tr><tr><td>Glutamax 100X - 100 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>35050061</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079</td></tr><tr><td>B27 Supplement 50X - 10 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>17504044</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044</td></tr><tr><td>Papain, Lyophilized - 100 mg</td><td>Worthington</td><td>LS003119</td><td>http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html</td></tr><tr><td>Neurobasal A Medium - 500 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10888022</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15140122</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine (PDL) hydrobromide - 5 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Mouse Laminin - 1 mg</td><td>Thermo-Fisher</td><td>23017015</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015</td></tr><tr><td>Trypan Blue - 20 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium - 250 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556-250ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440272-100ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306-1L</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Glass Pippette - 9&quot;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13-678-20C</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Pipette bulb - 5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z186678-3EA</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en&amp;amp;region=US&amp;amp;cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1</td></tr><tr><td>BRAND&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;Petri dish, glass - 60 x 15 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR455717-10EA</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Sterile 24-Well Cell Culture Plate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8812-100EA</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Hausser Hemacytometer (glass counting chamber)</td><td>Fischer Scientific</td><td>02-671-6</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716</td></tr><tr><td>Glass Slides - 12 mm sterile cover glass - uncoated</td><td>Neuvitro</td><td>GG-12-1.5-Pre</td><td>http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm</td></tr><tr><td>NeuN Rabbit Monoclonal Antibody - 100 &amp;micro;L</td><td>Abcam</td><td>ab177487</td><td>After fixing in paraformaldehyde (PFA) and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:200 for 18 h in 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody - 50 &amp;micro;L</td><td>Abcam</td><td>ab11267</td><td>After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluted 1:500 for 18 h in 4 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

spinal cord neurons isolation and culture from neonatal mice

Apresentamos um protocolo para o isolamento e a cultura dos neurônios da medula espinhal. Os neurônios são obtidos a partir de camundongos C57BL / 6 neonatais e são isolados no dia 1 pós-natal. Uma maca de rato, geralmente 4-10 cachorros nascidos de um par reprodutor, é recolhida para uma experiência e as cordas espinhais são coletadas individualmente de cada mouse após a eutanásia com isoflurano. A coluna vertebral é dissecada e depois a medula espinal é liberada da coluna. As cordas espinhais são então picadas para aumentar a área superficial de parto para uma protease enzimática que permite que os neurônios e outras células sejam liberados do tecido. A trituração é então usada para liberar as células em solução. Esta solução é subsequentemente fraccionada em um gradiente de densidade para separar as várias células em solução, permitindo que os neurônios sejam isolados. Aproximadamente 1-2,5 x 10 6 neurônios podem ser isolados de um grupo de lixo. Os neurônios são então semeados em poços revestidos com adesãoRs que permitem um crescimento e maturação adequados. Os neurônios levam aproximadamente 7 dias para atingir a maturidade no meio de crescimento e cultura e podem ser usados ​​posteriormente para tratamento e análise.

Usando esta técnica, uma única ninhada (4-10 filhotes) permite o isolamento de 1-2,5 10 6 neurônios adequados para semeadura em placas de cultura. Tipicamente, 4-8 poços são semeados na concentração mencionada acima ( ou seja, 300.000 células / mL). A Figura 3 demonstra o aparecimento de neurônios nesta concentração após uma semana de cultura em microscopia de luz de ampliação baixa ( a ) e alta ( b<...

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Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Este estudo apresenta uma técnica para o isolamento de neurônios de ratos neonatais WT. Requer a dissecção cuidadosa da medula espinhal do rato neonatal, seguida da separação de neurônios do tecido da medula espinhal através da clivagem mecânica e enzimática.

Isolamento e cultura de neurônios da medula espinhal de ratos neonatais

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.1K visualizações.  University of Colorado Anschutz Medical Campus.  Este estudo apresenta uma técnica para o isolamento de neurônios de ratos neonatais WT. Requer a dissecção cuidadosa da medula espinhal do rato neonatal, seguida da separação de neurônios do tecido da medula espinhal através da clivagem mecânica e enzimática. 

Vídeo: Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. Neuroepithelial cells of the neural tube that express Nkx6.1 are the unique precursor cells for spinal motoneurons1. Though postmitotic motoneurons move towards their final position and organize themselves into columns along the spinal tract2,3. More than 90% of all these differentiated and positioned motoneurons express the transcription factors Islet 1/2. They innervate the muscles of the limbs as well as those of the body and the inner organs. Among others, motoneurons typically express the high affinity receptors for brain derived neurotrophic factor (BDNF) and Neurotrophin-3 (NT-3), the tropomyosin-related kinase B and C (TrkB, TrkC). They do not express the tropomyosin-related kinase A (TrkA)4. Beside the two high affinity receptors, motoneurons do express the low affinity neurotrophin receptor p75NTR. The p75NTR can bind all neurotrophins with similar but lower affinity to all neurotrophins than the high affinity receptors would bind the mature neurotrophins. Within the embryonic spinal cord, the p75NTR is exclusively expressed by the spinal motoneurons5. This has been used to develop motoneuron isolation techniques to purify the cells from the vast majority of surrounding cells6. Isolating motoneurons with the help of specific antibodies (panning) against the extracellular domains of p75NTR has turned out to be an expensive method as the amount of antibody used for a single experiment is high due to the size of the plate used for panning. A much more economical alternative is the use of lectin. Lectin has been shown to specifically bind to p75NTR as well7. The following method describes an alternative technique using wheat germ agglutinin for a preplating procedure instead of the p75NTR antibody. The lectin is an extremely inexpensive alternative to the p75NTR antibody and the purification grades using lectin are comparable to that of the p75NTR antibody. Motoneurons from the embryonic spinal cord can be isolated by this method, survive and grow out neurites.

An alternative way of isolating mouse embryonic motoneurons from the spinal cord is described. The method takes into account the fact that lectin can bind to the low affinity nerve growth factor receptor p75NTR. This lectin-based preplating allows a purification similar to that with a specific antibody against the p75NTR.

Lectina baseado em isolamento e cultura de motoneurônios embrionárias de rato

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Neurociência

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Microglia cultura do Sistema Nervoso Central Neonatal e Adulto

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Imunologia e Infecção

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Spinal Cord Eletrofisiologia

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Biologia

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

A Neonatal do rato Spinal Cord Injury Compression Modelo

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Medicina

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information regarding glial activities at the cellular and molecular levels has been obtained through in vitro cell culture systems. The in vitro systems utilized, mainly include primary glia derived from neonatal brain cortical tissue and immortalized cell lines. However, these systems may not reflect the characteristics of spinal cord glial cells in vivo. In order to further investigate the roles of spinal cord glial cells in the development of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain using a culture system that better reflects the in vivo condition, our laboratory has developed a method to establish primary spinal cord mixed glial cultures from adult mice. Briefly, spinal cords are collected from adult mice and processed through papain digestion followed by myelin removal with a density-gradient medium. Single cell suspensions are cultured in complete Dulbecco&#39;s modified Eagle media (cDMEM) supplemented with 2-mercaptoethanol (2-ME) at 35.9 oC. These culture conditions were optimized specifically for the growth of mixed glial cells. Under these conditions, cells are ready to be used for experimentation between 12 - 14 d&#160;(cells are usually in log phase during this time) after the establishment of the culture (D 0) and can be kept in culture conditions up to D 21. This culture system can be used to investigate the responses of spinal cord glial cells upon stimulation with various substances and agents. Besides neuropathic pain, this system can be used to study glial responses in other diseases that involve pathological changes of spinal cord glial cells.

The development of neuropathic pain involves pathological changes of spinal cord glial cells. A reliable glial culture system derived from adult spinal cord tissue and designed for studying these cells in vitro is lacking. Therefore, we show here how&#160;to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue.

Preparação de culturas mista glial primários de rato adulto Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

Cultura primária de neurônios isolados do cerebelo embrionário do rato

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) when compared to spinal motor neurons (SMNs). The ability to isolate and culture primary mouse CN3s, CN4s, and SMNs would provide an approach to study mechanisms underlying this selective vulnerability. To date, most protocols use heterogeneous cell cultures, which can confound the interpretation of experimental outcomes. To minimize the problems associated with mixed-cell populations, pure cultures are indispensable. Here, the first protocol describes in detail how to efficiently purify and cultivate CN3s/CN4s alongside SMNs counterparts from the same embryos using embryonic day 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgenic mouse embryos. The protocol provides details on the tissue dissection and dissociation, FACS-based cell isolation, and in vitro cultivation of cells from CN3/CN4 and SMN nuclei. This protocol adds a novel in vitro CN3/CN4 culture system to existing protocols and simultaneously provides a pure species- and age-matched SMN culture for comparison. Analyses focusing on the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of motor neurons are feasible in this culture system. This protocol will enable research into the mechanisms that define motor neuron development, selective vulnerability, and disease.

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

This work presents a protocol to yield homogeneous cell cultures of primary oculomotor, trochlear, and spinal motor neurons. These cultures can be used for comparative analyses of the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of ocular and spinal motor neurons.

Isolamento e Cultura dos neurônios oculomotores, trochlear e motores espinhais de pré-natal Islmn:GFP Ratos Transgênicos

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal growth, development, and survival. We describe a detailed method for the use of microfluidic chambers (MFCs) for tracking axonal transport of fluorescently labeled organelles in MN axons. This method is rapid, relatively inexpensive, and allows for the monitoring of intracellular cues in space and time. We describe a step by step protocol for: 1) Fabrication of polydimethylsiloxane (PDMS) MFCs; 2) Plating of ventral spinal cord explants and MN dissociated culture in MFCs; 3) Labeling of mitochondria and acidic compartments followed by live confocal imagining; 4) Manual and semiautomated axonal transport analysis. Lastly, we demonstrate a difference in the transport of mitochondria and acidic compartments of HB9::GFP ventral spinal cord explant axons as a proof of the system validity. Altogether, this protocol provides an efficient tool for studying the axonal transport of various axonal components, as well as a simplified manual for MFC usage to help discover spatial experimental possibilities.

Axonal transport is a crucial mechanism for motor neuron health. In this protocol we provide a detailed method for tracking the axonal transport of acidic compartments and mitochondria in motor neuron axons using microfluidic chambers.

Transporte Axonal de Organelas em Culturas de Neurônios Motores usando sistema de câmaras microfluidas

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Extração eficiente de astrócitos e micróglias da medula espinhal de camundongos adultos

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic cells exhibit rapid responses to environmental changes and display significant heterogeneity in terms of morphology, transcriptional profiles, and functions. While our understanding of the functions of glial cells in health and disease has advanced substantially, there remains a need for in vitro, cell-specific analyses conducted in the context of insults or injuries to comprehensively characterize distinct cell populations. Isolating cells from the adult mouse offers several advantages over cell lines or neonatal animals, as it allows for the analysis of cells under pathological conditions and at specific time points. Furthermore, focusing on spinal cord-specific isolation, excluding brain involvement, enables research into spinal cord pathologies, including experimental autoimmune encephalomyelitis, spinal cord injury, and amyotrophic lateral sclerosis. This protocol presents an efficient method for isolating astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating immediate or future analysis with potential applications in functional, molecular, or proteomic downstream studies.

Autor em destaque: Isolamento de células gliais da medula espinhal de camundongos adultos 

This protocol outlines the isolation of purified astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating subsequent applications such as RNA analysis and cell culture. It includes detailed cell dissociation methods and procedures designed to enhance both the quality and yield of isolated cells.

Isolamento de Astrócitos Puros e Microglia da Medula Espinhal de Camundongos Adultos para Ensaios In Vitro e Estudos Transcriptômicos

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic ...

Isolamento e cultura de neurônios da medula espinhal de ratos neonatais

Resumo

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Transporte Axonal de Organelas em Culturas de Neurônios Motores usando sistema de câmaras microfluidas

Isolamento de Astrócitos Puros e Microglia da Medula Espinhal de Camundongos Adultos para Ensaios In Vitro e Estudos Transcriptômicos

Isolamento de Astrócitos Puros e Microglia da Medula Espinhal de Camundongos Adultos para Ensaios In Vitro e Estudos Transcriptômicos