A cultura celular neuronal primária é um sistema modelo ideal para estudar neurônios dissociados na cultura in vitro. A vantagem de usar este método é ser capaz de manter as características celulares de células dissociadas, como mecanismos, funções e morfologia em condições in vitro por algumas semanas o mais próximo possível da condição in vivo. Coloque os deslizamentos de cobertura redonda em uma placa de 24 poços sob o armário de biossegurança.
Adicione 90 microliters de poli-L-ornithine em cada deslizamento de cobertura. Feche a tampa e coloque suavemente a placa na incubadora de 37 graus por dois dias. Prepare o meio de cultura e o meio de semeadura e mantenha-os a quatro graus Celsius.
Prepare a solução de trippsina de trabalho no DMEM/F12 e mantenha-a em quatro graus. Coloque o meio de cultura e semeadura na incubadora a 37 graus. Tire a placa de 24 poços da incubadora.
Lave os deslizamentos da tampa três vezes com água destilada dupla. Deixe os deslizamentos de cobertura por pelo menos duas horas para secar completamente. Prepare três pratos de Petri recheados com PBS frio, três pratos de Petri cheios de HBSS frios, e cinco pratos de Petri cheios de meio de dissecção fria no gelo.
Extirpa os chifres uterinos e lave-os em PBS frio três vezes no gelo. A partir daqui, todos os passos devem ser realizados no gelo para minimizar os danos nos tecidos. Após a última etapa de lavagem, separe os filhotes do útero no HBSS e transfira-os para o meio de dissecção a frio.
Em meio de dissecação, decapite os filhotes com uma tesoura. Abra o calvarium do forame magnum até a borda inferior da cavidade orbital. Usando um par de fórceps finos, remova a base do crânio e descasque o crânio do cérebro.
Remova cuidadosamente as meninges do cerebelo a partir da superfície lateral do peduncle cerebelar médio e dos pons. Corte os dois peduncles cerebelares e separe o cerebelo do resto do cérebro. Coloque imediatamente a cerebella coletada em um tubo cônico estéril de 15 mL cheio de DMEM/F12 no gelo.
Centrifugar o tubo a 1.000 g a quatro graus durante um minuto no DMEM/F12. Repita isso três vezes, cada vez que remover suavemente o supernaente com uma pipeta e suspender a pelota em DMEM/F12 fresco. Adicione dois mililitros de trippsina pré-aquecida e pipeta suavemente para misturá-los.
Coloque o tubo em um banho de água de 37 graus por 12 minutos. Após a incubação, leve o tubo para o gabinete de segurança e adicione 10 mLs de DMEM/F12 para inativar a trippsina. Centrifugar a mistura a 1.200 g's por cinco minutos.
Descarte o supernatante e resuspend em meio fresco seguido de centrifugação três vezes. Pré-molhar uma pipeta de plástico estéril com DMEM/F2. Adicione 3,5 mililitros de solução de trabalho DNAse ao mesmo tubo.
Triturar o tecido com uma pipeta várias vezes até que o fluido atinja uma cor leitosa homogênea. Adicione 10 mL de DMEM/F12 frios à mistura e prossiga para a centrífuga. Centrifugar a amostra a 1.200 g a quatro graus por cinco minutos.
Remova cuidadosamente o supernatante sem perturbar a pelota. Remova o meio de semeadura da incubadora. Adicione 500 microliters de meio de semeadura pré-enlatado e misture-o bem usando a pipeta.
Conte as células usando um hemócito. Diluir a suspensão celular com meio de semeadura a uma densidade de 500.000 células por mililitro. Adicione 90 microliters da mistura a cada poço no centro da tampa.
Coloque a placa na incubadora a 37 graus durante três a quatro horas. Após a incubação, adicione 500 microliters de meio de cultura pré-guerra em cada poço. Substitua a placa na incubadora a 37 graus.
Após sete dias, substitua o antigo meio por meio de cultura fresca II.Prepare uma placa separada de 24 poços com organização numérica correspondente e adicione 100 microliters de PFA 4% a cada poço. Após os dias desejados na cultura, remova suavemente os deslizamentos de cobertura dos poços da placa de cultura original e coloque-os nos poços correspondentes da placa PFA descritos na etapa anterior. Adicione PFA aos poços para imergir completamente os deslizamentos de cobertura.
Mantenha a placa PFA em quatro graus por 30 a 120 minutos. Após a incubação, restaure a placa à temperatura ambiente. Lave os deslizamentos da tampa suavemente com PBS por cinco minutos três vezes.
A figura dois no texto mostra a cultura celular cerebelar a partir do E18. A imunofluorescência para calbinino mostra neurônios Purkinje com extensões axonais por três dias in vitro. Por sete a dez dias in vitro, processos dendráticos são evidentes.
Em 21 dias, complexos ramos dendráticos estão presentes. A figura três do texto mostra culturas de células cerebelares começando em vários dias embrionários. a detecção de imunofluorescência de calbinino mostra neurônios Purkinje com axônios precoces somente após 18 dias in vitro.
As culturas de neurônios purkinje iniciadas no E14 e no E15 desenvolverão dendritos, mas nunca tão complexas quanto aquelas que se desenvolvem quando o E18 é o ponto de partida. A figura quatro do texto mostra que diferentes tipos de células se desenvolvem a partir de culturas E18 após 21 dias in vitro. Imunofluorescência verde calbinina mostra neurônios Purkinje.
Imunofluorescência vermelha para parvalbumina em B e C mostram interneurônios inibitórios. A imunofluorescência vermelha para canal fechado de tensão de sódio em E e F mostra neurônios de grânulo. O presente protocolo é econômico e de fácil conduta.
No final deste vídeo, você será capaz de coletar e cultivar neurônios cerebelares e corrigi-los em DIVs desejados.
