O objetivo geral deste procedimento de injeção subretinal é entregar um vetor para a retina de forma minimamente invasiva e reprodutível que seja observável em tempo real. Olá, este método pode ser usado para responder a perguntas-chave em pesquisas de terapia genética sobre eficácia de parto vetorial e toxicidade de agentes terapêuticos. Algumas vantagens desta técnica incluem danos mínimos à retina e outras estruturas oculares, mapeamento preciso do local de injeção e rigorosas medições quantitativas in vivo que permitem inferência estatística sólida.
Para injeção transgênica intraocular, primeiro coloque um rato anestesiado no estágio de visualização de um microscópio do sistema de imagem da retina e coloque as pontas de uma íris estéril e cega fórceps nas posições sete e dez horas da pálpebra enquanto empurra as fórceps abertas e para baixo para induzir suavemente proptose. Use os fórceps para persuadir as pálpebras sob o globo ocular e direcione a ponta da agulha para cerca de um a 1,5 milímetros abaixo da borda do limbus córnea. Em seguida, aplique uma gota de solução pbs estéril no olho e cubra o olho com um deslizamento de tampa estéril.
Conduza cuidadosamente a agulha no olho através da conjuntiva até que uma depressão escleral seja criada. Use o micro manipulador para girar o olho para cima até que a depressão escleral esteja em foco, em seguida, leve a agulha para a frente para criar um pico acentuado na retina com a ponta da agulha. Utilizando o suporte da agulha, gire a agulha apenas até que a ponta da agulha fure a esclera e o RPE, permitindo que a farinha na ponta da agulha seja visível sob o tecido da retina nas proximidades do espaço subretinal e da monocamada de células de epitélio de pigmento da retina.
Dirija a ponta da agulha para baixo para que ela seja tangencial ao globo, em seguida, ative a bomba de injeção com o interruptor do pedal do pé. Após 0,5 para um microliters de solução transgênica ter sido entregue ao espaço subretinal, retire a agulha e confirme que o sangue está estável e que o fluido não vaze do local do trato de injeção. Para confirmar o sucesso da injeção, registo um oct de volume retangular e compare as imagens com imagens dos diferentes tipos de resultados potenciais de injeção.
Após a confirmação da colocação adequada da injeção, use essa imagem oct retangular para mapear a extensão do bleb na imagem fundus. Para mapear a extensão do bleb subretinal, abra uma imagem OCT de volume retangular do bleb de tal forma que um marco reconhecível dentro do olho seja incluído na imagem. Adicione quantas pinças forem necessárias para identificar a posição das bordas esquerda e direita do escaneamento B, bem como a cabeça do nervo óptico, ONH, se presente, e o ponto de inflexão onde a retina se desprende do RPE e do coroide e, em seguida, salvar os dados.
Em seguida, compile os arquivos salvos e plote os dados, criando efetivamente um mapa da injeção bleb na imagem de OCT en face. Sobreponha os dados plotados na imagem do fundus contendo o site de injeção e salve a imagem mesclada. Use esta imagem para localizar regiões de interesse durante o acompanhamento da imagem de OCT.
Para avaliar a degeneração da retina pós-injeção, primeiro abra uma imagem de volume retangular oct ou octegucional de domínio espectral de alta resolução registrada e selecione uma varredura B a ser medida. Amplie a imagem selecionada até que ela preencha a tela e clique com o botão direito do mouse na imagem. Clique em pinças para selecionar o número apropriado de pinças e use o recurso de pinça configuração para atribuir as pinças como vertical na coluna do bloco de ângulo e ligar o local da pinça de exibição para facilitar a colocação uniforme de pinça em toda a retina.
Clique em aplicar e mover cada pinça para o local apropriado de 0,1 a 0,2 milímetros de distância através da varredura B, tomando o cuidado de colocar uma pinça no centro da cabeça do nervo óptico quando apropriado. Quando todas as pinças tiverem sido colocadas, clique e arraste cada pinça até o comprimento da região de interesse, configurando arbitrariamente pinças não sobrepondo regiões mensuráveis da varredura B ao comprimento máximo. Para medir a espessura da camada nuclear externa, coloque a parte superior de cada pinça na membrana limitante externa e a parte inferior de cada pinça na parte inferior da camada plexiforme externa a incrementos de 0,1 a 0,2 milímetros através da retina.
Depois de todas as pinças terem sido colocadas e ajustadas ao tamanho, clique com o botão direito do mouse na imagem e clique em salvar dados de pinça" em seguida, repita as medidas como apenas demonstrado para cada décima varredura B, mantendo as pinças abertas e no mesmo local no eixo x e ajuste os comprimentos das pinças conforme necessário, sem movê-las na direção x. Quando todas as varreduras tiverem sido medidas, abra os arquivos de dados salvos e clique na data modificada" para organizar os arquivos de acordo com o tempo economizado. Abra todos os arquivos para cada varredura B medida e compile os dados brutos de cada varredura B em um único arquivo de número de quadro mais baixo para o mais alto e selecione as colunas de dados, incluindo o nome da pinça, comprimento e colunas do centro X.
Certifique-se de que o centro X seja o mesmo para todas as varreduras B medidas para cada imagem OCT de volume retangular processada e exclua quaisquer dados das pinças que não foram usadas para registrar medições. Defina a pinça localizada no centro da cabeça do nervo óptico a zero e plote os dados para x versus vários conjuntos de dados Y para obter uma função de plot 3D para a espessura da camada nuclear externa ou qualquer outra camada de retina medida. Em seguida, compare as medidas de camada nuclear externa entre o controle e animais experimentais com idades correspondentes para determinar a taxa e a uniformidade de qualquer potencial degeneração da retina.
Para o mapeamento 3D das medidas da retina, revise as imagens oct pós-injeção e observe quaisquer marcos identificáveis, em seguida, posicione o animal para obter uma imagem de tomografia computadorizada de acompanhamento da mesma região, tendo o cuidado de incluir os mesmos marcos identificáveis e processar as imagens gravadas como apenas demonstrado. É muito importante obter imagens de ALTA Qualidade de OCT que incluem marcos identificáveis para facilitar a reimaginação das regiões de retina injetadas anteriormente. Para medir as alterações no comprimento do SO, as pinças foram colocadas da membrana limitante externa à membrana Brooks, permitindo medições confiáveis, uma vez que essas camadas são facilmente identificadas em imagens DE OUTUBRO.
As diferenças nas medidas entre essas camadas de diferentes linhas de mouse foram atribuídas a comprimentos mais curtos do segmento externo. Se a injeção subretinal for realizada com sucesso, a abertura do espaço subretinal induz a produção de um bleb que pode ser claramente visualizado tanto na visão facial do imager OCT HRSD quanto nas imagens de varredura B. Sobrepor o mapa de borda do local da injeção permite a segmentação das medidas do tecido retiniano e conjuntos de dados de posição de pinça para permitir testes estatísticos subsequentes dos efeitos de agentes terapêuticos específicos na degeneração da retina.
Uma vez dominada, essa técnica pode ser completada em dez minutos se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento é importante lembrar de manter o ambiente cirúrgico limpo e estéril. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de terapia genética monitorarem todo o processo de injeção cirúrgica subretinal em tempo real e criaram uma maneira de determinar imediatamente o sucesso cirúrgico in vivo.
Após este procedimento de injeção, o OCT e outros métodos como a eletro-retinografia podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre resgate funcional transgene e/ou toxicidade. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um entendimento de como executar injeções subretinas transesclenais e transchoroidais, como mapear a extensão da injeção bleb para o OCT a partir desta imagem, e obter medidas rigorosas das camadas de retina externas. Não se esqueça que trabalhar com vetores de terapia genética pode ser perigoso e que precauções, como usar os equipamentos de proteção individual adequados, devem ser sempre usadas durante a realização deste procedimento.
