Este estudo é apoiado pela Fundação de Pesquisa em Glaucoma Shaffer Grant, 4-CA Cavalier Collaborative Award, R01EY029121, R01EY035088 e Knights Templar Eye Foundation.

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Virgínia e estão em conformidade com a diretriz sobre Uso de Animais do National Institute of Health (NIH). Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo.
1. Imagem in vivo vis-OCT
<ol><li>O sistema vis-OCT<ol><li>Imagine os olhos dos ratos usando um pequeno sistema de animais vis-OCT que usa uma fonte de luz supercontínua, que fornece iluminação de luz visível entre 480 nm e 650 nm. Certifique-se de que a potência incidente na córnea é de 1 mW e use uma taxa de linha A de 25 kHz e um tempo de integração de 39,3 μs por linha A.</li>
		<li>Certifique-se de que a faixa de detecção espectral do espectrômetro esteja entre 508 nm e 613 nm, o que fornece uma resolução axial de 1,3 μm na retina. O volume total de imagem é de aproximadamente 700 μm (x) x 700 μm (y) x 1.500 μm (z). A resolução lateral está entre 4,5 μm no centro do campo de visão e 8,7 μm a 350 μm do centro11,13.</li>
	</ol></li>
	<li>Anestesia em camundongos<ol><li>Anestesiar camundongos de fundo C57BL/6 e ambos os sexos com uma injeção intraperitoneal de coquetel de Cetamina (114 mg/kg) e Xilazina (17 mg/kg) e dilatar suas pupilas usando gotas de tropicamida a 1%. Confirmar anestesia adequada por perda do reflexo pedal após um pinçamento firme dos dedos.</li>
		<li>Durante a geração de imagens, mantenha o mouse aquecido usando uma lâmpada de calor infravermelha. Após cada aquisição das imagens, aplicar lágrimas artificiais para evitar a desidratação da córnea.</li>
	</ol></li>
	<li>Posicionamento do mouse para obtenção de imagens<ol><li>Coloque o rato anestesiado no suporte do animal e mantenha o rato na posição com a ajuda de duas Velcro correias. NOTA: O suporte do animal permite o movimento em três dimensões (ajuste vertical, ajuste horizontal fino, bem como ajustes de passo e guiada) para colocar o laser no olho do mouse.</li>
	</ol></li>
	<li>Ajuste dos parâmetros de imagem<ol><li>Ligue o computador e abra o software referenciado, que ligará o laser automaticamente.</li>
		<li>Ajuste o suporte do animal até que o laser esteja estável e centralizado no olho do rato. Visualize a parte posterior do olho através de uma visualização En Face na interface do software, o campo de visão (FOV) do plexo vascular superficial e um B-scan, a secção transversal da retina dentro do FOV.</li>
		<li>Adquira um volume vis-OCT clicando no botão Adquirir na interface do software depois de realizar pequenos ajustes do foco óptico, que consiste em 512 A-lines/B-scan e 512 B-scans/volume. Observação : esse processo leva ~ 10,5 s. A aquisição de imagens é guiada por um estimador de índice de qualidade (QI) embutido para garantir que imagens abaixo de um limiar pré-determinado (QI < 45) não sejam incluídas.<ol><li>Para cada rato, adquira quatro volumes vis-OCT do mesmo olho. Alinhe a cabeça do nervo óptico (ONH) em cada um dos quatro cantos do FOV para cobrir diferentes áreas da retina. NOTA: Esta colocação minimiza a curvatura da retina, o que maximiza a reflectância da CFNR ao longo do FOV. Requer ~1 min para reposicionar o olho entre cada aquisição (Figura 1A,B).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Análise Vis-OCTF NOTA: MATLAB é usado para executar análise de imagem.<ol><li>Para gerar fibrogramas vis-OCT a partir do volume vis-OCT, use um método de limiar baseado em intensidade (linha de código MATLAB 808) para detectar a superfície da retina. Observação : essas linhas usam a função imadjust para ajustar os valores de intensidade do bscan. O argumento [0,0087 0,08] passado para imadjust especifica o intervalo de intensidades a ser mapeado para o intervalo dinâmico completo da imagem de saída.</li>
		<li>Corte o RNFL selecionando o primeiro ~16 μm em profundidade. Consulte a linha de código Matlab 782. NOTA: A espessura RNFL in vivo típica em um camundongo C57BL/6 selvagem adulto é de ~14 μm e pode variar entre diferentes métodos de segmentação13.</li>
		<li>Altere os caminhos do arquivo RAW (linha 9), Arquivos para reconstrução (linha 11) e nome do arquivo (linha 15), clique em Executar e aguarde até que a imagem da OCT seja analisada pelo código MATLAB. Calcular a projeção de intensidade média ao longo da direção axial (z) (linhas de código MATLAB 905-908) para gerar a imagem de fibrograma composta por feixes axonais RGC e vasculatura circundante. Monte as quatro imagens após o processamento do fibrograma para cada FOV alinhando os vasos sanguíneos com um editor gráfico de escolha, cobrindo ~1,2 x 1,2 mm no total. Os arquivos RAW geralmente são salvos na pasta: Halo Data, sob a data da imagem da OCT (por exemplo, 0606 Opticent). Observação : os códigos MATLAB estão disponíveis no arquivo suplementar 1.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Imagem confocal ex vivo
<ol><li>Eutanásia em camundongos<ol><li>Após a aquisição dos dados vis-OCT, eutanasiar os camundongos com uma mistura de pentobarbital sódico (390 mg/mL) e fenitoína sódica (50mg/mL). A fenitoína sódica tem função amplificando os efeitos do pentobarbital sódico, que tem sido amplamente aplicado na eutanásia de roedores14,15. Para cada camundongo, utilizar 0,2 mL/20 g da mistura diluída (156 mg/mL) e perfundir com 20 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e, em seguida, 20 mL de paraformaldeído (PFA) a 4% em PBS16,17.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissecção e orientação ocular<ol><li>Enuclear os olhos e fazer uma marca no lado temporal para indicar a orientação.</li>
		<li>Após a remoção cuidadosa da câmara anterior, a lente ocular, vítreo, e fixar os óculos em PFA por 30 min.</li>
		<li>Lave os óculos com PBS por 30 min e substitua a solução PBS 3x durante a lavagem. Em seguida, lavar com Triton X-100 a 0,5% em PBS (pH 7,5) por 30 min.</li>
		<li>Incubar as oculares em tampão de bloqueio (soro de burro a 5% com albumina de soro bovino a 2,5% e Triton X-100 a 0,5% em solução salina tamponada com Tris [pH 7,5]) por 2 h à temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Imunomarcação NOTA: Os óculos estão agora prontos para serem corados com os anticorpos primários de camundongo anti-Tuj1 para detectar feixes de axônio RGC e rato anti-ICAM-2 para detectar vasos sanguíneos.<ol><li>Incubar os copos oculares durante a noite com os anticorpos primários, anti-Tuj1 de rato (1:200 em tampão de bloqueio) e anti-ICAM-2 de rato (1:500 em tampão de bloqueio), a 4 °C.</li>
		<li>Lave os óculos 3-5x por 1 h cada vez, com uma solução salina tamponada com fosfato contendo Triton X-100 a 0,5% (PBST) para minimizar o fundo e remover qualquer anticorpo não ligado.</li>
		<li>Após a lavagem, incubar os copos oculares durante a noite com os anticorpos secundários, burro anti-camundongo Imunoglobulina G conjugada ao corante Alexa Fluor 488 (fluorescência verde) e IgG anti-rato de burro conjugado ao corante Alexa Fluor 594 (fluorescência vermelha), todos diluídos 1:1000 em tampão de bloqueio, a 4 °C.</li>
		<li>No dia seguinte, lave os óculos 3-5x por 1 h cada com PBST para minimizar o fundo e remover o anticorpo não ligado.</li>
		<li>Transfira as oculares para uma placa de Petri de PBS antes da montagem plana.</li>
	</ol></li>
	<li>Retina plana<ol><li>Após o processo de imunomarcação, isole as retinas das oculares ao microscópio.</li>
		<li>Corte as retinas em quatro folhas e monte-as planas com a camada RGC virada para cima. Deixe a marca no lado temporal preso à retina para indicar a orientação.</li>
		<li>Cobrir as retinas com meiode montagem 13,18. Selar as lâminas com esmalte13,18,19.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagem confocal OBS: O processamento das imagens confocais foi realizado utilizando o software ZEN Microscopy.<ol><li>Ligue o microscópio confocal e, no modo Localizar, encontre a área de interesse usando a ocular do microscópio.</li>
		<li>No modo de aquisição, configure blocos para cobrir toda a retina e fatias z-stack para cobrir todas as camadas de informações. Imagem de pelo menos 25 blocos em toda a retina para cobrir o volume total de 5,99 mm (x) x 5,88 mm (y) x 30 μm (z) a um tamanho de pixel de 1,24 μm/pixel.</li>
		<li>Projetar os cortes Z-stack para criar imagens de microscopia confocal bidimensional en face (Figura 1C,D)11,13,19,20,21.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Alinhamento de imagens in vivo e ex vivo
<ol><li>Depois de processar o fibrograma, crie uma imagem composta que inclua as quatro imagens adquiridas de cada mouse, alinhando todos os vasos sanguíneos com um editor gráfico de escolha. NOTA: Em média, a imagem composta final é de aproximadamente 1,2 mm (x) x 1,2 mm (y), conforme mostrado na Figura 1B.</li>
	<li>Use a cabeça do nervo óptico (ONH) e o padrão dos vasos sanguíneos como pontos de referência para alinhar o fibrograma composto. Obter o alinhamento in vivo e ex vivo sobrepondo o padrão dos vasos sanguíneos das imagens compostas de OCT com as imagens confocais da mesma retina coradas com ICAM-2.</li>
</ol>

Alinhamento de Fibra de OCT de Retina de Camundongo com Imagens Confocais

<ol>
	<li>Sernagor, E., Eglen, S. J., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+retinal+ganglion+cell+structure+and+function.">Development of retinal ganglion cell structure and function.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 139-174 (2001).</li><li>Sanes, J. R., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+types+of+retinal+ganglion+cells:+current+status+and+implications+for+neuronal+classification.">The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification.</a> Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).</li><li>Seabrook, T. A., Burbridge, T. J., Crair, M. C., Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture,+function,+and+assembly+of+the+mouse+visual+system.">Architecture, function, and assembly of the mouse visual system.</a> Annual Review of Neuroscience. 40, 499-538 (2017).</li><li>Cang, J., Savier, E., Barchini, J., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+function,+organization,+and+development+of+the+mouse+superior+colliculus.">Visual function, organization, and development of the mouse superior colliculus.</a> Annual Review of Vision Science. 4, 239-262 (2018).</li><li>Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+glaucomatous+optic+neuropathy:+the+synergy+between+clinical+observation+and+investigation.">Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation.</a> Annual Review of Vision Science. 2, 235-254 (2016).</li><li>Whitmore, A. V., Libby, R. T., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glaucoma:+thinking+in+new+ways-a+role+for+autonomous+axonal+self-destruction+and+other+compartmentalised+processes.">Glaucoma: thinking in new ways-a role for autonomous axonal self-destruction and other compartmentalised processes.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 24 (6), 639-662 (2005).</li><li>Syc-Mazurek, S. B., Libby, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+injury+signaling+and+compartmentalized+injury+response+in+glaucoma.">Axon injury signaling and compartmentalized injury response in glaucoma.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100769 (2019).</li><li>Puyang, Z., Chen, H., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-dependent+morphological+and+functional+degeneration+of+retinal+ganglion+cells+in+mouse+models+of+experimental+glaucoma.">Subtype-dependent morphological and functional degeneration of retinal ganglion cells in mouse models of experimental glaucoma.</a> Journal of Nature and Science. 1 (5), (2015).</li><li>Tatham, A. J., Medeiros, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+structural+progression+in+glaucoma+with+optical+coherence+tomography.">Detecting structural progression in glaucoma with optical coherence tomography.</a> Ophthalmology. 124, S57-S65 (2017).</li><li>Shu, X., Beckmann, L., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible-light+optical+coherence+tomography:+a+review.">Visible-light optical coherence tomography: a review.</a> Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-14 (2017).</li><li>Miller, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible-light+optical+coherence+tomography+fibergraphy+for+quantitative+imaging+of+retinal+ganglion+cell+axon+bundles.">Visible-light optical coherence tomography fibergraphy for quantitative imaging of retinal ganglion cell axon bundles.</a> Translational Vision Science and Technology. 9 (11), (2020).</li><li>Beckmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+the+inner+retinal+layer+structure+in+mice+after+eye-opening+using+visible-light+optical+coherence+tomography.">In vivo imaging of the inner retinal layer structure in mice after eye-opening using visible-light optical coherence tomography.</a> Experimental Eye Research. 211, 108756 (2021).</li><li>Grannonico, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+regional+damages+in+retinal+ganglion+cell+axon+bundles+monitored+non-invasively+by+visible-light+optical+coherence+tomography+fibergraphy.">Global and regional damages in retinal ganglion cell axon bundles monitored non-invasively by visible-light optical coherence tomography fibergraphy.</a> Journal of Neuroscience. 41 (49), 10179-10193 (2021).</li><li>Allen-Worthington, K. H., Brice, A. K., Marx, J. O., Hankenson, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+Injection+of+Ethanol+for+the+Euthanasia+of+Laboratory+Mice+(Mus+musculus)+and+Rats+(Rattus+norvegicus).">Intraperitoneal Injection of Ethanol for the Euthanasia of Laboratory Mice (Mus musculus) and Rats (Rattus norvegicus).</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (6), 769-778 (2015).</li><li>Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiologic,+Behavioral,+and+Histologic+Responses+to+Various+Euthanasia+Methods+in+C57BL/6NTac+Male+Mice.">Physiologic, Behavioral, and Histologic Responses to Various Euthanasia Methods in C57BL/6NTac Male Mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (1), 69-78 (2017).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+degeneration+of+retinal+and+superior+collicular+functions+in+mice+with+sustained+ocular+hypertension.">Progressive degeneration of retinal and superior collicular functions in mice with sustained ocular hypertension.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (3), 1971-1984 (2015).</li><li>Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+laser-induced+mouse+model+of+chronic+ocular+hypertension+to+characterize+visual+defects.">A laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension to characterize visual defects.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 78 (78), (2013).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+experimental+glaucoma+on+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells+in+mice.">Differential effects of experimental glaucoma on intrinsically photosensitive retinal ganglion cells in mice.</a> Journal of Comparative Neurology. 530 (9), 1494-1506 (2022).</li><li>Thomson, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiopoietin-1+knockout+mice+as+a+genetic+model+of+open-angle+glaucoma.">Angiopoietin-1 knockout mice as a genetic model of open-angle glaucoma.</a> Translational Vision Science and Technology. 9 (4), (2020).</li><li>Feng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+ocular+hypertension+induces+dendritic+degeneration+of+mouse+retinal+ganglion+cells+that+depends+on+cell+type+and+location.">Sustained ocular hypertension induces dendritic degeneration of mouse retinal ganglion cells that depends on cell type and location.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (2), 1106-1117 (2013).</li><li>Grannonico, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+analysis+of+retinal+ganglion+cell+damage+at+individual+axon+bundle+level+in+mice+using+visible-light+optical+coherence+tomography+fibergraphy.">Longitudinal analysis of retinal ganglion cell damage at individual axon bundle level in mice using visible-light optical coherence tomography fibergraphy.</a> Translational Vision Science and Technology. 12 (5), (2023).</li></ol>

Chang, S., Nenhum; Xu, W., Nenhum; Torcedor, W., Nenhum; McDaniel, J.A., Nenhum; D.A. Miller, Nenhum; M. Grannonico, Nenhum; M. Liu, Nenhum; X. Liu, Nenhum; H.F. Zhang tem interesses financeiros na Opticent Health, que não apoiou este trabalho.

Há duas etapas nesse protocolo que requerem atenção. Primeiro, é necessário garantir que o animal esteja sob anestesia profunda e que seus olhos estejam totalmente dilatados antes da realização de exames de OCT. Se os camundongos não estiverem adequadamente anestesiados, sua respiração rápida pode levar a movimentos instáveis das imagens da face em face , o que pode afetar negativamente a qualidade do fibrograma. Além disso, a dilatação insuficiente também pode ter um impacto negativo na qualidad...

As células ganglionares da retina (CGRs) desempenham um papel crítico no processamento da informação visual, recebendo entradas sinápticas através de suas árvores dendríticas na camada plexiforme interna (LIP) e transmitindo a informação através de seus axônios na camada de fibras nervosas da retina (CFNR) para o cérebro 1,2,3,4. Em condições de doença como o glaucoma, a degeneração precoce do CGR pode resultar em alterações sutis na CFNR, na camada de células ganglionares (LCG), na LIP e no nervo óptico, tanto em pacientes quantoem modelos de roedores5,6,7,8,9. A detecção precoce dessas alterações morfológicas nos CGRs é, portanto, essencial para uma intervenção oportuna na prevenção do CGR e da perda da visão.
Recentemente, desenvolvemos uma nova tecnologia de imagem pronta para uso clínico chamada tomografia de coerência óptica com luz visível (vis-OCT) para satisfazer a necessidade de monitoramento in vivo dos danos do CGR. O Vis-OCT melhorou a resolução axial, atingindo 1,3 μm naretina10,11, permitindo a visualização de feixes axonais RGC individuais na CFNR. Posteriormente, a fibrografia vis-OCT (vis-OCTF) foi estabelecida para rastrear e quantificar o dano do CGR no nível do feixe axônio único emcamundongos 11,12,13. No entanto, imagens confocais ex vivo da mesma retina do padrão-ouro são frequentemente necessárias para validar os achados in vivo. Portanto, este estudo demonstrará como alinhar imagens in vivo adquiridas por vis-OCTF com imagens confocais ex vivo da mesma retina de camundongo. O protocolo visa validar os achados in vivo por imagens confocais ex vivo e estabelecer uma base para examinar as alterações moleculares e celulares subjacentes ao dano RGC em condições doentes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halo 100</td>
			<td>Opticent Health, Evanston, IL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM800 microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs and antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Santz Cruz Biotechnology, SC-281692</td>
			<td></td>
			<td>1-2 drops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin powder</td>
			<td>Fisher Scientific, BP9706-100</td>
			<td></td>
			<td>1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202</td>
			<td></td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209</td>
			<td></td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL))</td>
			<td>Covetrus, NDC 11695-4860-1</td>
			<td></td>
			<td>15.6 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Covetrus, NADA043304</td>
			<td></td>
			<td>114 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Tuj1</td>
			<td>A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia</td>
			<td></td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum(NDS)</td>
			<td>Millipore Sigma, S30-100 mL</td>
			<td></td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 
			(Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3</td>
			<td></td>
			<td>1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-ICAM-2</td>
			<td>BD Pharmingen, Cat#553325</td>
			<td></td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide drops&#160;</td>
			<td>Covetrus, NDC17478-102-12</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 
			(Reagent Grade)</td>
			<td>VWR, CAS: 9002-93-1</td>
			<td></td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories Inc. H2000-10</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Covetrus, NDC59399-110-20</td>
			<td></td>
			<td>17 mg/kg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

alignment of visible-light optical coherence tomography fibergrams with confocal images of the same mouse retina

Nos últimos anos, a imagem in vivo da retina, que fornece informações não invasivas, em tempo real e longitudinais sobre sistemas e processos biológicos, tem sido cada vez mais aplicada para obter uma avaliação objetiva do dano neural em doenças oculares. Imagens confocais ex vivo da mesma retina são frequentemente necessárias para validar os achados in vivo , especialmente em pesquisas com animais. Neste estudo, demonstramos um método para alinhar uma imagem confocal ex vivo da retina de camundongos com suas imagens in vivo . Uma nova tecnologia de imagem pronta para uso clínico chamada fibra de tomografia de coerência óptica de luz visível (vis-OCTF) foi aplicada para adquirir imagens in vivo da retina de camundongos. Em seguida, realizamos a imagem confocal da mesma retina como "padrão ouro" para validar as imagens in vivo vis-OCTF. Este estudo não só permite uma investigação mais aprofundada dos mecanismos moleculares e celulares, mas também estabelece uma base para uma avaliação sensível e objetiva do dano neural in vivo.

Retinal ganglion cells (RGCs) play a critical role in visual information processing, receiving synaptic inputs through their dendritic trees in the inner plexiform layer (IPL) and transmitting the information via their axons in the retinal nerve fiber layer (RNFL) to the brain1,2,3,4. In diseased conditions such as glaucoma, early RGC degeneration may result in subtle changes in the RNFL, the ganglion cell layer (GCL), the IPL, and the optic nerve in both patients and rodent models5,6,7,8,9. Early detection of these morphological changes in RGCs is thus essential for timely intervention to prevent RGC and vision loss.
We have recently developed a new clinical-ready imaging technology called visible-light optical coherence tomography (vis-OCT) to satisfy the need for in vivo monitoring of RGC damage. Vis-OCT improved the axial resolution, reaching 1.3 &#181;m in the retina10, 11, allowing for the visualization of individual RGC axon bundles in the RNFL. Subsequently, vis-OCT fibergraphy (vis-OCTF) was established to track and quantify RGC damage at the single axon bundle level in mice11,12,13. However, ex vivo confocal imaging of the same retina as the gold standard is often necessary to validate the in vivo findings. Therefore, this study will demonstrate how to align in vivo images acquired by vis-OCTF with ex vivo confocal images of the same mouse retina. The protocol aims to validate the in vivo findings by ex vivo confocal imaging and establish a foundation for examining the molecular and cellular changes underlying RGC damage in diseased conditions.

Autor em destaque: Avanços na imagem da retina in vivo e ex vivo para melhorar o diagnóstico e o tratamento do glaucoma 

Alinhamento de Fibrogramas de Tomografia de Coerência Óptica com Luz Visível com Imagens Confocais da Mesma Retina de Camundongo

We present a protocol for aligning in vivo VIS-OCT images with ex vivo immunostained retinal nerve fibers to validate our novel imaging technology. VIS-OCT enables visualization of retinal nerve fibers in vivo, and this process confirms the accuracy of our findings. Our protocol combines in vivo and ex vivo imaging to provide a real time visualization of retina structure and confirm findings.The process is applicable to mouse models of eye diseases, provided the anterior eye portion allows for optical imaging. This includes diabetic retinopathy and retinal ischemia models. These studies lay the foundation for establishing an objective evaluation of neuro damage in humans, which can significantly improve glaucoma diagnosis and treatment in the future.

O fibrograma composto vis-OCT é comparado com a imagem confocal correspondente de retina plana imunomarcada com Tuj-1 para axônios RGC (Figura 1D, painel superior). Os feixes de axônio fotografados por vis-OCTF podem ser combinados com os feixes de axônios marcados com Tu-j1 na imagem confocal. Os vasos sanguíneos geralmente exibem estruturas ramificadas distinguíveis em comparação com feixes axonais circundantes em imagens de fibrograma, que podem ser combinados com os vasos sanguí...

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O presente protocolo descreve os passos para o alinhamento in vivo de imagens de fibrografia por tomografia de coerência óptica de luz visível (vis-OCTF) com imagens confocais ex vivo da mesma retina de camundongos com o objetivo de verificar a morfologia do feixe axonal de células ganglionares da retina observada nas imagens in vivo.

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...

Apresentamos um protocolo para alinhar imagens in vivo de VIS-OCT com fibras nervosas retinianas imunocoradas ex vivo para validar nossa nova tecnologia de imagem. O VIS-OCT permite a visualização das fibras nervosas retinianas in vivo, e esse processo confirma a acurácia de nossos achados. Nosso protocolo combina imagens in vivo e ex vivo para fornecer uma visualização em tempo real da estrutura da retina e confirmar os achados.O processo é aplicável a modelos de doenças oculares em camundongos, desde que a porção anterior do olho permita imagens ópticas. Isso inclui retinopatia diabética e modelos de isquemia retiniana. Esses estudos estabelecem as bases para estabelecer uma avaliação objetiva dos danos neurológicos em humanos, o que pode melhorar significativamente o diagnóstico e o tratamento do glaucoma no futuro.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

883 visualizações.  University of Virginia. Apresentamos um protocolo para alinhar imagens in vivo de VIS-OCT com fibras nervosas retinianas imunocoradas ex vivo para validar nossa nova tecnologia de imagem. O VIS-OCT permite a visualização das fibras nervosas retinianas in vivo, e esse processo confirma a acurácia de nossos achados. Nosso protocolo combina imagens in vivo e ex vivo para fornecer uma visualização em tempo real da estrutura da retina e confirmar os achados.O processo é aplicável a modelos de doenças ocula...

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In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has been increasingly applied to obtain an objective assessment of neural damage in eye diseases. Ex vivo confocal imaging of the same retina is often necessary to validate the in vivo findings especially in animal research. In this study, we demonstrated a method for aligning an ex vivo confocal image of the mouse retina with its in vivo images. A new clinical-ready imaging technology called visible light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) was applied to acquire in vivo images of the mouse retina. We then performed the confocal imaging of the same retina as the &#34;gold standard&#34; to validate the in vivo vis-OCTF images. This study not only enables further investigation of the molecular and cellular mechanisms but also establishes a foundation for a sensitive and objective evaluation of neural damage in vivo.

The present protocol outlines the steps for aligning in vivo visible-light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) images with ex vivo confocal images of the same mouse retina for the purpose of verifying the observed retinal ganglion cell axon bundle morphology in the in vivo images.

Neurociência

In Vivo Visible Light Optical Coherence Tomography (OCT) Mouse Retinal Imaging

Start by positioning the anesthetized mouse on the animal holder and securing it with two Velcro straps. Turn on the computer and open the software to activate the laser. Adjust the animal holder to center the laser in the mouse's eye.Visualize the posterior part through an on-face preview, the field of view of the superficial vascular plexus, a B scan, and the retina cross-section within the field of view. Acquire a visible light optical coherence tomography, or vis-OCT volume after making minor adjustments to the optical focus. Align the optical nerve head in each of the four corners of the field of view to cover different retinal areas.Use an intensity-based threshold method to detect the retina surface, and generate vis-OCT fiber grams from the volume. Crop the retinal nerve fiber layer, or RNFL, by selecting the first 16 micrometers depth. Next, calculate the mean intensity projection along the axial direction to generate the fiber gram image composed of retinal ganglion cell axon bundles and surrounding vasculature.Align the blood vessels using a graphics editor to montage the four images post-processing. The composite vis-OCT fiber gram is compared with the corresponding confocal image of flat-mounted retina immunostained with TUJ1 for RGC axons. Blood vessels exhibit distinguishable branching structures which can be matched with the ICAM II labeled blood vessels on the confocal image.Side-by-side comparison between ex vivo confocal microscopy and in vivo vis-OCT revealed identical RGC exon bundle networks and surrounding retinal vasculature.

Tomografia de coerência óptica (OCT) de luz visível in vivo Imagem da retina de camundongos

Ex Vivo Confocal Imaging of Mouse Retina

Enucleate the eyes of a euthanized mouse, marking the temporal side for orientation purposes. Remove the anterior chamber. Then remove the lens and vitreous and place eye cups in paraformaldehyde for 30 minutes.Wash eye cups with PBS for 30 minutes. Replacing the solution three times. Then, wash with 0.5%Triton X-100 for 30 minutes.Incubate eye cups in the blocking buffer for two hours at room temperature. After immunostaining, isolate the retinas from the eye cups using a microscope. Divide the retinas into four leaves and flat mount them with the retinal ganglion cell layer facing up.Ensure the mark on the temporal side remains attached for orientation. Cover the retinas with mounting medium. Place cover slips.And seal the slides using nail polish. Turn on the confocal microscope and under Locate mode, find the area of interest using the eye piece. Switch to Acquisition mode and set up tiles to cover the entire retina, along with Z-Stack slices for all layers of information.Image at least 25 tiles across the whole retina to achieve a total volume. Project the Z-Stack slices to generate two-dimensional on-face confocal microscopy images. The composite vis-OCT fibergram is compared with the corresponding confocal image of flat mounted retina immunostained with TuJ1 for RGC axons.Blood vessels exhibit distinguishable branching structures which can be matched with the ICAM-2 labeled blood vessels on the confocal image. Side-by-side comparison between ex vivo confocal microscopy and in vivo vis-OCT revealed identical RGC axon bundle networks and surrounding retinal vasculature.

Imagem Confocal Ex Vivo da Retina de Camundongos

Alignment of In Vivo and Ex Vivo Mouse Retinal Images

Start by creating a composite image using the four obtained images from each mouse. Utilize a graphics editor to align all the blood vessels, employ the optic nerve head and blood vessel patterns as landmarks for aligning the composite fiber gram overlap the composite images and the confocal images of the same retina stained with ICAM2, to achieve in vivo and ex vivo alignment. The composite vis-oct fiber gram is compared with the corresponding confocal image of flat mounted retina.Immuno stain with TUJ1 for RGC axons. Blood vessels exhibit distinguishable branching structures which can be matched with the ICAM2 labeled blood vessels on the confocal image. Side-by-side comparison between ex vivo confocal microscopy and in vivo vis-oct revealed identical RGC Axon bundle networks and surrounding retinal vasculature.