Agradecemos Mei Ann Lim para a leitura crítica do manuscrito e outros membros do nosso laboratório para suas discussões ao longo do curso deste trabalho. Este trabalho foi financiado por Yamada Science Foundation e da Royal Society Bolsas visita curta e Marie Curie da UE Internacional GRR Fellowship entrada para KK, e Projeto BBSRC Grant (BB/H002278/1) e Wellcome Trust Equipamento Grant (073228/Z/03/Z) para AH

1. Encenado coleção de larvas <ol><li> Lugar 15 do sexo feminino e 15 moscas machos adultos em uma gaiola cilíndrica Perspex para pôr ovos em uma placa de Petri com agar de sumo de uva e suplementados com uma pequena concha de levedura colar durante 3 horas a 25 ° C. Mudar a placa 3-4 vezes por dia, e descartar o primeiro prato (isto é, a partir de O / N ovo-lay). Descartar também as placas a partir do primeiro dia. A partir do segundo dia, manter as placas com os ovos a 25 ° C. Após 7 dias de coleta de ovos, comece com uma nova configuração de moscas pai. </li><li> Após cerca de 24 horas, as larvas eclodem dos ovos. Ligando larvas com um pincel ou diluído com um par de pinças, transferir 35 larvas do agar de uva para um frasco contendo alimentos mosca padrão (10 ml) (Figura 1A). </li><li> Manter os frascos contendo larvas por 3 dias (96 horas após a postura do ovo, AEL) a 25 ° C. </li></ol> 2. Dissecação de larval cordões nervosos ventrais para a Cultura <ol><li> Limpe sernch e as mãos com álcool 70%. Mergulhe 4 blocos de coloração, 2 pares de fórceps e uma agulha com etanol 70%, e deixar secar naturalmente. </li><li> Prepare quatro blocos de coloração com as seguintes mídias: uma com água destilada (DW) para limpar e para as larvas piscina limpa, um segundo com 2 ml de Proteção e médio Sang M3 inseto com penicilina e estreptomicina 1%, ecdisona livre (M3 PS média) para dissecar as larvas, um terceiro com 2 ml de meio M3 PS para piscina dissecados cordas nervosas ventrais (VNCs), e um quarto com 2 ml de meio M3 PS stab VNCs. Todos os reagentes devem ser pré-aquecida até à TA. </li><li> Adicionar água ao frasco contendo 96 hr larvas AEL. Em seguida, usando uma espátula, delicadamente espalhar comida com larvas do frasco para uma toalha de papel húmido. Transferem-se 10 larvas de um bloco de coloração contendo DW para lavar a comida. Substituir DW 6 vezes. Em seguida, substitua com M3 médio PS. </li><li> Transfira uma das larvas para um bloco de coloração contendo 2 ml de meio M3 PS. </li><li> Sob um microscópio de dissecação, dissect um cérebro larval cuidadosamente usando métodos padrão 12, mas para minimizar danos nos tecidos, ter um cuidado especial, procedendo da seguinte maneira. Coloque o lado dorsal larva, e segure o dorso de um terço da extremidade anterior com duas pinças (uma em cada mão). Enquanto segurando a seção anterior, afastar a extremidade posterior com a pinça, e rasgar a epiderme. O cérebro e o VNC deve ser visível a partir da borda posterior da metade anterior. Cuidadosamente isolar o cérebro e complexo VNC, removendo a gordura do corpo, intestino e epiderme. Quando os VNCs são danificados demasiado, as VNCs irá degenerar total ou parcialmente, mesmo sem lesão penetrante. Leve em conta os seguintes pontos: </li></ol><ul><li> Não puxe ou rasgar os discos imaginais e os nervos periféricos do VNC torácica como isso irá danificar o VNC. Para cortar os nervos periféricos, manter os nervos periféricos com dois pares de fórceps colocados perto uns dos outros, e em seguida, puxe os nervos com o deceps. Discos imaginais e partes da boca pode ser deixado ligado ao VNC. </li><li> Deixar a glândula anel e gânglio linfático ligado ao cérebro. </li><li> Cortar o intestino, no ponto mais próximo para o cérebro, onde os alimentos não muito está contido. </li></ul><ol start="6"><li> Ao utilizar um Pipetman P20 com a ponta cortada e se arregalaram um pouco, transfira o VNC a um bloco coloração contendo fresco M3 médio PS. Antes de transferir o VNC, pipeta primeiro para cima e para baixo, somente o meio utilizado para a dissecação, a fim de impedir que o VNC se colem à ponta. </li></ol> 3. Stabbing Lesão ao larval Drosophila VNC Esta seção descreve como executar lesão apunhalar os VNCs, e preparar-VNCs esfaqueado por lapso de tempo de análise e imunocoloração. Condições pós-esfaqueamento cultura e duração são descritos na seção 5 (por lapso de tempo de análise) e na seção 6 (para imunomarcação). <ol><li> Depois de reunir VNCs suficientes (4-5 para o lapso de tempoe mais 24 para imunomarcação), a transferência de um VNC a um bloco de coloração limpo contendo M3 PS. </li><li> Orientar o VNC, de modo que o neurópilo dorsal está em vista sob o microscópio de dissecação (Figura 1B). Esta é a orientação mais natural para VNCs para deitar em quando ligado aos lobos óptica. </li><li> Stab manualmente, utilizando uma agulha de tungsténio sob o microscópio de dissecação, a partir do lado dorsal praticamente em ângulo recto e com vista para a metade do VNC abdominal (Figura 1B). </li></ol> Tome especial atenção ao seguinte: <ul><li> Stab apenas uma vez. </li><li> Stab até que a agulha atinge a parte inferior do vidro. No entanto, tenha cuidado para não danificar a ponta da agulha. </li><li> A haste do suporte da agulha não deve tocar o meio durante esfaqueamento. </li><li> A ferida não é visível ao microscópio de dissecção. </li></ul> Nota: degeneração Stab lesão não-relacionado O procedimentopode resultar em degeneração celular distinto dentro do VNC a partir da lesão penetrante. Resultados degeneração em furos no neurópilo e, ocasionalmente, os furos têm sido observados no córtex de espécimes não-stabbed. As amostras com degeneração afeta a degeneração neurópilo ou generalizado que afecta também a superfície VNC deve ser descartado. Degeneração podem ser identificados como se segue: <ul><li> Superfície áspera, especialmente na área lateral / ventral do tórax, em 22 horas de esfaqueamento. Em casos extremos, o VNC parece se projetava. </li><li> Buracos ou vacúolos no neurópilo torácico, que pode ser visível como orifícios de sinal de fundo com a imunocoloração de fluorescência. </li></ul> 4. Manutenção de Agulha e Fórceps <ul><li> Rotineiramente verificar se a ponta da agulha é afiado o suficiente. A ponta da agulha pode ser dobrada ou romba depois usá-la para várias experiências. Neste caso, o aguçar a ponta usando uma pedra do Arkansas ou equivalente. </li><li> As pontas das pinças deveatender perfeitamente. As pontas podem ficar danificados com o uso. Neste caso, ajustar a ponta usando uma pedra do Arkansas ou equivalente. </li></ul> 5. Cultura e lapso de tempo de gravação de VNCs Stabbed Para visualizar a neurópilo axonal no VNC vivo, uma linha de armadilha proteína GFP que rotula todos os axônios G9 - 13 - podem ser utilizadas, e para visualização de todas as células da glia (excepto a glia linha média) do condutor repoGAL4 glial pode ser usado para expressar o UASdsRed S197Y 14 repórter. Pelo cruzamento G9 voa para UASdsRedS197Y;; repoGAL4 moscas, larvas VNCs de progênie são obtidos com axônios verde e vermelho da glia que podem ser gravados em um tecido vivo. <ol><li> Após VNCs agrupamento 4-5, transferência de um VNC a um bloco de coloração limpo contendo 2 ml de M3 PS, e esfaquear o meia abdominal do VNC, como indicado na seção 3. </li><li> Transfira o VNC esfaqueado a um poli-L-lisina 3,5 milímetros revestido prato fundo de vidro Petri contendo 1 ml de M3PS. Coloque o lado dorsal VNCs baixo. Com cuidado, empurre o VNC usando o lado liso de um par de fórceps para permitir que o VNC para manter o prato. </li><li> Suavemente adicionando 1 ml de M3 PS FBS 15% tornar a concentração final de FBS a 7,5%. </li><li> Aquisição de imagens usando o laser microscopia confocal. Digitalizar o VNC, coletando uma série Z-seção toda a sua espessura inteiro. Utilizou-se um microscópio invertido Leica SP2 confocal com uma temperatura da câmara de cultivo. Qualquer microscópio confocal equivalente deve funcionar, no entanto, ele pode exigir a optimização das condições para a exploração. Os ajustes para a microscopia confocal de lapso de tempo foram os seguintes: A temperatura da câmara de ambiente: 25 ° C; 20X objectiva com zoom 4 vezes; modo de digitalização xyzt, com resolução de 512x512 pixels, z = 1 uM e os passos de 1 hora ou 2 - intervalos de uma hora. </li></ol><ul><li> A Leica microscópio confocal SP2 tem uma limitação no tamanho do arquivo para digitalização. Com essas configurações, 8-9 timepoints pode ser digitalizada. Comoutros microscopia confocal, que deveria ser possível adquirir pilhas de imagens para os pontos mais longos, ou seja, sobre a extensão de até 24 horas. </li></ul> 6. Cultura e imunocoloração de VNCs esfaqueado e Corrigido <ol><li> Prepara-se uma placa de 24 poços de cultura de tecido, contendo 500 ul de M3 PS 7,5% de FBS, por poço. </li><li> Repita dissecção de mais de 24 VNCs para uma placa de cultura de tecidos de 24 cavidades. </li><li> Ao utilizar o P20 Pipetman com a ponta de corte, transferir 12 VNCs não stabbed da piscina para o prato de cultura, utilizando-se um VNC por poço. </li><li> Stab resto do VNCs na piscina, como descrito na seção 3. Transfira cada VNC esfaqueado a um bem cada. </li><li> Coloque o prato de 24 cavidades na incubadora a 25 ° C durante um período desejado, dependendo da experiência. A integridade celular é inalterado durante pelo menos 24 horas. </li><li> Após o cultivo, transferir os 12 VNCs em 250 ul de PEM de formaldeído a 4% em um tubo de 1,5 ml, utilizando o P20 Pipetman com a ponta de corte. Em seguida, o fixative é cuidadosamente pipetado para fora, tomando cuidado para não danificar os VNCs. Uma pequena quantidade de fixador suficiente para cobrir as amostras devem permanecer em cada tubo. Seguidamente, adicionar fixador fresco, e agitar suavemente durante 50 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Enxaguar duas vezes com 0,3% de Triton X PBS, e em seguida, lavar duas vezes durante 10 min com 0,3% de Triton X PBS à temperatura ambiente. </li><li> VNCs bloco por incubação com soro de cabra normal a 10% em 0,3% de Triton X PBS durante 1 h à RT. As amostras podem ser armazenadas a 4 ° C durante pelo menos um mês. </li><li> Incubar VNCs com anticorpos primários durante mais de 20 horas a 4 ° C. </li><li> Enxaguar duas vezes com 0,3% de Triton X PBS, em seguida, lava-se 3 vezes durante 10 min com 0,3% de Triton X PBS à temperatura ambiente. </li><li> Incubar VNCs com anticorpos secundários durante mais de 16 horas a 4 ° C. </li><li> Enxaguar duas vezes com 0,3% de Triton X PBS, em seguida, lava-se 3 vezes durante 10 min com 0,3% de Triton X em PBS quarto RT (no escuro, se utilizando anticorpos fluorescentes secundárias). </li><li> Substituir PBS com glicerol a 50%: 50% PBS durante, pelo menos, umahora. </li><li> Em seguida, substitua com glicerol a 80%: 20% PBS durante pelo menos uma hora. </li><li> Montar um VNC em uma janela feita em duas camadas de fita-violoncelo (aproximadamente 0,06 mm) sobre uma lâmina de vidro de microscópio. Ajuste a orientação, e colocar uma lamela (18x18 mm) sobre a janela. Dois VNCs pode ser montado sobre uma lâmina utilizando este método. </li></ol> Utilizando uma variedade de anticorpos primários, diferentes respostas celulares à lesão pode ser analisada (por exemplo, alterações no número de células e a forma da célula). 7. Analisar dados usando ImageJ e uma gama de Plugins Se o VNC não tem stabbing degeneração relacionada, a amostra deve ser contado em para a análise, independentemente do tamanho da lesão. Como facada é feito manualmente, o tamanho da lesão é diferente a cada vez. Assim, é importante analisar estatisticamente o efeito de esfaqueamento, sempre que possível. <ol><li> Wound medição do tamanho. O tamanho da ferida é um indicador de reparação 15.A lesão esfaqueamento é visível como desprovido de expressão GFP. Área de lesão pode ser medido utilizando dados lapso livremente disponível software ImageJ, como se segue: <ol><li> Usando ImageJ, abra uma pilha de imagens confocal de menu &quot;Arquivo&quot;, selecione &quot;Importar&quot; e aqui selecionar &quot;seqüência de imagens&quot;. Isto irá transformar a coleção de imagens individuais em uma pilha. </li><li> Depois altere a &quot;pilha&quot; em um &quot;Hyperstack&quot;, indo para &quot;Imagem&quot;, selecione &quot;Hyperstack&quot;, selecione &quot;Pilha de Hyperstack&quot;. </li><li> Defina o tamanho do voxel usando &quot;Propriedades&quot; do menu &quot;Imagem&quot;. Nos dados adquiridos utilizando o microscópio Leica SP2 confocal, o tamanho do voxel pode ser obtido a partir da verificação de software, e a partir do ficheiro de texto de metadados guardada juntamente com as imagens. Com a nossa configuração como descrito na Seção 3, dimensões de pixels são XY = 0,366211 ^ m e z = 0,99709 jam. </li><li> Ao examinar todas as fatias em um ponto de tempo, desenhe o contorno máximo da área de lesão com a ferramenta de polígono de seleção na barra de ferramentas. Este é oRegião de interesse (ROI). </li><li> Adicione o ROI para o gerente de ROI, indo para &quot;Analisar&quot; menu, rolar para baixo e selecione &quot;Ferramentas&quot;, depois em &quot;gerenciador de ROI&quot;, depois em &quot;adicionar&quot;. </li><li> Repita este procedimento para os todos os pontos de tempo. </li><li> Clique no botão &quot;Medida&quot; botão no gerenciador de ROI para obter o tamanho da área de cada ROI. </li></ol></li><li> Correção do movimento VNC durante lapso de tempo gravações. &quot;Stackreg&quot; e &quot;Turboreg&quot; plugins 16 (a partir do site ImageJ <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ): estes plugins permitem corrigir movimentos pequena amostra durante lapso de tempo. Construir uma pilha com uma seção representativa equivalente óptico através de todos os pontos de tempo e aplicar os plugins. Ela ajuda a visualizar como as mudanças de lesão ao longo do tempo. Os detalhes sobre esses métodos e ao manual de instruções estão disponíveis a partir do grupo de pesquisa que desenvolveu esses plugins. ( <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/" target="_blank">http://bigwww.epfl.c</a>h / Thévenaz / stackreg /). </li><li> A contagem automática de células gliais. &quot;DeadEasy glia&quot; plug-in ( <a href="http://www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html" target="_blank">www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html</a> ): esta foi desenvolvida para contar o número de células positivas para REPO gliais no larval Drosophila VNC e examinar a mudança no glial número causadas por esfaqueamento lesão 17. O plug-in funciona com precisão, com um erro de 0,1% de falsos positivos e falsos negativos 4,3% 17. Para usar este plug-in rótulo, primeiro tudo o glia (exceto a linha média) na amostra usando imunofluorescência com anticorpos anti-REPO. Em seguida, instalar o plug-in no ImageJ, abra uma pilha de imagens confocal e executar plug-in. Conta células gliais automaticamente em cerca de 30 segundos. </li><li> A contagem automática de células apoptóticas. &quot;Larvas Caspase DeadEasy&quot; plug-in ( <a href="http://www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html" target="_blank">www.bioscienc</a>es-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html) 18: Este foi desenvolvido para contar o número de células marcadas com anticorpo anti--clivada Caspase3, e uma nova versão foi adaptada para os VNCs larvais. Stabbing lesão provoca um aumento da morte celular programada 11. Para usar este plug-in, as células apoptóticas primeira etiqueta na amostra usando imunofluorescência com anti-clivada-caspase-3 anticorpos. Em seguida, instalar o plug-in no ImageJ, abra uma pilha de imagens confocal e executar plug-in. Conta células apoptóticas automaticamente em cerca de 30 segundos. </li></ol> 8. Reagentes <ol><li> Meio de cultura: Shield e Sang meio de insecto M3, 7,5% de soro fetal bovino, 1% de penicilina e estreptomicina 1%. </li><li> 0,01% de poli-L-lisina em DW estéril. </li><li> Fixador: formaldeído a 4%, em PEM Ultra puro (0,1 M PIPES, EGTA 2 mM, 1 mM de MgSO4) a solução. </li><li> Solução de bloqueio para a imunocoloração: soro de cabra normal a 10% em 0,3% de Triton X PBS. </li><li> Anti-Glutamina Sintetase2 anticorpos: 1:250 em solução de bloqueio. </li><li> Anti-GFP anticorpos: 1:1000 em solução de bloqueio. </li><li> Anticorpos anti-REPO: 1:250 em solução de bloqueio. </li><li> Anti-anticorpos ELAV: 1:250 em solução de bloqueio. </li><li> Anti-caspase 3 clivada anticorpos: 1:1000 em solução de bloqueio. </li><li> Anticorpos secundários: 1:250 em solução de bloqueio. </li></ol>

<ol>
	<li>Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Drosophila+model+of+nerve+injury+reveals+an+essential+role+of+Nmnat+in+maintaining+axonal+integrity.">A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity.</a> Curr. Biol. 22, 590-595 (2012).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+turnover+of+the+Wallenda/DLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury.">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J. 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Não há conflito de interesse declarado.

Nós estabelecemos um protocolo para esfaquear lesão ao SNC Drosophila larval para investigar as respostas celulares para a reparação de lesão e regeneração. VNCs larvas são dissecados e esfaqueado, após o que eles são filmados com lapso de tempo fixado para microscopia ou imuno fluorescência para visualizar glia e neurônios, apoptose ou a divisão celular. A progressão da lesão ao longo do tempo podem ser medidos. Este método é acompanhado por um software desenvolvido propositadamente para a análise quantitativa e estatística das alterações do número de células e sobre ferimentos durante a reparação. Nós esfaqueou 96 horas larvas AEL (e estes foram fixados ou autorizados a desenvolver ainda mais), um estágio de desenvolvimento antes da transição para a pupa e depois mosquito adulto. Às 96 h, VNCs são suficientemente grandes para esfaqueamento, eles estão no meio da fase de terceiro instar e, portanto, não estão submetidos a pupação ainda, e o sistema nervoso é já totalmente funcional semelhante ao do anúncioUlt. Pode ser possível para apunhalar um pouco mais tarde em larvas eo sincronismo preciso deve ser escolhido de acordo com a questão de pesquisa. No entanto, dependendo das questões dirigidas, que será geralmente necessário para a cultura das VNCs durante algum tempo para observar as respostas celulares à lesão. Algum tempo depois de 120 horas começa pupação AEL, um período em que o SNC é remodelado e é, portanto, melhor evitar. Assim, a janela de tempo para cultura mais penetrante na larva é bastante restrita. Usando larvas ainda tem uma grande vantagem sobre o uso de técnicas adultos: enquanto que, à semelhança do adulto, o sistema nervoso é já completamente funcional, a análise da resposta à lesão é consideravelmente mais fácil e rápido de larvas. Quando se compara o tamanho e morfologia de cérebros e VNCs dissecados e cultivados em um prato de VNCs que são dissecadas em um ponto de tempo equivalente mais tarde sem cultura em um prato, parece que o desenvolvimento é mais lento do que em cultura in vivo. Em outros aspectos,desenvolvimento continua normalmente na cultura, a integridade do tecido é preservado e as células são vivas mostrando múltiplas respostas. Expansão ferida, reparo neurópilo e proliferação glial ocorrer dentro de 22 horas pós-esfaqueamento. Isto mostra que a resposta celular a lesão ter lugar em cultura e não há provavelmente não há necessidade de manter os explantes por mais de um dia. Se a cultura de longo prazo foram desejado, o protocolo pode exigir maior otimização, tais como a utilização de uma inserção de placa de cultura 5. É importante para identificar amostras de boa qualidade daqueles em degeneração. Otimizando este protocolo tem alguma habilidade e inevitavelmente degeneração ocorrerá em alguns espécimes. O VNC pode adquirir uma &quot;couve-flor&quot; aparência que reflete uma avaria da integridade do tecido (Figura 5B). Degeneração é também reconhecido pela vacuolização do VNC independentemente da facada, que podem estar presentes em intactas, não-stabbed espécimes (Figura 5C </strong&gt;). Essas amostras devem ser descartadas. Degeneração é provavelmente causado por dissecção áspero, que pode rasgar os nervos ea camada protetora de células gliais superfície. Assim, grande cuidado deve ser tomado para dissecar cuidadosamente. Outros factores que influenciam a incluir o meio de cultura, o qual deve ser mantido limpo e com antibióticos, aderindo estritamente às lavagens e horários, conforme indicado no protocolo. Finalmente, o comprimento do suporte de agulha e da agulha, o tamanho ea nitidez da agulha são muito importantes. O suporte de agulha podem contaminar o meio de cultura e uma agulha romba pode causar uma lesão grande que não pode reparar-se e dá origem à degeneração. É importante manter a rotina agulha afiada. Neste protocolo, que se aproveitou de uma linha de armadilha proteína de moscas para visualizar a neurópilo em paralelo com a visualização de processos gliais que usam o sistema GAL4-UAS tradicional. Essas ferramentas podem ser também combinados com outros sistemas binários de expressão, tais como o LexA 19 e Q-sistema 20, que são independentes da GAL4. Isto iria permitir a análise de interacções por exemplo entre axónios e os processos gliais, em resposta a uma lesão. Por mais combinando-a com outras ferramentas genéticas, como repórteres para dendritos 21 ou 22 influxo de cálcio, este método oferece uma grande oportunidade para analisar a biologia celular atrás da resposta à lesão de células gliais, os axônios e dendritos neuronais no SNC. Finalmente, este método pode ser combinado com a genética padrão, mutações e sobre-expressão de genes, para testar a função de um gene em resposta a lesão e da regeneração. Este protocolo, com sucesso, levou à descoberta de uma rede de genes subjacentes a resposta regenerativa glial a lesão do SNC 11. Dada a conservação evolutiva da função do gene, desvendar esses eventos celulares e as funções dos genes em frutos-moscas é provável que fornecer informações significativas para a compreensão da maCNS mmalian resposta à lesão e regeneração.

Regeneração de células animais, revela que o crescimento do organismo sentir quando é ordenada e completa, e como a integridade estrutural de um organismo é alcançado e mantido. Entender essas misteriosas habilidades de células é de grande interesse na biologia. Estimular a regeneração é um dos objectivos-chave para médicos neurociência. Nos seres humanos, o sistema central nervoso danificado (CNS) não se regenera. Modelos de roedores de lesão medular são utilizados para compreender como as células respondem a lesões. No entanto, as preocupações éticas, altos custos e do ciclo de vida dos animais lento restringir o progresso. A mosca da fruta Drosophila é um organismo modelo amplamente utilizado em biologia do desenvolvimento e da neurociência. Graças às suas poderosas ferramentas genéticas e ciclo de vida curto, Drosophila tem recorrentemente levou à descoberta de funções de genes e as redes de genes com interesse para a compreensão dos seres humanos e contra a doença. Há evidência abundante de con evolutivaconservação da função do gene das moscas a humanos. Nos últimos anos, vários paradigmas de lesão do sistema nervoso foram estabelecidas em Drosophila. Alguns consistem de danificar os nervos periféricos que correm ao longo da asa ou axotomia de nervos periféricos, incluindo um sensorial e axônios motor 2. No entanto, os sistemas nervosos periférico e central diferem em muitos aspectos, e sabe-se bem que em muitos animais do sistema nervoso periférico podem regenerar enquanto que o SNC não pode. Assim, compreender CNS regeneração, lesão directa ao sistema nervoso central é mais adequado. Lesão Stabbing com uma agulha tem sido aplicado com sucesso para o cérebro adulto Drosophila para investigar a resposta a lesão 3,4. Usando outra abordagem, Ayaz et al. Axônios cortados do SNC em cérebros adultos cultivados com uma potência Piezo microdissector, e analisou a sua regeneração por 4 dias 5. A vantagem destes u conjunto mais tarde experimentalps é que se concentram sobre o cérebro, que é, sem dúvida, de grande interesse. A desvantagem é que o cérebro é muito mais complexo do que o VNC, que lida apenas com motor e controle de sensorial. Trabalho sobre o cérebro adulto também é mais demorado. A larva está pronto para experiências em 4 dias, enquanto que leva cerca de 10 dias para a emergência de adultos, e, em seguida, mais 5 dias para a sua maturação. O cérebro adulto é também mais difícil de manusear, uma vez que é encapsulado no cutícula espessa, que é difícil de remover. O VNC tem a vantagem adicional de ser funcionalmente equivalente ao cabo de vertebrado vertebral. A larva Drosophila é amplamente usado como um organismo modelo para neuroscience 6-9. Embora estritamente falando, a larva está numa fase de desenvolvimento, ele também pode ser considerado um animal totalmente funcional. A larva tem de locomoção, sentidos múltiplos, incluindo gosto olfato, e nocicepção, aprendizagem e memória. Assim, a larva VNC wescolhido como o modelo ideal para lesões do SNC. VNCs de larva e pupa pode ser dissecada e cultivadas no prato, ainda mantendo a integridade celular por até 24 horas 10. Isto sugeriu que a lesão poderia ser aplicado ao VNC, que poderiam então ser gravado no lapso de tempo para ao longo deste período de tempo, ou em cultura e fixado em qualquer ponto de tempo desejado durante este período. Aqui, apresentamos um paradigma experimental para CNS lesão usando a Drosophila larval VNC. O VNC é primeiro dissecados da larva e lesão penetrante é aplicado manualmente com uma agulha de tungsténio. O VNC é então colocada em uma lamela com fundo de vidro, e filmado com lapso de tempo de varredura a laser microscopia confocal. Alternativamente, os VNCs podem ser cultivadas por um período de tempo desejado, e os efeitos celulares do ferimento pode ser analisado em amostras fixadas, utilizando microscopia confocal e imunocoloração. A área da ferida pode ser medida, e análise quantitativa de células number (proliferação celular e da morte celular) pode ser realizada com o software desenvolvido propositadamente. Grandes tamanhos de amostra podem ser facilmente manipulados, resultando em resultados estatisticamente validados. Estes métodos têm sido combinados com sucesso com a genética poderosos de Drosophila para descobrir uma rede de genes subjacentes a resposta regenerativa da glia para lesão do SNC 11.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Coloração bloco </td><td> Microscópio Brunel </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fórceps No. 5 </td><td> por exemplo Belas Science Tools </td><td> por exemplo 11251-20 </td><td></td></tr><tr><td> Agulha de tungsténio: diâmetro da haste, 0,5 mm, o tamanho da ponta, de 1 um, comprimento, 2 polegadas </td><td> Roboz instrumento cirúrgico </td><td> RS-6065 </td><td></td></tr><tr><td> Suporte da agulha </td><td> Roboz instrumento cirúrgico </td><td> RS-6060 </td><td></td></tr><tr><td> Arkansans pedras: Kit de reparo para Dumont Fórceps </td><td> Belas Science Tools </td><td> 29000-00 </td><td></td></tr><tr><td> 35 milímetros placa de Petri com 27 milímetros base de vidro </td><td> Iwaki </td><td> 3930-035 </td><td></td></tr><tr><td> Leica SP2-AOBS microscópio confocal invertido com câmara de ambiente </td><td> Leica </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Shield e Sang inseto M3 médio (ecdisona livre) </td><td> Sigma </td><td> S3652-500 ml </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina e estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td> Salina tamponada com fosfato (PBS) </td><td> Veja 12 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Sigma </td><td> F7524 </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-lisina </td><td> Sigma </td><td> P1399-25mg </td><td></td></tr><tr><td> Formaldeído, 10% de metanol, livre, Pure Ultra </td><td> Polysciences </td><td> 04.018-1 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Anticorpos de rato anti-glutamina sintetase </td><td> Millipore </td><td> MAB302 </td><td></td></tr><tr><td> De coelho anti-GFP anticorpos </td><td> Life Technologies </td><td> A11122 </td><td></td></tr><tr><td> Rato anti-REPO anticorpos </td><td> Estudos de desenvolvimento Hibridoma banco </td><td> 8D12 </td><td></td></tr><tr><td> Rat anti-anticorpos ELAV </td><td> Estudos de desenvolvimento Hibridoma banco </td><td> 7E8A10 </td><td></td></tr><tr><td> Coelho anti-ativos caspase 3 anticorpos </td><td> Abcam </td><td> ab13847 </td><td></td></tr><tr><td> Soro normal de cabra </td><td> Vector Laboratories </td><td> S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-coelho Alexa Fluor 488 </td><td> Life Technologies </td><td> A11034 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-rato Alexa Fluor 647 </td><td&gt; Vida tecnologias </td><td> A21236 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-rato Alexa Fluor 647 </td><td> Life Technologies </td><td> A21247 </td><td></td></tr></tbody></table>

an injury paradigm to investigate central nervous system repair in drosophila

Um método experimental foi desenvolvida para investigar as respostas celulares ao sistema nervoso central (SNC) utilizando a lesão mosca da fruta Drosophila. Reparação compreensão e regeneração em animais é uma questão-chave na biologia. O CNS danificadas humanos não se regenera, e compreender a forma de promover a regeneração é um dos principais objetivos da neurociência médica. O kit de ferramentas poderoso genética de Drosophila pode ser usado para resolver o problema da regeneração do SNC. A lesão da medula nervosa SNC ventral (VNC, equivalente à medula espinal vertebrado) é aplicado manualmente com uma agulha de tungsténio. O VNC pode, posteriormente, ser filmado em time-lapse usando microscopia confocal de varredura a laser por até 24 horas para acompanhar o desenvolvimento da lesão ao longo do tempo. Alternativamente, podem ser cultivadas, em seguida, fixadas e coradas através de imunofluorescência para visualizar neurónios e células da glia com microscopia confocal. Utilizando marcadores apropriados, changes na morfologia celular e do estado das células, como resultado de lesão pode ser visualizada. Com ImageJ e desenvolvido propositadamente plug-ins, análises quantitativas e estatística pode ser realizada para medir alterações no tamanho da ferida ao longo do tempo e os efeitos da lesão da proliferação celular e da morte celular. Estes métodos permitem a análise de amostras de grande tamanho. Eles podem ser combinados com as poderosas da genética de Drosophila para investigar os mecanismos moleculares subjacentes CNS regeneração e reparação.

Aqui nós mostramos como executar lesão esfaquear a larva Drosophila VNC e analisar as respostas celulares a danos usando lapso de tempo e imunocoloração microscopia de fluorescência confocal. Por lapso de tempo dados, a lesão é visualizado como uma zona de GFP-negativa dentro do neurópilo de exemplares portando o marcador axonal G9 (Figura 2). Pouco após esfaquear GFP-negativas, pequenas áreas, que se parecem com buracos ou vacúolos, começam a aparecer (Figura 2A). Tal GFP-negativas áreas geralmente aumenta-se a cerca de 6 a 8 horas após esfaquear (Figura 2A). Subsequentemente, as áreas de GFP-negativas encolher e pode mesmo desaparecer (Figura 2B). Até 22 horas após a facada, a área ocupada pela ferida é geralmente menor do que a área máxima foi de 6 a 8 horas após esfaquear (Figuras 2A, B). Da mesma forma a área DsRed-negativa nos processos gliais inicialmente aumenta também, mas Shrinks por 22 horas após o esfaqueamento. Curiosamente, muitas vezes DsRed-positivos processos gliais preencher os buracos GFP-negativos no neurópilo antes do seu desaparecimento (Figura 2C). Usando imunomarcação em amostras fixadas, multa processos gliais e sua resposta à lesão pode ser visualizado com resolução melhor do que com o lapso de tempo imagens. Isto pode ser feito, por exemplo, utilizando o controlador repoGAL4 glial para induzir a expressão de um repórter tethered membrana (por exemplo, UAS-mCD8GFP) em moscas de visualizar todas as células da glia (excepto a glia linha média). Isto pode também ser combinado com outros marcadores gliais, tais como anti-GS2, que rotula neurópilo associadas células gliais (Figuras 3A, B). Aqui nós mostramos que, embora o cordão nervoso ventral é esfaqueado do lado dorsal, apunhalando lesão resulta em um dente ventral (Figura 3A, pontas de seta). Esfaqueamento parece afetar mais severamente o neurópilo e neurópilo associada ª células glialuma superfície e células do córtex da glia (Figura 3B). Processos gliais aparecem desorganizado no neurópilo, enquanto eles ainda mantêm sua malha como organização no córtex. Provoca lesões no GS2 positivo restos celulares, que é distinta das células normais como fragmentos de detritos são muito menores e não ligado a um corpo celular. Isto revela danos neurópilo associadas células gliais (Figura 3B). Degeneração neurópilo associados células gliais também foram observados por microscopia eletrônica de 15. Anti-clivada Caspase 3 + coloração apoptose é observada em neurópilo associados células gliais 15, mostrando que eles sofrem apoptose após esfaquear lesão. Células gliais associadas neurópilo também foram mostrados para fagocitar restos neuronal 15, e GS2 + sinal pode também revelar a imersão dos neurônios apoptóticos por processos gliais. Clivados Caspase-apoptóticas + células também são observados no córtex, pelo menos, algumas das quais correspondem a Elav + neurónios ( <strong&gt; Figura 3C). Utilizando amostras fixadas e imunocoloração também permite análises quantitativas de respostas celulares à lesão, tais como efeitos na proliferação e apoptose. Para isso, desenvolveu propositadamente dois ImageJ plug-ins, Larva Caspase DeadEasy e Glia DeadEasy, a contar automaticamente o número de células gliais e células apoptóticas, respectivamente. Eles foram validados para trabalhar em VNCs larval e são muito precisos. Utilizando estes, é possível observar um aumento do número de células positivas para REPO gliais causadas por lesão penetrante, até 22 horas (Figura 4A) 15. Há também um aumento do número de anti-clivada da caspase-3 de células apoptóticas por 6 h pós-stabbing (Figura 4B) 15. Tal aumento da proliferação glial e apoptose em resposta a uma lesão no SNC de Drosophila é reminiscente da resposta a uma lesão no SNC de vertebrados. Um aspecto crucial deste protocol é a qualidade do VNC dissecações. É difícil dizer, no momento da dissecção se os VNCs ter sido danificado ou não no processo. É importante ter um cuidado especial para realizar dissecções suaves. No entanto, as amostras de má qualidade, inevitavelmente, ser produzido, e é essencial que estes sejam identificadas em fases posteriores e descartados. Em nossas mãos, degeneração VNC parece estar relacionado com a lesão, mas sim causado por dissecção áspera. Não foram observados um tamanho crítico, em que a ferida ferimento, e analisar todas as amostras de feridas que não são degradados. Quando VNCs manter a sua integridade, a superfície tende a parecer VNC lisa e brilhante, e não há furos no neurópilo são observados (Figura 5A). Degradação de VNCs pode ser reconhecido por 24 hr pós-dissecação da superfície áspera das áreas VNC ventral e lateral (Figura 5B). Degradação do neurópilo relacionada com lesão penetrante pode também ocorrer, e é reconhecido como neurópilo holes do sinal de fundo das amostras de imunomarcação. As amostras com estes sinais de degeneração deve ser eliminado (Figura 5C). Em nossas mãos, a taxa de sucesso para a dissecção e lesão no controle intacto e esfaqueou (yw) moscas são ambos em torno de 70%. Esta taxa pode variar com a perícia da pessoa que executa as experiências, e com o genótipo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig1.jpg" /> Figura 1. Desenho esquemático da larva estadiamento e esfaquear lesão. (A) No dia 0, as moscas estão autorizados a colocar ovos em um prato suco de uva Petri por 3 hr. No dia 1, o eclodidos larvas de primeiro estádio (L1) são recolhidos e colocados em frascos contendo alimento levedura padrão, onde são mantidos por mais 3 dias. No dia 4, as larvas são recolhidas do frasco de alimentos, e usado para as experiências agudas. (B) vista lateral do sistema central nervoso larval.A região abdominal do cordão nervoso ventral é perfurado com uma agulha a partir do lado dorsal. Anterior é para a esquerda, e posterior para a direita. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig2.jpg" /> Figura 2. Time-lapse progressão da lesão VNC. Microscopia confocal em VNCs ao vivo com axônios GFP-rotulados e DsRed-rotulados células gliais. Genótipo:. UASDsRed / +; G9 / +; repoGAL4 / + (A) A lesão é reconhecida pela ausência de fluorescência do neurópilo axonal. Depois de esfaquear, GFP-negativas buracos aparecem, a partir daí a aumentar em tamanho e número. Projeções de cinco secções ópticas de cada ponto de tempo após esfaquear lesão. (B) O axonais neurópilo encolhe lesão de nove horas após esfaquear. Estas imagens são únicas secções ópticas de diferentes momentos após esfaquear lesão. Para identificar as posições equivalentes em cada amostra, o número de fatia mesmo eAch ponto de tempo em que a pilha de lapso de tempo de dados foi escolhido. Ao comparar os padrões visualizados com UASmCD8GFP&gt; G9 e repoGAL4 na área não afectada pela facada, as fatias foram verificados como sendo de posições equivalentes ao longo do eixo Z. As linhas a tracejado em (A, B) indica o bordo da ferida. (C) alta ampliação de feridas no neurópilo. GFP-negativas buracos foram enchidos com DsRed-positivos processos gliais, e posteriormente desapareceu (pontas de seta). Visão horizontal. Se anterior. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig3.jpg" /> Figura 3. Caracterização da lesão celular VNC. VNCs tendo uma membrana repórter GFP tethered para todas as células da glia (exceto glia linha média) corados com anti-GFP e anti-GS2, um neurópilo associada marcador de células glial. Genótipo:. + / +; UASmCD8GFP / +; repoGAL4 / + (A) VNCs foram esfaqueados da dorsal lado, mas isto causa um dente ventralmente (pontas de seta). Vista sagital de secções ópticas individuais, para a esquerda e para cima dorsal anterior. (A, B) Stabbing lesão afeta mais severamente neurópilo-associado do que as células gliais do córtex e da superfície das células gliais. Provoca lesões no GS2 positivo restos celulares (setas em B). Vista (B) Horizontal de um único secções ópticas, se anterior. Pontas de seta apontam para GS2 + restos celulares. (C) Colocalisation do marcador anti-apoptótica clivada da caspase-3 e o marcador neuronal anti-Elav mostrando que após a lesão de algumas das células moribundas do córtex são neurónios. np, neurópilo; cx, córtex. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig4.jpg" /> Figura 4. Contagem automática de células gliais e células apoptóticas usando DeadEasy. (A) Exemplo de uso &quot;glia DeadEasy larval &#39;para contar REPO positivocélulas gliais. Esquerda: metades VNC ventral corados com anticorpos anti-REPO; médias: saída da glia larval DeadEasy mostrando células identificadas pelo plug-in, para a direita: fundir. Os números à direita são o número de células positivas para REPO contados automaticamente por uma pilha inteira de secções ópticas confocais em cerca de 30 segundos. Aumenta o número de células gliais nos VNCs esfaqueado. (B) Exemplo de uso de &#39;larva Caspase DeadEasy&#39;. Projeções de cinco seções ópticas confocal corados com anti-clivada caspase 3 anticorpos; médias:: Esquerda saída mostrando células identificadas pelo plug-in, para a direita: fundir. Os números à direita são o número de células positivas para CASPASE contados automaticamente por uma pilha inteira de secções ópticas confocais em cerca de 30 segundos. O número de células apoptóticas aumenta no VNC esfaqueado. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig5.jpg" /> Figura 5. Exemplos de degeneration. (A) Um VNC saudável. Não existem sinais de degeneração. (B) O lado do tórax é degenerado (cabeças de seta) numa amostra esfaqueado. Asterisco indica local da lesão. (C) Buracos no neurópilo torácica (seta branca) e no córtex (laranja ponta de seta) em um VNC não esfaqueado. As amostras com vacuolização neurópilo e extensa danificado deve ser descartado. Aqui VNCs foram coradas com o marcador associado neurópilo glial anti-Ebony. Visão horizontal, se anterior.

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An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

Um paradigma lesão utilizando a Drosophila larval cordão nervoso ventral para investigar a regeneração do sistema nervoso central e de reparação é descrito. Stabbing seguido por varredura a laser microscopia confocal em amostras de lapso de tempo e fixa, combinada com a análise quantitativa, com software desenvolvido propositadamente e genética, são utilizados para investigar os mecanismos moleculares do CNS regeneração e reparo.

Um Paradigma para Investigar Lesão de reparação do sistema nervoso central em<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

an-injury-paradigm-to-investigate-central-nervous-system-repair

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

13.2K visualizações.  University of Birmingham. Um paradigma lesão utilizando a Drosophila larval cordão nervoso ventral para investigar a regeneração do sistema nervoso central e de reparação é descrito. Stabbing seguido por varredura a laser microscopia confocal em amostras de lapso de tempo e fixa, combinada com a análise quantitativa, com software desenvolvido propositadamente e genética, são utilizados para investigar os mecanismos moleculares do CNS regeneração e reparo.

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Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

Visualização do Sistema Nervoso embrionárias no Whole-mount Drosophila Os embriões

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Neurociência

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Imagem Multimodal de implante de células-tronco no sistema nervoso central de camundongos

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

Produção de lentivirais para Células Transdução do Sistema Nervoso Central

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Marcação de células individuais no Sistema Nervoso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Entrega intraventricular direta de medicamentos para o Sistema Nervoso Central Rodent

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

In vivo Interrogatório de Sistema Nervoso Central Translatome por Polyribosome Fracionamento

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo Optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Clearing óptica do Sistema Nervoso Central Rato Usando a claridade passiva

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory environment and the limited capacity for neurogenesis. We are developing&#160;a strategy to simultaneously address&#160;neuronal and axonal pathway loss within the damaged CNS. This manuscript presents the fabrication protocol for micro-tissue engineered neural networks (micro-TENNs), implantable constructs consisting of neurons and aligned axonal tracts spanning the extracellular matrix (ECM) lumen of a preformed hydrogel cylinder hundreds of microns in diameter that may extend centimeters in length. Neuronal aggregates are delimited to the extremes of the three-dimensional encasement and are spanned by axonal projections. Micro-TENNs are uniquely poised as a strategy for CNS reconstruction, emulating aspects of brain connectome cytoarchitecture and potentially providing means for network replacement. The neuronal aggregates may synapse with host tissue to form new functional relays to restore and/or modulate missing or damaged circuitry. These constructs may also act as pro-regenerative&#160;&#34;living scaffolds&#34; capable of exploiting developmental mechanisms for cell migration and axonal pathfinding, providing synergistic structural and soluble cues based on the state of regeneration. Micro-TENNs are fabricated by pouring liquid hydrogel into a cylindrical mold containing a longitudinally centered needle. Once the hydrogel has gelled, the needle is removed, leaving a hollow micro-column. An ECM solution is added to the lumen to provide an environment suitable for neuronal adhesion and axonal outgrowth. Dissociated neurons are mechanically aggregated for precise seeding within one or both ends of the micro-column. This methodology reliably produces self-contained miniature constructs with long-projecting axonal tracts that may recapitulate features of brain neuroanatomy. Synaptic immunolabeling and genetically encoded calcium indicators suggest that micro-TENNs possess extensive synaptic distribution and intrinsic electrical activity. Consequently, micro-TENNs represent a promising strategy for targeted neurosurgical reconstruction of brain pathways and may also be applied as biofidelic models to study neurobiological phenomena in vitro.

This manuscript details the fabrication of micro-tissue engineered neural networks: three-dimensional micron-sized constructs comprised of long aligned axonal tracts spanning aggregated neuronal population(s) encased in a tubular hydrogel. These living scaffolds can serve as functional relays to reconstruct or modulate neural circuitry or as biofidelic test-beds mimicking gray-white matter neuroanatomy.

Redes neuronais modificadas por micro-tecidos tridimensionais com inspiração anatômica para a reconstrução, modulação e modelagem do sistema nervoso

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

Quantifying Acute Changes in Renal Sympathetic Nerve Activity in Response to Central Nervous System Manipulations in Anesthetized Rats

Renal sympathetic nerve activity (RSNA) and mean arterial pressure are important parameters in cardiovascular and autonomic research; however, there are limited resources directing scientists in the techniques for measuring and analyzing these variables. This protocol describes the methods for measuring RSNA and mean arterial pressure in anesthetized rats. The protocol also includes the approaches for accessing the brain during RSNA recordings for central nervous system (CNS) manipulations. The RSNA recording technique is compatible with pharmacologic, optogenetic, or electrical stimulation of the CNS. The approach is useful when an investigator will measure short-term (min to h) autonomic responses in non-survival experiments to correlate anatomically with CNS nuclei. The approach is not intended to be used to obtain chronic (survival) recordings of RSNA in rats. Discharges in RSNA, averaged rectified RSNA, and mean arterial pressure can be quantified and analyzed further using parametric statistical tests. Methods for obtaining venous access, recording mean arterial pressure telemetrically, and brain fixation for future histological analysis are also described in the article.

Methods for measuring sympathetic and cardiovascular responses to central nervous system (CNS) manipulations are important for advancing neuroscience. This protocol was developed to assist scientists with measuring and quantifying acute changes in renal sympathetic nerve activity (RSNA) in anesthetized rats (non-survival).

Quantificar alterações agudas na atividade do nervo simpático Renal em resposta a manipulações do sistema nervoso Central em ratos anestesiados

Renal sympathetic nerve activity (RSNA) and mean arterial pressure are important parameters in cardiovascular and autonomic research; however, there are ...