Descrevemos um protocolo para dissecar, imunomarcar e montar cérebros de larvas e adultos de Drosophila com ênfase especial nos lobos ópticos. Dada a complexa organização tridimensional do lobo óptico, prevê-se que o protocolo descrito aqui forneça aos pesquisadores uma maior compreensão da relação entre a orientação de montagem e as estruturas do lobo óptico visualizadas. Este protocolo descreve três estratégias de montagem para lobos ópticos larvais e adultos, cada uma das quais fornece um ângulo ideal para visualizar uma estrutura específica do lobo óptico durante a imagem.
Antes de iniciar a dissecação, encha todos os poços de uma placa de três poços com 400 microlitros de PBS por poço e use uma pinça para selecionar suavemente 15 larvas de terceiro ínstar errantes rastejando no interior de um frasco ou garrafa de drosófila. Coloque todas as larvas no primeiro poço da placa de três poços e transfira uma larva para o poço do meio da placa. Usando a mão não dominante, prenda o corpo da larva na base do poço e use a mão dominante para segurar suavemente o gancho da boca da larva.
Puxe o gancho da boca para longe do corpo para remover o cérebro. Em seguida, remova os tecidos acessórios, incluindo os discos imaginais. Em seguida, coloque o cérebro no terceiro poço da placa.
Quando todos os cérebros tiverem sido dissecados, use uma pipeta P200 para remover cuidadosamente o PBS do terceiro poço, deixando solução suficiente para manter o cérebro submerso. Adicione 500 microlitros de solução de fixação a frio recém-preparada ao poço. Mexa suavemente a solução com a pinça para que o cérebro gire no prato e cubra o poço com uma lâmina de microscópio de vidro.
Em seguida, coloque o prato no gelo por 30 minutos para fixar o tecido. Lave os cérebros cinco vezes com 400 microlitros de PBS fresco mais triton por lavagem. Os cérebros agora estão prontos para a incubação primária de anticorpos.
Para dissecções cerebrais em adultos, anestesie de 10 a 15 moscas adultas e coloque-as em um lenço umedecido de laboratório sobre o gelo. Use uma pinça para transferir suavemente uma mosca adulta pela asa para um poço de uma placa de dissecação de três poços contendo 400 microlitros de PBS. Use um par de pinças na mão não dominante para segurar o tórax da mosca contra a base do poço e use uma pinça ultrafina com a mão dominante para puxar suavemente a cabeça do resto do corpo.
Descarte o corpo em um lenço umedecido com a mão não dominante e use a mão dominante para segurar a cabeça contra a base do poço pela tromba. Use as duas pinças para descascar cada região da cutícula entre os olhos, até que o cérebro fique exposto, e remova todos os tecidos acessórios que permanecem presos ao cérebro. Coloque o cérebro limpo no terceiro poço e disseque o próximo cérebro conforme demonstrado, até que 15 cérebros tenham sido obtidos, ou um período máximo de dissecção de 30 minutos tenha decorrido.
Fixe os cérebros com 500 microlitros de solução de fixação por 20 minutos em temperatura ambiente e lave os cérebros cinco vezes com PBS mais triton, conforme demonstrado. Os cérebros adultos agora estão prontos para a incubação primária de anticorpos. Substitua a última lavagem por duas gotas de meio de montagem seguro fluorescente para submergir os cérebros e adicione uma única gota de meio de montagem ao centro de uma nova lâmina de microscópio de vidro.
Use uma pinça para agarrar cada cérebro larval pelo cordão nervoso ventral para transferência para a lâmina. Para visualizar progenitores e neurônios da região central do centro de proliferação externo, lâmina ou plugue lobular, certifique-se de que o cordão nervoso ventral se projete sobre os lobos, coloque os cérebros larvais na lâmina com o lado anterior do tecido voltado para cima. Para visualizar as células pertencentes às pontas dos centros de proliferação externos ou internos, certifique-se de que o cordão nervoso ventral se projete sob os lobos.
Coloque os cérebros das larvas na lâmina com o lado posterior do tecido voltado para cima. Para visualizar o crescente de neurônios dos centros de proliferação internos e externos nos eixos dorsal ventral e lateral medial, use um par de pinças afiadas ou uma agulha de tungstênio para dividir os lobos cerebrais através do cordão nervoso ventral, começando pelo ponto de clivagem entre os lobos. Reoriente cada lóbulo com o lado lateral voltado para cima.
Quando os cérebros das larvas estiverem adequadamente orientados, coloque uma pequena gota de mídia de montagem em ambos os lados do cérebro. Coloque uma lamínula em cada gota e coloque uma lamínula final sobre os cérebros de modo que as bordas direita e esquerda repousem sobre as outras duas lamínulas, formando uma ponte de lamínula. Em seguida, use esmalte para selar as bordas da ponte de deslizamento de cobertura para prender os cérebros montados.
Após a última lavagem secundária de anticorpos, realizar uma lavagem final com 400 microlitros de PBS. Substitua o PBS por três gotas de meio de montagem seguro fluorescente para submergir os cérebros. Adicione uma gota de mídia de montagem aos terços esquerdo e direito de uma lâmina de microscópio de vidro.
Coloque uma lamínula sobre cada gota para construir uma ponte de lamínula. Sele as bordas externas da lamínula direita com esmalte e adicione uma única gota de mídia de montagem entre as lamínulas. Usando uma pinça, transfira suavemente os cérebros para a lâmina com cuidado extra para evitar danos aos lobos ópticos.
Para visualizar os corpos celulares dos neurônios da lâmina e da medula, use uma agulha de tungstênio para orientar o cérebro em uma posição anterior com os lobos da antena projetando-se para fora. Para visualizar os neurônios do complexo lobular, oriente os cérebros em uma parte posterior com os lobos antenais voltados para baixo contra a posição do slide. Para visualizar todos os neurópilos do lobo óptico em um único plano, oriente os cérebros em uma posição horizontal, alinhe os cérebros em uma montagem anterior e, em seguida, use uma agulha de tungstênio para girar cada cérebro 90 graus para cima, de modo que ele fique em seu lado ventral, descansando na borda da lamínula.
Quando os cérebros adultos estiverem adequadamente orientados, coloque uma lamínula final sobre os cérebros de modo que as bordas direita e esquerda se sobreponham às outras duas lamínulas para formar uma ponte, sele a lâmina com esmalte. Aqui está uma imagem de um lobo óptico larval na orientação de montagem anterior. Na orientação de montagem anterior, o epitélio do centro central de proliferação mais alto, o neuroblasto da medula e os neurônios da lâmina aparecem na superfície como faixas de células que envolvem o cérebro.
Mais profundamente no cérebro, no meio da pilha Z, o principal epitélio do centro de proliferação externa e seus respectivos neuroblastos e neurônios são visíveis. Além disso, o epitélio do centro de proliferação interno e os neurônios do tampão lobular são visíveis nesses cortes intermediários. As fatias Z mais profundas retratam o outro lado do cérebro, onde as pontas posteriores do centro de proliferação externo estão localizadas.
A ponta superficial do centro de proliferação interno também está presente. Observe que essas seriam as primeiras estruturas visíveis se o lobo óptico fosse montado posteriormente. Aqui está uma imagem de um lóbulo óptico montado de lado.
Na superfície da montagem lateral, a lâmina crescente é visível e a lua crescente está localizada entre seus braços. O crescente neuronal da medula aparece em uma posição Z ligeiramente mais profunda. Aqui está uma imagem de um lobo óptico adulto montado em uma orientação anterior.
Como a medula está localizada na superfície da montagem anterior, o córtex da medula é imediatamente visível. Os corpos celulares no córtex projetam suas arborizações no neurópilo, que pode ser visualizado em uma posição Z intermediária. A lóbula também aparece neste nível, orientada perpendicularmente à medula.
Na posição Z mais profunda, o neurópilo final do lobo óptico, a placa do lóbulo é visível. Observe que a placa da lóbula seria a primeira estrutura visível em uma montagem posterior. Aqui está uma imagem de um lobo óptico adulto montado em uma orientação horizontal.
Quando o cérebro é virado 90 graus de lado para uma posição horizontal, todos os neurópilos e córtices do lobo óptico são visíveis em um único plano. Ao realizar este protocolo, a coisa mais importante a lembrar é manter o tecido cerebral submerso em solução durante todo o protocolo. Se os cérebros forem expostos ao ar, a qualidade da mancha e, portanto, as imagens finais serão significativamente reduzidas.
Uma compreensão de como a orientação da montagem afeta a visualização do lobo óptico é importante para imagens ao vivo. Cérebros larvais e adultos podem ser cultivados e fotografados ao longo de vários dias para acompanhar as divisões celulares ou mudanças em sua própria morfologia. Aqui, a orientação de montagem é crítica, pois os tipos de células de interesse devem estar próximos à lamínula para a detecção ideal do sinal fluorescente in vivo.
