Os autores agradecer Marit Warrer excelente assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho dinamarquês para pesquisa independente | Ciências naturais [1323-00343B] e a Fundação de pesquisa nacional dinamarquesa [DNRF120].

1. preparação de culturas bacterianas.
<ol><li>Crescer todas as culturas em Erlenmeyers com uma relação de volume de cultura/frasco no máximo 1/6. Em uma instalação experimental típica, crescem as culturas a 37,0 ° C e agitando a 160 rpm em morpholinepropanesulfonic ácido (MOPS) mínimo médio 18 suplementado com a fonte de carbono preferencial, por exemplo glicose 0,2%, pelo menos 10 gerações consecutivas antes da colheita do RNA.</li>
	<li>o dia antes da colheita de RNA, diluir uma cultura Superdimensonada da estirpe desejada em meio mínimo ESPANADORES de tal forma que vai chegar a desejada OD 436 no momento desejado no dia seguinte. Calcular o volume de cultura Superdimensonada usar para inoculação pela fórmula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56212/56212eq1.jpg" /> Nota: aqui, OD novo denota o desejado OD 436 após a incubação, V nova denota o volume da cultura diluído, OD velho denota o OD 436 da cultura Superdimensonada diluída de, G denota o número de gerações a cultura vai crescer, desde o tempo de diluição (t 1) que o tempo que é necessário no dia seguinte (t 2) e pode ser calculada como: tempo de diferença (em min) entre t 1 e t 2 dividido pelo tempo de geração (em min). Para garantir o crescimento de estado estacionário, no momento da amostragem, G deve ser &#8805; 10; V velho denota o volume da cultura out-adulto que deve ser transferido para o meio fresco. Esta equação é uma aproximação que não leva em conta para qualquer fase de retardo; um fenômeno que frequentemente observado após a diluição de uma cultura de out-crescida na mídia fresca.
	<ol><li>Condições de crescimento irá variar dependendo da finalidade do experimento, mas para limitar a variação de célula para célula em níveis de tRNA e aumentar a reprodutibilidade dos resultados, (recomendado) crescem as culturas para firmar o estado antes da amostragem 19.</li></ol></li></ol> 2. Preparação de pico-em células Nota: A cepa de Escherichia coli MAS1074, que expressa o gene selC codificação tRNA selC sob o controle de um isopropílico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)- promotor inducible é usado como a tensão de pico-no.
<ol><li>Dilua uma cultura Superdimensonada de MAS1074 para um OD 436 de 0,05 em MOPS mínimo suplementado com 100 µ g/mL ampicilina e 0,2% de glicose. Crescer a cultura a 37 ° C, agitando a 160 rpm. 
	Nota: Veja a discussão para o uso de uma estirpe de referência alternativo.</li>
	<li>Em OD 436 ~ 0.1, adicionar IPTG para uma concentração final de 1 mM para induzir a expressão de tRNA selC. Crescer a cultura para OD 436 ~0.5 (~ 3-4 h de crescimento) e mover o frasco de cultura para um banho de gelo. Manter a cultura de pico-na célula no gelo até que todas as amostras para a purificação de RNA foram colhidas.</li>
</ol> 3. Colheita das amostras experimentais.
<ol><li>Pre-quente (37 ° C), um tampado Erlenmeyer de 100 mL (ou similar) contendo 4 mL 10% (p/v) o ácido tricloroacético (TCA) para cada amostra, colocando-o em um banho de água aquecida. 
	Nota: cuidado, TCA decompõe-se em cima de aquecimento, produzindo fumos tóxicos e corrosivos, incluindo cloreto de hidrogênio e clorofórmio. A solução em água é um ácido forte; Ele reage violentamente com bases e é corrosivo para muitos metais. Devem ser tomadas precauções adequada quando usando esse líquido.</li>
	<li>Imediatamente antes da colheita da pilha, medir e registrar o OD 436 da cultura.</li>
	<li>Para colher as células, transferir 4 mL da cultura para um frasco previamente aquecido contendo TCA.</li>
	<li>Misturar a amostra agitando o balão com a mão para s. 5 mistura com o TCA imediatamente desativa actividades enzimáticas tudo e, assim, preserva os níveis de carga dos tRNAs. 
	Nota: Se várias amostras devem ser recolhidos, manter a amostras colhidas no TCA no gelo até que todas as amostras foram coletadas.</li>
</ol> 4. Adição de pico-em células Nota: preparação de pico-em células é descrita na etapa 2.
<ol><li>Quando todos amostras para preparação do RNA foram coletado, adicionar 5% pico-em células (baseadas no OD) para cada amostra. 
	Nota: O volume de pico-na célula cultura necessária é calculado pela fórmula: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56212/56212eq2.jpg" /> onde V pico denota o volume da cultura de pilha de pico-no necessário, V exp denota o volume da cultura de células experimentais colhidos (sem TCA), OD exp denota o OD 436 da cultura de pilha experimental no momento da colheita no TCA. OD spike denota o OD 436 da cultura pico-na célula. Se múltiplas amostras são colhidas em diferentes ODs, o volume de pico em células adicionado deve ser ajustado de acordo com a fórmula acima para cada amostra.</li>
	<li>Para quantificar a contribuição da espiga-em células para as espécies de RNA de interesse, preparar uma amostra contendo somente spike-em células misturando 4ml spike-em células com 4 mL TCA. Preparar RNA a partir desta amostra da mesma forma como para as outras amostras.</li>
	<li>, Opcionalmente, tomar outro frasco contendo apenas a amostra experimental, sem pico-em células e incluí-lo para quantificar a contribuição da amostra experimental para o tRNA selC níveis; os níveis endógenos de tRNA selC em Escherichia coli K-12 são insignificante baixo.</li>
</ol> 5. Preparação do RNA Nota: protocolo de preparação do RNA o descrito aqui é essencialmente descrito por Vieira et al. 1; Para evitar o deacylation do aminoacylated os tRNAs durante a purificação é importante manter as amostras em pH ácido e a 0 ° C ao longo do curso da purificação. Use tubos/frascos estéreis limpo para manter as amostras e as soluções e preparar todas as soluções com ultrapura (18,2 MΩ·cm resistividade) água.
<ol><li>Pour 8 mL de cada amostra para um tubo de centrifugação refrigerada de gelo. Centrifugar as amostras por 10 min a 9.500 x g a 4 ° C. completamente remover sobrenadante e ressuspender em 0,3 mL frio 0,3 M de acetato de sódio, pH 4,5 e 10 mM de EDTA.</li>
	<li>Transferir cada amostra para um tubo de microcentrifugadora frio 1,5 mL e adicionar fenol 0,3 mL solução equilibrada com a mesma reserva. 
	Nota: cuidado, fenol produz gases tóxicos e é altamente corrosivo para a pele.</li>
	<li>Vortex cada amostra 10 x 15 s pelo menos 1 min entre cada vórtice. Num Vortex manter as amostras em 0 ° C. usar as pausas frequentes para assegurar que as amostras de mantenham-se frio.</li>
	<li>Amostras de centrifugar por 15 min a 20.000 x g a 4 ° C. transferência a fase água (fase superior) para Nova microcentrifuga de 1,5 mL de tubos. Adicionar 0,3 mL frio fenol e vórtice 4 x 15 s como antes.</li>
	<li>Centrifugação por 10min a 20.000 x g a 4 ° C. transferência a fase de água de novo, frio 1,5 mL microcentrifuge tubos contendo 2,5 vezes o volume de etanol a 96% (~ 750 µ l). Precipitar o RNA incubando os tubos por 1h a-20 ° C, ou durante a noite a -80 ° C.</li>
	<li>Amostras de centrifugação por 30 min a 20.000 x g a 4 ° C. descartar o sobrenadante e cuidadosamente, adicionar 1 mL de etanol a 70% frio sem perturbar a pelota do RNA. Inverta suavemente uma vez para lavar o interior dos tubos com etanol. 
	Nota: O sedimento pode ser difícil ver neste passo.</li>
	<li>Centrifugação por 10min a 20.000 x g a 4 ° C. completamente remover o sobrenadante e deixe secar naturalmente a pelota até não sobrar nenhuma etanol. Resuspenda o pellet vortexing vigorosamente em 20 µ l 10mm frio de sódio acetato pH 4.5 e 1 mM EDTA. 
	Nota: Não seque em demasiado a pelota como ele se tornará difícil ressuspender.</li>
	<li>, Opcionalmente, avaliar a concentração de RNA medindo a absorbância em 260 nm.</li>
	<li>, Opcionalmente, avaliar a qualidade do RNA purificado através de de eletroforese de gel de agarose 20.</li>
	<li>Amostras de loja a -80 ° C. 
	Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
</ol> < classe p= "jove_title" &gt; 6. Preparação da amostra de controle quimicamente deacylated Nota: para distinguir a banda de aminoacylated tRNA de sua contraparte deacylated na Northern blot, um quimicamente deacylated alíquota é preparado pelo tratamento alcalino. Para a maioria dos fins, é suficiente para deacylate uma única amostra para cada borrão do Norte.
Amostra de <ol><li>thaw o RNA no gelo. Transfira uma alíquota de 4 µ l da amostra do RNA para um tubo novo. Adicione pH de Tris-HCl µ l 46 9.0. Incubar durante 2 h a 37 ° C.</li>
	<li>Adicionar 15 µ l de acetato de sódio 0,3 M, pH 4,5 e posteriormente Adicionar 125 µ l de etanol a 96%. Precipitar o RNA a-20 ° C durante 1 h.</li>
	<li>Centrífuga por 30 min a 20.000 x g a 4 ° C. completamente remover o sobrenadante e ressuspender em 4 µ l 10mm frio de sódio acetato pH 4,5 e 1 mM EDTA. 
	Nota: O protocolo pode ser pausado aqui, se a amostra é armazenada a -80 ° C.</li>
</ol> 7. Gel eletroforese e mancha do Norte <ol><li>Mix 4 µ l de amostra (não tratada ou quimicamente deacylated) com amortecedor do carregamento 6 µ l (0,1 M de acetato de sódio (pH 5.0), 8m ureia, 0,05% de azul de bromofenol e 0.05% xileno cianol). 
	Nota: Lembre-se de incluir a amostra contendo apenas spike-em células, o quimicamente deacylated amostra (e a amostra sem espiga-em células, se um estava preparado).</li>
	<li>Carregar as amostras em 0,4 mm espessura 6,5% gel de poliacrilamida (acrylam 19:1 - ide:bisacrylamide) que contém ureia 8 M em tampão de acetato de sódio 0,1 M (pH 5.0). Usar géis longa de 60 cm para a adequada separação de espécies de tRNA.</li>
	<li>Separado do RNA por eletroforese em gel de 10 V/cm a 4 ° C, até o azul de bromofenol atinge o fundo do gel (~ 20 h).</li>
	Tintura de <li>a área da tintura xileno cianol e 20 cm para baixo para o azul de bromofenol é usada para a mancha (a distância entre os dois corantes deve ser 25-30 cm). Separe as placas de vidro de dois, com cuidado para que o gel permanece em um deles. Um pedaço de papel de filtro fino é cortado para o tamanho da área de mancha desejada e colocado em cima da parte do gel que será usado para a mancha. As peças do gel que não são cobertas por papel de filtro são cortadas e descartadas. Use o filtro de papel para levantar cuidadosamente o pedaço de gel de longe a placa de vidro. 
	Nota: O gel grande é muito frágil para segurar com cuidado.</li>
	<li>Uma membrana de nylon positivamente carregado (por exemplo, membrana Hybond N +) é colocada no topo do gel e é electroblotted a 20 V para 90 min com 40 mM Tris-Acetato (pH 8.1), 2 mM EDTA como buffer de transferência.</li>
	<li>Crosslink o RNA para a membrana usando luz UV (0.12 J/cm 2). 
	Nota: A membrana agora pode ser armazenada à temperatura ambiente e o protocolo pode ser pausado aqui.</li>
</ol> 8. Projeto e verificação de sondas Nota: cuidado de projeto e verificação das sondas de borrão do Norte é crucial para obter resultados fiáveis e evitar indesejável Cruz-hibridação com outras espécies de RNA.
<ol><li>Uso curtos oligonucleotides sintéticos como sondas. Desenha a sequência de sonda, de forma que é complementar à parte mais original da sequência do tRNA de interesse - muitas vezes é o loop anticodão. 
	Nota: Uma lista de sequências de tRNA previsto de vários organismos pode ser encontrada no tRNA Genomic Database (GtRNAdb) 21.</li>
	<li>Ajuste o comprimento da sequência para obter uma previsão de fusão temperatura de 55-65 ° C.</li>
	<li>BLAST (básico Local Alignment Search Tool) o escolhido sequenciar contra a sequência do genoma da cepa bacteriana utilizada no experimento, para verificar se a sequência é exclusiva para o tRNA selecionados, conforme descrito em 22. 
	Nota: A tabela 1 lista sonda sugeridas sequências de vários tRNAs diferentes de e. coli K12. Se a sonda é específica para o tRNA de interesse, apenas duas bandas são visíveis na Northern blot (carregado e descarregado tRNA) e somente uma faixa é visível na pista com a amostra deacylated (tRNA descarregado). Se mais de duas bandas estão presentes, ou se mais validação da especificidade da sonda é desejada, ver discussão.</li>
</ol> 9. Hibridação do borrão do Norte Nota: nas etapas a seguir, a membrana é sequencialmente hibridizada com sondas complementares para os tRNAs específico desejado, incluindo uma sonda específica para a referência de tRNA selC.
<ol><li>Colocar a membrana em um tubo de hibridização e adicionar 6 mL de solução de hibridação (0.9 M NaCl, 0,05 M NaH 2 PO 4 (pH 7,7), 5 mM EDTA, 0,5% (p/v) SDS, 100 mg/mL de distorcido e desnaturado DNA de esperma de arenque e 5 x Denhardt &#39; s solução (100 x Denhardt &#39; solução s = 2% albumina de soro bovino, 2% e 2% polivinilpirrolidona 40 Ficoll)).</li>
	<li>Pre-cruzar a membrana no buffer para 1h rodar a sonda de 42 ° C. Adicionar 30 pmol radioativo oligo-DNA 5 &#39; - final - rotulado com 32 P (preparado como descrito por Sambrook et al. 23) Nota: cuidado, as emissões de alta energia beta de 32 P podem apresentar uma pele substancial e risco de dose de olho. Precaução adequada deve ser tomada quando usar 32 P. Radioactive resíduos deve ser eliminado de acordo com os protocolos de segurança institucionais adequadas.</li>
	<li>Incubar a sonda com a membrana de giro durante a noite no 42 ° C. remover a sonda com uma pipeta descartável 10ml. 
	Nota: Se armazenado em um freezer a sonda pode ser reutilizada.</li>
	<li>No tubo de hibridização, lave a membrana logo em 50 mL de 0,3 M NaCl, citrato de sódio de 30 mM, SDS 0,1% (p/v) à temperatura ambiente. 
	Nota: Esta primeira lavagem contém muito desvinculado da sonda e devem ser tratada como altamente radioactivos.</li>
	<li>Repeat passo 9.4 uma vez e, em seguida, move a membrana para um recipiente de plástico liso ou bandeja incluindo uma tampa. Cobrir a membrana com a solução de lavagem (0,3 M NaCl, 30mm citrato de sódio, 0,1% (p/v) SDS) e ele incube durante 30 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Alterar a solução de lavagem e continue a lavar até um sinal / ruído satisfatório foi obtido (geralmente 3-4 alterações de solução de lavagem). Use um tubo de Geiger-Müller para detectar como o barulho de relação sinal muda medindo a radiação de uma área vazia da membrana e compará-lo com a área onde a sonda tem hibridizado especificamente para tRNA.</li>
	<li>a fim de ser capaz de retirar a sonda da membrana após a exposição, certifique-se que (importante) a membrana não secar antes do processo de descascamento. Coloca a membrana em um saco plástico fino ou envoltório firmemente usando plástico enrole e selá-lo para ser hermético por soldadura ou fita. Coloque a membrana selada em uma tela de phosphorimaging. 
	Nota: O tempo de exposição exigido na tela de phosphorimaging é determinada pela atividade específica da sonda, a quantidade de RNA sondou for e a eficiência de hibridização da sonda e pode variam muito; de alguns minutos a vários dias. Com a experiência, a intensidade da radiação detectada na membrana com o tubo de Geiger-Müller dá uma indicação boa parte do tempo de exposição necessário. Para a quantificação confiável, é importante que a tela não é superexposta.</li>
	<li>Scan phosphorimaging tela usando um scanner a laser e salve o arquivo em &#34; .gel &#34; formato. 
	Nota: Um sinal elevado à relação de ruído é necessário para a quantificação confiável. Sondagem para um tRNA deve resultar em duas bandas; aminoacylated contendo um tRNA (migração mais lenta) e deacylated contendo um tRNA (migração mais rápida). Consulte a Figura 2.</li>
</ol> 10. Descascamento da membrana Nota: antes da membrana pode ser vasculhados a procura de um outro tRNA, a sonda anterior primeiro deve ser removida pelo descascamento da membrana.
<ol><li>Calor suficiente descascamento buffer (15 mM NaCl, 1,5 mM citrato de sódio, 0,1% (p/v) SDS) para cobrir a membrana e despeje-o sobre a membrana. -Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Repita o passo 10.1 até nenhuma radiação pode ser detectado com um tubo de Geiger-Müller; a membrana pode agora ser re-hibridizada seguindo as etapas descritas na seção 9.</li>
</ol> 11. Quantificar o tRNA e níveis de carregamento software de <ol><li>carregar o arquivo .gel para a imagem (consulte a Tabela de materiais). Desenhar uma linha vertical ao longo de cada uma das pistas amostra de tal forma que abrange a maioria da largura da faixa, mas exclui as bordas das bandas onde o sinal pode ser desigual, como mostrado na Figura 3A.</li>
	<li>Visualize conta de cada raia clicando &#34; análise &#34;-&#62; &#34; criar gráfico &#34;. Definir manualmente os dois picos que representa a carga e o tRNA descarregado de cada raia, conforme mostrado na Figura 3B.</li>
	<li>Obter a contagem de cada pico clicando &#34; análise &#34;-&#62; &#34; relatório de área &#34; e gravar a área sob cada um dos dois picos.</li>
	<li>Quando o blot tem sido vasculhados a procura de tRNA selC e pelo menos um tRNA de interesse, normalizar os níveis do tRNA de interesse para tRNA selC.
	<ol><li>Calcular a proporção de tRNA provenientes da espiga-em células em cada pista e subtrair o total de sinal em lane usando a equação: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56212/56212eq3.jpg" /> Nota: aqui, Amostra de tRNA = o sinal obtido de uma única faixa de uma membrana sondada para o tRNA desejado; Amostra selC = o sinal obtido a partir da mesma pista da mesma membrana vasculhados a procura de tRNA selC; Ref tRNA = o sinal obtido a partir da pista contendo RNA só espiga-na célula da mesma membrana sondada para o tRNA desejado; Ref selC = o sinal obtido a partir da pista contendo RNA só espiga-na célula da mesma membrana vasculhados a procura de tRNA selC.</li>
		<li>Para normalizar, divida o valor corrigido do tRNA de cada raia pelo sinal selC tRNA do pista mesmo. 
		Nota: A contribuição para o sinal da selC tRNA de células amostradas é negligenciável (consulte a Figura 2, lane rotulado &#34;-selC &#34;).</li>
	</ol></li> <li>Calcular o tRNA carregamento de nível para cada pista dividindo-se o sinal do pico representando tRNA carregada com a soma do sinal de dois picos (carregada + descarregado).</li></ol>

<ol>
	<li>Varshney, U., Lee, C. -. P., RajBhandary, U. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+aminoacylation+levels+of+tRNAs+in+vivo.+Application+to+studying+recognition+of+Escherichia+coli+initiator+tRNA+mutants+by+glutaminyl-tRNA+synthetase.">Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase.</a> J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).</li><li>Sorensen, M. 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O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependency+on+medium+and+temperature+of+cell+size+and+chemical+composition+during+balanced+grown+of+Salmonella+typhimurium.">Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced grown of Salmonella typhimurium.</a> J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+medium+for+enterobacteria.">Culture medium for enterobacteria.</a> J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).</li><li>Sorensen, M. A., Jensen, K. F., Pedersen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentrations+of+ppGpp+decrease+the+RNA+chain+growth+rate.+Implications+for+protein+synthesis+and+translational+fidelity+during+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">High concentrations of ppGpp decrease the RNA chain growth rate. Implications for protein synthesis and translational fidelity during amino acid starvation in Escherichia coli.</a> J Mol Biol. 236 (2), 441-454 (1994).</li><li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Curtailing+of+the+Stringent+Response+by+Toxin-Antitoxin+Module-Encoded+mRNases.">Rapid Curtailing of the Stringent Response by Toxin-Antitoxin Module-Encoded mRNases.</a> J Bacteriol. 198 (14), 1918-1926 (2016).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo descreve como simultaneamente, medir o nível de carga de específico de e. coli tRNAs e comparar os níveis relativos dos tRNAs em amostras diferentes. Os pontos críticos do protocolo são 1) para manipular as amostras de tal forma que os níveis de carga celular tRNA são retidos, 2) para normalizar as quantidades de tRNA de tal forma que níveis de tRNA relativo em amostras diferentes podem ser comparados confiantemente e 3) para garantir a sp ecificity dos testes selecionados para os tRNAs de...

A seguir, apresentamos um método para quantificar os tRNAs específicas e níveis de medição de sua carga pela mancha do Norte. O método é baseado em uma técnica desenvolvida por Vieira et al . 1. colheita de células em ácido tricloroacético (TCA) e mantendo as amostras a 0 ° C em toda a purificação de RNA, a ligação éster entre o tRNA e o aminoácido é conservada2,3,4. TRNAs Aminoacylated distingue suas contrapartes nonacylated por eletroforese em gel e mancha do Norte, devido a uma diminuição da mobilidade do aminoacylated tRNA no gel, causado por aminoácido covalentemente ligados5. Além disso, apresentamos um protocolo para normalizar as quantidades de tRNA por adição de pico-em células superexpressão do usados raramente tRNAselC 4.
os tRNAs são algumas das moléculas mais abundantes na célula bacteriana e uma parte absolutamente vital da maquinaria de tradução. os tRNAs vincular aminoácidos e transferi-los para os traduzir ribossomas. A ligação dos aminoácidos para tRNAs (aminoacylation ou carregamento) é facilitada pela aminoacil sintetases de tRNA. A abundância relativa de diferentes tRNAs carregada é importante para garantir a fidelidade da síntese de proteínas, porque sub-representação do cognato acusado que tRNA para um codão de determinado RNA mensageiro (mRNA) aumenta a probabilidade de que um tRNA perto-cognato serão erroneamente entrega seu aminoácido à cadeia de polipeptídeo crescente no Ribossoma6. A importância do tRNA carregada é refletida na extensa resposta da célula de e. coli para uma severa queda nos níveis de carregamento de um tRNA; a resposta rigorosa. Durante a resposta rigorosa a síntese dos tRNAs, RNAs ribossomal e maioria dos mRNAs é abaixada em favor de transcrição de mRNAs específicos associados a sobrevivência de biossíntese e estresse de aminoácido, e a taxa de crescimento das células é reduzida drasticamente7 . Além disso, o recente trabalho de nos revelou que a Escherichia coli ativamente degrada a maioria dos seus tRNA em resposta ao estresse que limitam a tradução4,8, sugerindo que o ajuste dos níveis de tRNA pode ser importante para lidar com tais tensões. Assim, medições correctas de abundâncias de tRNA e níveis de carregamento será uma ferramenta importante para compreender plenamente a respostas bacterianas do stress.
Escherichia coli é comumente usado para expressar a proteína recombinante e devido às diferenças no uso do códon entre espécies, expressão de qualidade inferior é um problema muitas vezes enfrentado9. Isto pode ser contornado pela expressão de tRNAs adicionais necessários para traduzir o mRNA recombinante10. Medições do tRNA níveis em tais cepas de carregamento poderiam orientar os esforços de solução de problemas e ajudar a aperfeiçoar a expressão de proteínas.
Este método também permite a detecção de "mischarging"; um aminoacylated da molécula de tRNA com um aminoácido não-cognato. Aminoacylation por aminoácidos diferentes pode causar um tRNA migrar com velocidades ligeiramente diferentes através de géis de poliacrilamida1,11. Em alguns casos, o método também pode ser usado para distinguir padrões diferentes de modificação em idênticas tRNAs3.
Outro estabelecido procedimento bioquímico para a investigação do tRNA níveis de carregamento é periodato de oxidação. O método baseia-se na observação de que a aminoacylated-tRNA é protegido de periodato de oxidação e tRNA descarregado não é. Depois periodato tratamento de oxidação a recarga do tRNA é usada para estimar os níveis de carga do RNA colhido. No entanto, a recarga de vários tRNAs foi mostrado para ser afetado pelo tratamento proporcionando alguma imprecisão12. O método apresentado aqui medidas de carregamento diretamente do RNA purificado, excluindo assim qualquer preconceitos de reações químicas ou enzimáticas. Uma limitação deste método é que apenas uma espécie de tRNA é detectado em um momento, então, embora a mesma Northern blot pode ser descascado e reprobed de vários tRNAs, é demorado e um tanto trabalhoso coletar dados sobre muitos tRNAs.
Uma maneira confiável de normalizar as amostras para o outro é vital em estudos onde o objetivo é comparar os níveis relativos de uma molécula através de amostras diferentes. Aqui apresentamos um procedimento de normalização para o RNA, onde uma pequena alíquota de células de Escherichia coli superexpressão do tRNA raroselC é adicionada como um pico em que todas as amostras experimentais antes da purificação de RNA. Este método é útil não só ao examinar os tRNAs mas para quantificação relativa de qualquer espécie de RNA quando a instalação experimental é tal que nenhum RNA endógena pode ser confiável para ser apresenta na mesma concentração celular em todas as amostras. Por exemplo, o nível de um "housekeeping" como RNA ribossómico (ARNR) muitas vezes é usado como uma referência endógena para comparar as quantidades relativas de outro RNA entre diferentes amostras de13. Mas isso é de pouca utilidade se a concentração celular do RNA referência varia entre amostras, como pode ser o caso para o RNA ribossômico se amostragem ocorre durante um esforço resposta15,16,17 ou durante entrada em fase estacionária17. A adição de pico-em células com as amostras experimentais antes da purificação de RNA fornece uma forma sólida e precisa de normalização independente da instalação do amostragem. Outra forma de padronização é a adição de um ou mais pico-em RNAs para as amostras experimentais após a purificação de RNA. No entanto, este método não leva em conta diferenças eventuais na recuperação de RNA entre as amostras.
Usando células de Escherichia coli que overexpress a referência de RNA como spike-em células (ver Figura 1) em um experimento em e. coli tem a desvantagem de que resulta além de uma pequena quantidade de exógenos Escherichia coli total RNA para a amostras. Podemos corrigir para este acréscimo através da análise de uma amostra contendo somente spike-em células em paralelo com as amostras experimentais (ver o norte borre na pista Figura 2, , rotulada "selC"). O protocolo apresentado é desenvolvido para Escherichia coli K-12, mas é provável que seja aplicável para a maioria das espécies bacterianas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>57-13-6</td>
			<td>Purity &#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide</td>
			<td>Serva</td>
			<td>79-06-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis (N,N&#39;-Methylene-bis-acrylamide)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>76-03-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108-95-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herring Sperm DNA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>100403-24-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polivinylpyrrolidone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P32 &#947;ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligos (probes)</td>
			<td>TAG Copenhagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond N+ membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN203B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroblotter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 7000 Scanner</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28955809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydridization oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geiger-M&#252;ller tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphor imager screen</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of the abundance and charging levels of transfer rnas in escherichia coli

RNA de transferência (tRNA) é uma parte essencial da maquinaria translacional em qualquer organismo. os tRNAs bind e transferir os aminoácidos para o ribossoma traduzir. Os níveis relativos de tRNAs diferentes e a relação de aminoacylated tRNA para total tRNA, conhecido como o nível de carga, são fatores importantes na determinação da precisão e velocidade de tradução. Portanto, a abundância e níveis de carga dos tRNAs são variáveis importantes para medir quando estudar a síntese de proteínas, por exemplo, sob diferentes condições de estresse. Aqui, descrevemos um método para a colheita de tRNA e medição diretamente tanto a abundância relativa e o nível de carregamento absoluto de espécies específicas de tRNA em Escherichia coli. O tRNA é colhida de forma que o laço lábil entre o tRNA e o aminoácido é preservado. O RNA é então submetido a electroforese do gel e do Norte, mancha, que resulta em separação entre os tRNAs carregado e descarregado. Os níveis de tRNAs específico em amostras diferentes podem ser comparados devido à adição de pico-em células para normalização. Antes da purificação de RNA, adicionar 5% de células de Escherichia coli que overproduce o tRNA raroselC para cada amostra. A quantidade de espécies de interesse em uma amostra de tRNA então é normalizada para a quantidade de tRNAselC na mesma amostra. Adição de pico-em células antes da purificação de RNA tem a vantagem sobre a adição de purificado spike-em RNAs que é também responsável por eventuais diferenças de eficiência de lise celular entre as amostras.

Usar o procedimento descrito aqui, a abundância e cobrando os níveis dos três tRNAs foram medidos em Escherichia coli K-12 antes e durante a fome de aminoácidos.
O auxotroph de arginina estirpe NF9154 (thr leu sua argH thi mtl supE44) foi cultivada pelo menos dez gerações em MOPS mínimo suplementado com 0,4% de glicerol, 50 treonina µ g/mL, leucina, arginina e histidina 5 µ g/mL...

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Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantificação de abundância e carregamento níveis de RNAs de transferência em Escherichia coli

Aqui nós apresentamos um método para medir diretamente o RNA de transferência, níveis de carga de purificado Escherichia coli RNA, bem como uma maneira de comparar os níveis relativos do RNA de transferência, ou qualquer outro RNA curto, entre diferentes amostras baseadas na adição de pico-no células expressando um gene de referência.

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

quantification-abundance-charging-levels-transfer-rnas-escherichia

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

9.2K visualizações.  University of Copenhagen. Aqui nós apresentamos um método para medir diretamente o RNA de transferência, níveis de carga de purificado Escherichia coli RNA, bem como uma maneira de comparar os níveis relativos do RNA de transferência, ou qualquer outro RNA curto, entre diferentes amostras baseadas na adição de pico-no células expressando um gene de referência.

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Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique applications for OMV where traditional nanoparticles are proving too difficult to synthesize. To date, all Gram-negative bacteria have been shown to produce OMV demonstrating packaging of a variety of cargo that includes small molecules, peptides, proteins and genetic material. Based on their diverse cargo, OMV are implicated in many biological processes ranging from cell-cell communication to gene transfer and delivery of virulence factors depending upon which bacteria are producing the OMV. Only recently have bacterial OMV become accessible for use across a wide range of applications through the development of techniques to control and direct packaging of recombinant proteins into OMV. This protocol describes a method for the production, purification, and use of enzyme packaged OMV providing for improved overall production of recombinant enzyme, increased vesiculation, and enhanced enzyme stability. Successful utilization of this protocol will result in the creation of a bacterial strain that simultaneously produces a recombinant protein and directs it for OMV encapsulation through creating a synthetic linkage between the recombinant protein and an outer membrane anchor protein. This protocol also details methods for isolating OMV from bacterial cultures as well as proper handling techniques and things to consider when adapting this protocol for use for other unique applications such as: pharmaceutical drug delivery, medical diagnostics, and environmental remediation.

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Dirigido Embalagem Proteína da Membrana Externa no interior de vesículas<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Concepção, produção e purificação

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Bioquímica

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many of these conditions cause protein unfolding in the cell and have detrimental impact on the survival of the organism. A group of unrelated, stress-specific molecular chaperones have been shown to play essential roles in the survival of these stress conditions. While fully folded and chaperone-inactive before stress, these proteins rapidly unfold and become chaperone-active under specific stress conditions. Once activated, these conditionally disordered chaperones bind to a large number of different aggregation-prone proteins, prevent their aggregation and either directly or indirectly facilitate protein refolding upon return to non-stress conditions. The primary approach for gaining a more detailed understanding about the mechanism of their activation and client recognition involves the purification and subsequent characterization of these proteins using in vitro chaperone assays. Follow-up in vivo stress assays are absolutely essential to independently confirm the obtained in vitro results.
This protocol describes in vitro and in vivo methods to characterize the chaperone activity of E. coli HdeB, an acid-activated chaperone. Light scattering measurements were used as a convenient read-out for HdeB&#39;s capacity to prevent acid-induced aggregation of an established model client protein, MDH, in vitro. Analytical ultracentrifugation experiments were applied to reveal complex formation between HdeB and its client protein LDH, to shed light into the fate of client proteins upon their return to non-stress conditions. Enzymatic activity assays of the client proteins were conducted to monitor the effects of HdeB on pH-induced client inactivation and reactivation. Finally, survival studies were used to monitor the influence of HdeB&#39;s chaperone function in vivo.

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

This study describes biophysical, biochemical and molecular techniques to characterize the chaperone activity of Escherichia coli HdeB under acidic pH conditions. These methods have been successfully applied for other acid-protective chaperones such as HdeA and can be modified to work for other chaperones and stress conditions.

Detecção da actividade de dependente do pH<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; e<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is synthesized in response to multiple cellular and environmental factors. Melanin protects skin cells from ultraviolet damage, but also has biophysical and biochemical functions. Excessive production or accumulation of melanin in melanocytes can cause dermatological problems, such as freckles, dark spots, melasma, and moles. Therefore, the control of melanogenesis with hypopigmentation agents is important in individuals with clinical or cosmetic needs. Melanin is primarily synthesized in the melanosomes of melanocytes in a complex biochemical process called melanogenesis, which is influenced by extrinsic and intrinsic factors, such as hormones, inflammation, age, and ultraviolet light exposure. We describe three methods to determine the hypopigmentation activity of chemicals or natural substances in melanocytes: measurement of the 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) staining and quantifying cellular melanin with image analysis.
In melanogenesis, tyrosinase catalyzes the rate-limiting step that converts L-tyrosine into 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) and then into dopaquinone. Therefore, the inhibition of tyrosinase is a primary hypopigmentation mechanism. In cultured melanocytes, tyrosinase activity can be quantified by adding L-DOPA as a substrate and measuring dopaquinone production by spectrophotometry. Melanogenesis can also be measured by quantifying the melanin content. The melanin-containing cellular fraction is extracted with NaOH and melanin is quantified spectrophotometrically. Finally, the melanin content can be quantified by image analysis following Fontana-Masson staining of melanin. Although the results of these in vitro assays may not always be reproduced in human skin, these methods are widely used in melanogenesis research, especially as the initial step to identify potential hypopigmentation activity. These methods can also be used to assess melanocyte activity, growth, and differentiation. Consistent results with the three different methods ensure the validity of the effects.

We describe three experimental methods for evaluating the hypopigmentation activity of chemicals in vitro: quantification of 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) measurement of melanin by cellular melanin staining and image analysis.

Quantificação de hipopigmentação atividade In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts of recombinant RNAs are limited. Here, we describe a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli based on co-expression of a chimeric molecule that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. Viroids are relatively small, non-coding, highly base-paired circular RNAs that are infectious to higher plants. The host plant tRNA ligase is an enzyme recruited by viroids that belong to the family Avsunviroidae, such as Eggplant latent viroid (ELVd), to mediate RNA circularization during viroid replication. Although ELVd does not replicate in E. coli, an ELVd precursor is efficiently transcribed by the E. coli RNA polymerase and processed by the embedded hammerhead ribozymes in bacterial cells, and the resulting monomers are circularized by the co-expressed tRNA ligase reaching a remarkable concentration. The insertion of an RNA of interest into the ELVd scaffold enables the production of tens of milligrams of the recombinant RNA per liter of bacterial culture in regular laboratory conditions. A main fraction of the RNA product is circular, a feature that facilitates the purification of the recombinant RNA to virtual homogeneity. In this protocol, a complementary DNA (cDNA) corresponding to the RNA of interest is inserted in a particular position of the ELVd cDNA in an expression plasmid that is used, along the plasmid to co-express eggplant tRNA ligase, to transform E. coli. Co-expression of both molecules under the control of strong constitutive promoters leads to production of large amounts of the recombinant RNA. The recombinant RNA can be extracted from the bacterial cells and separated from the bulk of bacterial RNAs taking advantage of its circularity.

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Here, we present a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli by co-expressing a chimeric RNA that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. The main product is a circular molecule that facilitates purification to homogeneity.

Produção em grande escala de RNAs recombinantes em um andaime Circular usando um sistema derivado de Viroid em Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic acid (sRNA) molecules and target messenger RNAs (mRNAs). In addition, site-directed mutagenesis is used to map specific protein binding sites to RNA. A 2-step and 3-step PCR based introduction of mutations is described. The approach is relevant to all protein-RNA and RNA-RNA interaction studies. In short, the technique relies on designing primers with the desired mutation(s), and through 2 or 3 steps of PCR synthesizing a PCR product with the mutation. The PCR product is then used for cloning. Here, we describe how to perform site-directed mutagenesis with both the 2- and 3-step approach to introduce mutations to the sRNA, McaS, and the mRNA, csgD, to investigate RNA-RNA and RNA-protein interactions. We apply this technique to investigate RNA interactions; however, the technique is applicable to all mutagenesis studies (e.g., DNA-protein interactions, amino-acid substitution/deletion/addition). It is possible to introduce any kind of mutation except for non-natural bases but the technique is only applicable if a PCR product can be used for downstream application (e.g., cloning and template for further PCR).

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in deoxyribonucleic acid (DNA). This protocol describes how to do site-directed mutagenesis with a 2-step and 3-step polymerase chain reaction (PCR) based approach, which is applicable to any DNA fragment of interest.

Mutagenesis local-dirigido para In Vitro e In Vivo experimentos exemplificados com interações de RNA em Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an upstream 3&#39; splice site within a pre-mRNA, a process called back-splicing. This circularization is likely aided by secondary structures in the pre-mRNA that bring the splice sites into close proximity. In human genes, Alu elements are thought to promote these secondary RNA structures, as Alu elements are abundant and exhibit base complementarities with each other when present in opposite directions in the pre-mRNA. Here, we describe the generation and analysis of large, Alu element containing reporter genes that form circular RNAs. Through optimization of cloning protocols, reporter genes with up to 20 kb insert length can be generated. Their analysis in co-transfection experiments allows the identification of regulatory factors. Thus, this method can identify RNA sequences and cellular components involved in circular RNA formation.

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

We clone and analyze reporter genes generating circular RNAs. These reporter genes are larger than constructs to analyze linear splicing and contain Alu elements. To investigate the circular RNAs, the constructs are transfected into cells and resulting RNA is analyzed using RT-PCR after removal of linear RNA.

Uso do elemento Alu contendo Minigenes para analisar RNAs circulares

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). Endocannabinoids are conserved lipid mediators that regulate multiple biological processes in a variety of organisms. In C. elegans, 2-AG has been found to possess different roles, including modulation of dauer formation and cholesterol metabolism. This report describes a method to overcome the difficulties associated with the costs and stability of deuterated standards required for 2-AG quantification. The procedure for the synthesis of the standard is simple and can be performed in any laboratory, without the need for organic synthesis expertise or special equipment. In addition, a modification of Folch&#39;s method to extract the deuterated standard from C. elegans culture is described. Finally, a quantitative and analytic method to detect 2-AG using the stable isotopically labeled analog 1-AG-d5 is described, which provides reliable results in a fast-chromatographic run. The procedure is useful for studying the multiple roles of 2-AG in C. elegans while also being applicable to other studies of metabolites in different organisms.

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

This work describes a robust and straightforward method to detect and quantify the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol (2-AG) in C. elegans. An analytical deuterated standard us prepared and used for the quantification of 2-AG by isotopic dilution and liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS).

Síntese de um padrão Deuterated para a quantificação de 2-Arachidonoylglycerol em elegans do Caenorhabditis

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

Caracterização de transportadores de membrana por expressão heterologous em E. coli e produção de vesículas de membrana

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic interactions among multiple proteins in a protein interaction network is technically difficult. Here, we present a protocol for Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI), which allows quantitative assessment of fold changes in protein interactions based on relative fluorescence measurements of Proteins in Shared Complexes detected by Exposed Surface epitopes (PiSCES). In QMI, protein complexes from cell lysates are immunoprecipitated onto microspheres, and then probed with a labeled antibody for a different protein in order to quantify the abundance of PiSCES. Immunoprecipitation antibodies are conjugated to different MagBead spectral regions, which allows a flow cytometer to differentiate multiple parallel immunoprecipitations and simultaneously quantify the amount of probe antibody associated with each. QMI does not require genetic tagging and can be performed using minimal biomaterial compared to other immunoprecipitation methods. QMI can be adapted for any defined group of interacting proteins, and has thus far been used to characterize signaling networks in T cells and neuronal glutamate synapses. Results have led to new hypothesis generation with potential diagnostic and therapeutic applications. This protocol includes instructions to perform QMI, from the initial antibody panel selection through to running assays and analyzing data. The initial assembly of a QMI assay involves screening antibodies to generate a panel, and empirically determining an appropriate lysis buffer. The subsequent reagent preparation includes covalently coupling immunoprecipitation antibodies to MagBeads, and biotinylating probe antibodies so they can be labeled by a streptavidin-conjugated fluorophore. To run the assay, lysate is mixed with MagBeads overnight, and then beads are divided and incubated with different probe antibodies, and then a fluorophore label, and read by flow cytometry. Two statistical tests are performed to identify PiSCES that differ significantly between experimental conditions, and results are visualized using heatmaps or node-edge diagrams.

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) uses flow cytometry for sensitive detection of differences in the abundance of targeted protein-protein interactions between two samples. QMI can be performed using a small amount of biomaterial, does not require genetically engineered tags, and can be adapted for any previously defined protein interaction network.

Quantificação da dinâmica da rede de interação de proteínas usando co-imunoprecipitação multiplexada

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. Measurement of cellular CoA is a challenge due to its relatively low abundance and the dynamic conversion of free CoA to CoA thioesters that, in turn, participate in numerous metabolic reactions. A method is described that navigates through potential pitfalls during sample preparation to yield an assay with a broad linear range of detection that is suitable for use in many biomedical laboratories.

This method describes sample preparation from cultured cells and animal tissues, extraction and derivatization of coenzyme A in the samples, followed by high pressure liquid chromatography for purification and quantification of the derivatized coenzyme A by absorbance or fluorescence detection.

Quantificação da coenzima A em células e tecidos

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

Quantificação de abundância e carregamento níveis de RNAs de transferência em Escherichia coli

Resumo

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Dirigido Embalagem Proteína da Membrana Externa no interior de vesículas

Detecção da actividade de dependente do pH