A técnica de perfil ribossomo, também chamada RIBO-seq, é atualmente a ferramenta mais eficaz para estudar o processo de síntese proteica in vivo. A vantagem deste método é sua capacidade de monitorar a tradução mapeando precisamente a posição e o número de ribossomos. RIBO-seq baseia-se no fato de que o ribossomo, ao ligar-se à molécula de mRNA, protege o fragmento enterrado da transcrição após a digestão da ribonuclease.
Os fragmentos obtidos, chamados pegadas ribossômicas, podem ser sequenciados e mapeados na transcrição de onde se originaram, resultando na determinação da posição exata dos ribossomos. Simultaneamente ao sequenciamento de mRNA total de rendimento ribo-seq é realizado para fornecer um ponto de referência e permitir a comparação de dados tanto de RIBO-seq quanto RNA-seq durante a análise de dados. Antes da colheita das células, você pode adicionar cloreto de memória à cultura bacteriana, à concentração final de 100 microgramas por mililitro, para inibir a tradução.
Incubar a cultura com o antibiótico por um minuto. Este passo é importante se a colheita demorar mais do que o habitual, pois a inibição da tradução permite estender o tempo de coleta da amostra. Colete as amostras com um sistema de filtragem pré-aquecido.
Você pode introduzir agitação a fim de imitar as condições de crescimento. Pare de filtrar quando todas as mídias passarem pela membrana, mas não deixe o filtro secar completamente. Colete pelotas bacterianas raspando rapidamente as células do disco do filtro usando uma scoopula pré-aquecida e desinfetada.
Coloque imediatamente toda a scoopula com as células colhidas em tubo de 50 mililitros cheio de nitrogênio líquido. A pelota colhida deve ser completamente coberta de nitrogênio líquido. Deixe a pelota congelar completamente, e desaloja as células congeladas usando uma scoopula previamente resfriada.
Feche a tampa e certifique-se de que está perfurada. Isso é importante, pois o nitrogênio líquido pode causar a explosão de recipientes fechados devido à mudança de pressão sobre a evaporação. Prepare GMPP, cotonete de DNA e tubos Eppendorf frescos dedicados à lise.
Prepare o tampão de lise com a adição de clorofífenicol, se necessário. Aloque 500 microlitadores de tampão de lise por amostra em tubos Eppendorf separados e coloque-os no gelo. Descontaminar argamassa e pilão com desinfetante laboratorial e 70% etanol.
Argamassa fria e pilão despejando nitrogênio líquido na argamassa. Transfira a pelota bacteriana congelada em uma argamassa pré-refrigerada e moa-a em pó. Adicione aproximadamente um volume de óxido de alumínio e continue moendo.
Mantenha argamassa, pilão e as células esfriam derramando nitrogênio líquido quando necessário, para não deixar o conteúdo da argamassa descongelar. Pouco antes de usar, adicione o cotonete GMPPNP e o DNA na alíquota do tampão de lise. Transfira a solução para a argamassa e continue moendo.
Deixe o degelo de lise lentamente enquanto moe. Quando a lise descongelar completamente, transfira a mistura para o tubo Eppendorf pré-refrigerado e retorne ao gelo. Centrifuge lysase a 20.0000 G por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Transfira supernantes em tubos Eppendorf frescos e pré-refrigerados e coloque-os no gelo. Meça a concentração de RNA em cada amostra diluída com NanoDrop. Divida cada lise em duas porções, 0,5 a 1 miligrama de RNA para RIBO-seq, e o resto para RNA-seq.
A um miligrama do RNA, adicione 3,8 microliters de MNase em Tris pH 8, e cubra-o com tampão de lise ao volume total de 500 microliters. Incubar a 25 graus Celsius, 300 balas por minuto, durante 45 minutos. Quando a incubação estiver concluída, limpe as amostras com um kit de limpeza de RNA disponível comercialmente.
Prepare 15% de gel TBE de poliacrilamida com oito ureia molar, e coloque-o em um tanque com tampão TBE. Pré-executar por um mínimo de 10 minutos em uma tensão constante de 200 volts. Misture as amostras com o tampão de amostra TBE-Urea.
Denture a 95 graus Celsius por um minuto e colocá-los imediatamente no gelo. Lave a ureia injetando tampão TBE em poços de gel usando uma seringa. Carregue as amostras, deixando um bom espaço entre elas para separar cada amostra e evitar contaminação cruzada.
Use 29 oligo de nucleotídeos de comprimento, e uma mistura de oligos de 26 e 32 nucleotídeos como marcadores. Execute a eletroforese a uma tensão constante de 180 volts. Prepare o tampão estéril para a incubação durante a noite.
Uma vez que a eletroforese esteja terminada, manche o gel com SYBR Gold. Fragmentos de imposto de consumo do gel entre 26 e 32 nucleotídeos com uma agulha estéril ou uma lâmina de barbear, e coloquem os fragmentos de gel em tubos separados de Eppendorf. Troque a agulha ou a lâmina entre as amostras.
Adicione 200 microliters de tampão de incubação durante a noite a cada Eppendorf e incubar as amostras a 10 graus Celsius, 1000 rodadas por minuto, durante a noite. No dia seguinte, limpe as amostras com o kit de limpeza de RNA, e elute-as em 18 microliters de água sem nuclease. As pegadas ribossômicas obtidas estão prontas para a preparação da biblioteca.
Realize o esgotamento do RNA ribossômico para amostras de RNA-seq usando um kit comercialmente disponível. Em seguida, limpe as amostras com o kit de limpeza do RNA. Realize a hidrólise alcalina da seguinte forma; prepare o tampão de hidrólise alcalina, adicione um volume do buffer a um volume da amostra e incubar a 95 graus Celsius por 25 minutos.
Adicione cinco microliters de 3 acetato de sódio molar pH 5.5 a cada amostra, a fim de parar a reação. Limpe as amostras com kit de limpeza de RNA e estoque-as em 18 microliters de água sem nuclease. O RNA fragmentado aleatoriamente obtido está pronto para a preparação da biblioteca.
Adicione 10 microliters de tampão de reação de 10x e cinco microliters de t4 polinucleotídeo quinase a cada amostra. Incubar a 37 graus Celsius por uma hora e meia. Após este tempo, adicione três microliters de um ATP mililitro e incubar a 37 graus Celsius por uma hora.
Em seguida, limpe as amostras com o kit de limpeza do RNA. Realize a preparação da biblioteca usando o kit comercialmente disponível, de acordo com o protocolo aqui fornecido. Execute PAGE usando gel de poliacrilamida de 6%.
Manche o gel com SYBR Gold. Fragmentos de gel de impostos contendo as bibliotecas. Para amostras de RNA-seq, a biblioteca tem entre 135 e 180 nucleotídeos, e para RIBO-seq, entre 135 e 170 nucleotídeos.
Use agulhas estéreis ou lâminas de barbear e coloque os fragmentos de gel excisados em tubos Eppendorf separados. Lembre-se de trocar a agulha ou a lâmina entre as amostras. Adicione 100 microliters de água sem nuclease a cada fragmento de gel excisado.
E incuba-los a 10 graus Celsius, 450 balas por minuto, durante a noite. No dia seguinte, limpe as amostras com kit de limpeza de DNA. As bibliotecas obtidas estão prontas para controle de qualidade e quantidade com alta sensibilidade, eletroforese de DNA no chip e, em seguida, para sequenciamento de próxima geração.
As bibliotecas cDNA resultantes apresentam uma quantidade e qualidade adequadas para o sequenciamento de próxima geração, conforme verificado pela alta sensibilidade, eletroforese de DNA no chip. As bandas e picos que representam as bibliotecas RIBO-seq são mais estreitos e melhor definidos, em comparação com isso representando as bibliotecas RNA-seq. De acordo com a eletroforese no chip, as bibliotecas têm a lente esperada.
Os picos adicionais mais próximos de 200 pares de base presentes nas bibliotecas RIBO-seq podem indicar ribossomos hibernando, pegadas ribossômicas completamente digeridas, ou artefatos, por exemplo, rRNA, e podem ser descartados durante a análise bioinformática quando os dados obtidos a partir do sequenciamento são aparados e o tRNA rRNA é filtrado. A quantidade média de cDNA gerada na preparação da biblioteca é de 32 nanogramas, fornecendo quantidade suficiente de material necessária para o sequenciamento de próxima geração. Após o controle de qualidade por eletroforese on-chip, as bibliotecas foram puxadas para sequenciamento de pares de base simples e 50 na plataforma NextSeq 500 de uma Illumina.
A aparação dos adaptadores e sequências de baixa qualidade resultou em 25 a 47 milhões de leituras por amostra para amostras de RNA-seq, e de 25 a 50 milhões de leituras por amostra para amostras de RIBO seq. Os dados obtidos foram verificados com o FastQC. Ambas as amostras de RNA-seq e RIBO-seq apresentaram uma qualidade muito boa.
O mapeamento das bibliotecas preparadas de acordo com o protocolo descrito rendeu de 2,4 a 9,6 milhões de leituras exclusivamente mapeadas por amostra para amostras de RNA-seq, e de 2,3 a 10,4 milhões de leituras exclusivamente mapeadas para amostras de RIBO-seq. Os dados ribo-seq exibem periodicidade triplicada e um pico alto e estreito, correspondente aos ribossomos iniciados e característicos das pegadas ribossômicas, o que não é observado nos dados do RNA-seq. Além disso, o enredo que mostra os perfis de cobertura média de pegadas ribossômicas e fragmentos de mRNA nas sequências de codificação revela a maior proporção de leituras mapeadas para os CDS no conjunto de dados RIBO-seq, como esperado.
A visualização das pegadas ribossômicas mapeadas mostrou padrões muito semelhantes em comparação com os resultados obtidos a partir do mesmo experimento realizado em conformidade com o procedimento ribo-seq padrão, que inclui recuperação monossóica por ultracentrifugação de gradiente de sacarose. Nosso protocolo tem sido usado para investigar a regulação da tradução em várias condições de crescimento, mas pode ser aplicado para estudar outros aspectos da tradução, como a detecção de sites de iniciação de tradução e novos genes de codificação de proteínas. O sequenciamento das bibliotecas preparadas de acordo com nossas diretrizes resulta em dados suficientes para análise bioinformática abrangente.
O protocolo que apresentamos aqui é rápido, fácil e econômico, e pode ser realizado com equipamentos de laboratório padrão.
