Name: measuring the effect of chemicals on the growth and reproduction of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2017-10-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
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Este estudo foi suportado pela bolsa de investigação intramural Instituto de Coreia da ciência e tecnologia (2E27513) e o elevado valor acrescentado alimentos tecnologia desenvolvimento programa (IPET) financiado pelo Ministério de agricultura, alimentação e Assuntos rurais (315067-03).

Nota: todo o experimento deve ser realizado em um laboratório isolado limpo a 20 ° C, com a poeira baixa e com a minimização da contaminação durante o worm e manipulação bacteriana. Para essa finalidade, devem ser realizados experimentos sob a chama de uma lâmpada de álcool ou usando uma bancada limpa.
 1. manutenção de c. elegans e ovo de preparação para o teste químico <ol><li>manutenção c. elegans N2 (var. Bristol) sobre uma placa de ágar NGM alimentada com live Escherichia coli OP50 a 20 ° C 12 , 13.</li>
	<li>Preparar ovos de idade-sincronizado usando um alvejante solução tratamento 5 ou o tempo de ovo postura método 6 , 14 , 15. 
	Nota: antes de preparação do ovo, casaco placa contendo etoposido NGM com calor-inativado Escherichia coli OP50 conforme descrito abaixo. Inactivados por calor E coli OP50 é usado para minimizar a atividade metabólica de Escherichia coli 6 , 16.</li>
</ol> 2. Preparação de calor-inativado Escherichia coli OP50 feed C. elegans durante o ensaio de toxicidade <ol><li>preparar 500 mL de meio de duplo levedura triptona (DYT) conforme descrito na tabela 1 e inocular uma única colônia de Escherichia coli OP50 cultivadas na um ágar Luria-Bertani (LB) placa 5.</li>
	<li>Incubar a Escherichia coli OP50 numa incubadora tremendo para 14 h a 37 ° C e 150 rpm.</li>
	<li>Após a centrifugação por 30 min no 3.220 x g e 20 ° C, retire todo o sobrenadante médio DYT e adicionar uma pré-mistura de 25 mL de tampão-S e 250 µ l de 1m MgSO 4 25 µ l de colesterol de 5 mg/mL (dissolvido em etanol). Todas essas soluções são estéreis.</li>
	<li>Ressuspender as bactérias e transfira para um tubo de plástico descartável de 50 mL.</li>
	<li>Para a calor-inactivação, incubar a ressuspensão OP50 de Escherichia coli em banho-maria por 30 min no 65 ° C.</li>
	<li>Esfriar até a temperatura ambiente e loja a 4 ° C até o uso. Isso pode ser armazenado por até um mês.</li>
</ol> 3. Preparação de NGM placas contendo ou 1% DMSO ou 750 µM Etoposide <ol><li>Prepare duas garrafas de vidro de 200ml limpa. Adicione 0,6 g de NaCl, 0,5 g de peptona, 3,4 g de ágar-ágar, 195 mL de água destilada e um agitador magnético para uma garrafa. Adicionar um agitador magnético para a outra garrafa vazia.</li>
	<li>Garrafas de autoclave estes dois por 15 min a 121 ° C e em seguida esfriar os frascos em banho-maria por 30 min a 55 ° C.</li>
	<li>Adicionar 0,2 mL de 1 M CaCl 2, 0,2 mL de colesterol de 5 mg/mL, 0,2 mL de 1 M MgSO 4 e 5 mL de 1 M KPO 4 (todas essas soluções são estéreis) e em seguida, misturá-los por agitação magnética, um prato quente em 55 ° C.</li>
	<li>Dividir o meio NGM misto em duas garrafas com o mesmo volume (100 mL cada uma). Em seguida, adicionar 1 mL de DMSO para uma garrafa, misture-o novamente usando a agitação magnética. Armazene o outro frasco num banho de água a 55 ° C até o próximo passo. Alíquota 3 mL do meio a cada 35 x 10 mm 2 placa de Petri contendo DMSO. Aproximadamente 33 placas contendo DMSO NGM podem ser feitas desta etapa.</li>
	<li>Misturar o outro frasco usando a agitação magnética, adicionar 1 mL de 75mm etoposide (estoque dissolvido em DMSO), misturar novamente e repita o procedimento de alíquota (passo 3.4). Aproximadamente 33 etoposide (750 µM)-com NGM chapas pode ser feita desta etapa. 
	Nota: No correlata anterior papel 6, nós testamos 0, 250, 500 e 1.000 µM de etoposide. Com base nos dados do, escolhemos a 750 µM de etoposide dose neste trabalho.</li>
	<li>Cool para baixo as placas NGM que contenham produtos químicos à temperatura ambiente por deixá-los em temperatura ambiente por cerca de 3 h e armazená-los em 4 ° C até o uso. 
	Nota: No caso de produtos químicos sensíveis à luz, bloqueie a luz para minimizar a decomposição induzida por luz. 
	Nota: Opcionalmente, fazer uma placa NGM normal sem produtos químicos para o ensaio, que pode ser realizado usando duas condições diferentes de tratamento químico, conforme descrito abaixo de postura de ovos.</li>
	<li>Adicione 100 µ l de calor-inativada Escherichia coli OP50 (como descrito na seção 2) e espalhe sobre cada placa NGM. Deixe secar durante a noite em uma incubadora de c. elegans, a 20 ° C para o teste de química</li>
</ol> 4. Medição do crescimento de c. elegans <ol><li>transferência a idade-sincronizado c. elegans ovos à placa NGM suplementada com 1% DMSO ou 750 µM etoposide.</li>
	<li>Incubar c. elegans em uma incubadora a 20 ° C por 4 dias. Observem os vermes, usando um microscópio estéreo e tomar imagens microscópicas todos os dias. Geralmente, ampliação de 20 X (1 X objectiva, ampliação de zoom X 2 e 10 X ocular lente) é apropriado para a observação do crescimento de c. elegans. Também levar uma imagem microscópica de micrômetro de palco o microscópio para a calibração de tamanho worm. 
	Nota: A fome afeta o ensaio de toxicidade. Portanto, alimentar com bactérias suficientes ou ajustar o transferidos c. elegans números no início de ovo. Observar até 3 dias para excluir a possibilidade de fome.</li>
	<li>Medir o comprimento de corpo de c. elegans, tratados com DMSO ou etoposide em cada ponto de tempo usando software ImageJ. 
	Nota: Para cada medição de amostra, 50 vermes são suficientes para a análise estatística.
	<ol><li>No ImageJ, abra a imagem de micrômetro de palco de microscópio (&#39; arquivo &#39; &#8594; &#39; abrir &#39;). 
		Nota: A imagem de micrômetro e imagens de worm (etapa 4.2) devem ser a mesma ampliação.</li>
		<li>Arrastar uma linha de 1.000 µm na imagem de calibração de micrômetro usando &#39; linha reta &#39; ferramenta.</li>
		<li>Clique &#39; Analyze &#39; &#8594; &#39; definir escala de &#39; e entrada de 1.000 e µm para a &#39; conhecida a distância &#39; caixa e &#39; unidade de comprimento &#39; caixa, respectivamente. Verificar &#39; Global &#39; e clique em &#39; Okey &#39;.</li>
		<li>Abrir as imagens de worm (&#39; arquivo &#39; &#8594; &#39; Open &#39;). Desenhar uma linha ao longo da característica de cada worm usando &#39; Freehand linha &#39; ferramenta. Obter os dados de comprimento de corpo clicando &#39; Analyze &#39; &#8594; &#39; medida &#39;.</li>
		<li>Repita essas etapas para 50 vermes.</li>
	</ol></li></ol> 5. C. elegans ovo deitado ensaio <ol><li>incubar a idade-sincronizado ovos sobre a NGM placa contendo DMSO ou etoposide para 64 h (antes do nascimento de primeiro) até a fase adulta jovem em 20 ° C. 
	Nota: É opcional usar os vermes das experiências de medição de crescimento. É conveniente fazer a medição de crescimento e postura ensaio de ovo juntos.</li>
	Placas de <li>transferir 5 vermes adultos para a nova NGM sem produtos químicos (condição 1, tratamento químico dentro de um determinado período de tempo, de ovos para fase adulta jovem) ou nova placa NGM, contendo o mesmo pré-tratamento químico (condição 2, a exposição contínua de produtos químicos durante o período experimental em geral) e então eles incubar por 24 h. 
	Nota: É aconselhável fazer réplicas usando placas NGM de 3-5 para cada tratamento; Estas repetições podem ser usadas para análise estatística.</li>
	<li>Transferir para a nova chapa NGM como descrito acima e contar o número de ovos todos os dias. Contar os vermes que rastejou fora, morreram e foram internamente escotilhaEd.</li>
	<li>Repita estes passos até os vermes ovos sem mais, geralmente em 5 dias.</li>
	<li>Calcular o número de ovos postos por worm de cada prato e somar esses valores todos os dias durante 5 dias determinar o número total de ovos postos. 
	Nota: Excluir o número de minhocas que rastejou fora e internamente eclodiram no cálculo de.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Blomme, E. A., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicology+strategies+for+drug+discovery:+present+and+future.">Toxicology strategies for drug discovery: present and future.</a> Chem. Res. Toxicol. 29 (4), 473-504 (2016).</li><li>Lilienblum, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+methods+to+safety+studies+in+experimental+animals:+role+in+the+risk+assessment+of+chemicals+under+the+new+European+Chemicals+Legislation+(REACH).">Alternative methods to safety studies in experimental animals: role in the risk assessment of chemicals under the new European Chemicals Legislation (REACH).</a> Arch. Toxicol. 82 (4), 211-236 (2008).</li><li>Honnen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+powerful+alternative+model+organism+to+promote+research+in+genetic+toxicology+and+biomedicine.">Caenorhabditis elegans as a powerful alternative model organism to promote research in genetic toxicology and biomedicine.</a> Arch. Toxicol. , (2017).</li><li>Hunt, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+model+in+toxicity+testing.">The C. elegans model in toxicity testing.</a> J. Appl. Toxicol. 37 (1), 50-59 (2017).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).</li><li>Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+evaluation+of+the+topoisomerase+inhibitor,+etoposide,+in+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans+and+3T3-L1+normal+murine+cells.">Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells.</a> Environ. Toxicol. 32 (6), 1836-1843 (2017).</li><li>Imanikia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+the+comet+assay+to+assess+the+genotoxicity+of+environmental+pollutants+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The application of the comet assay to assess the genotoxicity of environmental pollutants in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Environ. Toxicol. Pharmacol. 45, 356-361 (2016).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfluorooctane+sulfonate+exposure+causes+gonadal+developmental+toxicity+in+Caenorhabditis+elegans+through+ROS-induced+DNA+damage.">Perfluorooctane sulfonate exposure causes gonadal developmental toxicity in Caenorhabditis elegans through ROS-induced DNA damage.</a> Chemosphere. 155, 115-126 (2016).</li><li>Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+screening+platform+for+the+rapid+assessment+of+chemical+disruption+of+germline+function.">A C. elegans screening platform for the rapid assessment of chemical disruption of germline function.</a> Environ. Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).</li><li>Singh, S., Sharma, B., Kanwar, S. S., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lead+phytochemicals+for+anticancer+drug+development.">Lead phytochemicals for anticancer drug development.</a> Front. Plant Sci. 7, 1667 (2016).</li><li>Kang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+topoisomerase+inhibitor,+daurinol,+suppresses+growth+of+HCT116+cells+with+low+hematological+toxicity+compared+to+etoposide.">A novel topoisomerase inhibitor, daurinol, suppresses growth of HCT116 cells with low hematological toxicity compared to etoposide.</a> Neoplasia. 13 (11), 1043-1057 (2011).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293 (2011).</li><li>Zarse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+insulin/IGF1+signaling+extends+life+span+by+promoting+mitochondrial+L-proline+catabolism+to+induce+a+transient+ROS+signal.">Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal.</a> Cell Metab. 15 (4), 451-465 (2012).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> J. Vis. Exp. (27), e1152 (2009).</li><li>Weimer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D-Glucosamine+supplementation+extends+life+span+of+nematodes+and+of+ageing+mice.">D-Glucosamine supplementation extends life span of nematodes and of ageing mice.</a> Nat. Commun. 5, 3563 (2014).</li><li>Schmeisser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+ROS+signaling+rather+than+AMPK/sirtuin-mediated+energy+sensing+links+dietary+restriction+to+lifespan+extension.">Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension.</a> Mol. Metab. 2 (2), 92-102 (2013).</li><li>Parodi, D. A., Damoiseaux, R., Allard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+assessment+of+germline+chemical+toxicity+using+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J. Vis. Exp. (96), e52445 (2015).</li><li>Hahm, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+maximum+velocity+correlates+with+healthspan+and+is+maintained+in+worms+with+an+insulin+receptor+mutation.">C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation.</a> Nat. Commun. 6, 8919 (2015).</li><li>Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+spreading+and+toxicity+of+prion-like+proteins+using+the+metazoan+model+organism+C.+elegans.">Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (95), e52321 (2015).</li><li>Schmidt, B. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+acute+and+developmental+neurotoxicity+screening:+an+overview+of+cellular+platforms+and+high-throughput+technical+possibilities.">In vitro acute and developmental neurotoxicity screening: an overview of cellular platforms and high-throughput technical possibilities.</a> Arch. Toxicol. 91 (1), 1-33 (2017).</li><li>Fey, S. J., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+drug+toxicity+using+3D+spheroids+constructed+from+an+immortal+human+hepatocyte+cell+line.">Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell line.</a> Toxicol. Sci. 127 (2), 403-411 (2012).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste artigo, descrevemos a avaliação da toxicidade de produtos químicos em c. elegans, um nematódeo de solo, usando etoposide como um exemplo tóxica. Para este fim, usamos duas condições experimentais. No primeiro set, c. elegans foram cultivadas na etoposide contendo placas de ovos para a fase de adulta jovem, e então os vermes foram autorizados a colocar ovos em placas NGM normais sem produtos químicos. No segundo conjunto experimental, c. elegans continuamente foram tratados com et...

Avaliação toxicológica é essencial para o desenvolvimento de produtos farmacêuticos, nutracêuticos e cosmecêuticos, bem como a avaliação de risco de várias toxinas ambientais. O modelo de roedor é um dos mais populares na vivo sistemas experimentais para o estudo de toxicologia; Alternativamente, organismos não-mamíferos, tais como c. elegans são também amplamente utilizados. Modelos de avaliação toxicológica mamiferas são benéficos devido não só animais questões éticas, mas também sua conveniência e utilidade, considerando a relação custo-eficácia, facilidade de manutenção, velocidade e reprodutibilidade1,2 ,3,4.
C. elegans, um solo redonda worm, tem sido explorada como um animal modelo em várias pesquisas básicas e aplicadas biologia e química. É um 1 mm de comprimento, o nematódeo transparente, que é simplesmente mantido em sólido ou líquido nematódeo crescimento Media (NGM) alimentados com a estirpe bacteriana Escherichia coli OP50. C. elegans tem um ciclo de vida curto, e o selvagem-tipo N2 c. elegans põe aproximadamente 300 ovos. Portanto, ela é facilmente propagada para serem utilizados como materiais experimentais3,4,5. C. elegans também tem sido amplamente utilizada nos estudos toxicológicos de muitas drogas e poluentes ambientais6,7,8,9.
Porque muitas drogas anticâncer alvo rapidamente dividindo as células cancerosas, podem também danificar dividindo rapidamente as células normais como as células do folículo piloso, epitélio intestinal e medula óssea. Por exemplo, drogas anticâncer inibidores de topoisomerase alvo o processo de replicação do DNA de células cancerosas; Portanto, eles também inibem dividindo rapidamente as células normais. Todos os organismos vivos tem topoisomerases e estes topoisomerase inibidores mais provável impacto ambiental de ecossistemas6,10,11. Assim, uma plataforma de avaliação toxicológica de drogas usando um animal modelo é valiosa para tanto no desenvolvimento de fármacos e avaliação dos riscos ambientais.
Neste artigo, descrevemos os protocolos detalhados para testar a toxicidade de etoposide, que é um agente anticâncer clínico que alvos topoisomerase II, como um produto químico tóxico de modelo em c. elegans. Para este fim, descreveremos o método de medição do tamanho do corpo e o número total de ovos postos em c. elegans , tratados com etoposide.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Affymetrix, USA</td><td>10906</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis elegans&lt;/em&gt; N2</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Wild type</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma, USA</td><td>C3045</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma, USA</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli &lt;/em&gt;OP50</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etoposide</td><td>Sigma, USA</td><td>E1383</td><td></td></tr><tr><td>Image J software (ver 1.4)</td><td>Natinoal Institute of Health, USA</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>Microscope camera</td><td>Jenopitk, Progress Gryphax, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Merck, USA</td><td>107213</td><td></td></tr><tr><td>35 &amp;times; 10 mm Petri dish</td><td>SPL Life Sciences, South Korea</td><td>10035</td><td></td></tr><tr><td>90 &amp;times; 15 mm Petri dish</td><td>SPL Life Sciences, South Korea</td><td>10090</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Nikon, Japan</td><td>SMZ800N</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Becton Dickinson, USA</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring the effect of chemicals on the growth and reproduction of caenorhabditis elegans

Avaliação toxicológica é crucial para entender os efeitos das substâncias químicas sobre organismos vivos nos campos da ciência biológica básica e aplicada. Um solo não-mamíferos redondo verme Caenorhabditis elegans, é um organismo modelo valioso para estudos de toxicologia, devido à sua conveniência e a falta de questões de ética animal, em comparação com sistemas de animais mamíferos. Neste protocolo, é descrito um procedimento detalhado de avaliação toxicológica de substâncias químicas em c. elegans . Uma droga anticancerígena clínica, etoposide, quais destinos humano topoisomerase II e inibe a replicação do DNA de células cancerosas humanas, foi selecionada como um modelo de testes químicos. Idade-sincronizado c. elegans ovos foram expostos a dimetilsulfóxido (DMSO) ou etoposide, e então o crescimento de c. elegans foi monitorado diariamente por 4 dias pela observação de microscópio estéreo. O número total de ovos assente de c. elegans , tratados com DMSO ou etoposide foi também contada usando o microscópio estéreo. Tratamento de Etoposide afetado significativamente o crescimento e a reprodução de c. elegans. Por comparação do número total de ovos de vermes com períodos de tratamento diferentes de produtos químicos, pode decidir-se que a toxicidade reprodutiva de produtos químicos na reprodução de c. elegans é reversível ou irreversível. Estes protocolos podem ser úteis para tanto no desenvolvimento de várias drogas e avaliação de riscos de tóxicos ambientais.

O tratamento de etoposide (24-96 h) retardado significativamente o crescimento de c. elegans. Após 96 horas de incubação, vermes etoposide-tratados cresceram 0,86 mm de comprimento, enquanto os vermes de veículo-tratados cresceram a 1,04 mm (Figura 1). Retardo de crescimento também aparentemente foi observado sob observação microscópio estéreo (Figura 2). Começamos a ver os ovos do veículo-tratados vermes a 72...

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Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Um protocolo básico para avaliar a toxicidade de produtos químicos em um animal modelo, Caenorhabditis elegans, é descrito. O método é conveniente e útil para o desenvolvimento de produtos farmacêuticos, bem como para a avaliação de risco de diversos poluentes ambientais.

Medir o efeito de produtos químicos sobre o crescimento e a reprodução de Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A ...

measuring-effect-chemicals-on-growth-reproduction-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Medicine

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

16.9K visualizações.  Korea Institute of Science and Technology. Um protocolo básico para avaliar a toxicidade de produtos químicos em um animal modelo, Caenorhabditis elegans, é descrito. O método é conveniente e útil para o desenvolvimento de produtos farmacêuticos, bem como para a avaliação de risco de diversos poluentes ambientais.

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Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Avaliação Compreensiva de Germline Chemical Toxicity Usando o Nemátodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Biologia do Desenvolvimento

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Um método simples para High Throughput Screening químico em Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Bioquímica

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

Um ensaio de alta produtividade para a predição da toxicidade química por Automated Caracterização fenotípica de Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

Ambiente

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term effects are very important in judging their consequences in the environment and on human health. In demonstrating long-term influences, effects of chemicals over generations in recent studies provide new insight. Here, we describe protocols for studying effects of chemicals over multiple generations using free-living nematode Caenorhabditis elegans. Two aspects are presented: (1) trans-generational (TG) and (2) multi-generational effect studies, the latter of which is separated to multi-generational exposure (MGE) and multi-generational residual (MGR) effect studies. The TG effect study is robust with a simple purpose to determine whether chemical exposure to parents can result in any residual consequences on offspring. After the effects are measured on parents, sodium hypochlorite solutions are used to kill the parents and keep the offspring so as to facilitate effect measurement on the offspring. The TG effect study is used to determine whether the offspring are affected when their parent is exposed to the pollutants. The MGE and MGR effect study is systematical used to determine whether continuous generational exposure can result in adaptive responses in offspring over generations. Careful pick-up and transfer are used to distinguish generations to facilitate effect measurement on each generation. We also combined protocols to measure locomotion behavior, reproduction, lifespan, biochemical and gene expression changes. Some example experiments are also presented to illustrate the trans- and multi-generational effect studies.

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Trans- and multi-generational effects of persistent chemicals are essential in judging their long-term consequences in the environment and on the human health. We provide novel detailed methods for studying trans- and multi-generational effects using free-living nematode Caenorhabditis elegans.

Usando Caenorhabditis elegans para estudar trans-e multi-Generational efeitos de toxicants

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term ...

Ensaio de alto rendimento para medir a ingestão de alimentos e a expectativa de vida de Caenorhabditis elegans

Quantifying Food Intake in Caenorhabditis elegans by Measuring Bacterial Clearance

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of Caenorhabditis elegans&#160;(C. elegans), an important parameter when studying the genetics of aging or metabolism. In most species, feeding is determined by measuring the difference between the amount of food provided and the amount left after a given time interval. The method presented here uses the same strategy to determine the feeding of C. elegans. It measures the amount of bacteria, the food source of C. elegans, cleared within 72 h. This method uses 96-well microtiter plates and has allowed the screening of hundreds of drugs for their ability to modulate food intake at a speed and depth not possible in other animal models. The strength of this assay is that it allows to measure feeding and lifespan simultaneously and directly measures the disappearance of food and, thus, is based on the same principles used for other organisms, facilitating species-to-species comparison.

Autor em destaque: Explorando a relação entre lipotoxicidade e ICFEP 

This protocol describes an assay to quantify Caenorhabditis elegans feeding rate based on measuring the clearance of bacteria in liquid culture.

Quantificando a ingestão de alimentos em Caenorhabditis elegans medindo a depuração bacteriana

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of ...

Comportamento

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Um ensaio para medir os efeitos do etanol sobre a velocidade de Locomotion<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Neurociência

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

Medição Caenorhabditis elegans Expectativa de Vida em 96 placas de microtitulação Bem

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Biologia

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Medição dos Efeitos de bactérias em<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamento Usando um Retenção Ensaio Egg

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Medir o efeito de produtos químicos sobre o crescimento e a reprodução de Caenorhabditis elegans

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Avaliação Compreensiva de Germline Chemical Toxicity Usando o Nemátodo

Um método simples para High Throughput Screening químico em Caenorhabditis Elegans

Um ensaio de alta produtividade para a predição da toxicidade química por Automated Caracterização fenotípica de Caenorhabditis elegans

Usando Caenorhabditis elegans para estudar trans-e multi-Generational efeitos de toxicants

Quantificando a ingestão de alimentos em Caenorhabditis elegans medindo a depuração bacteriana

Quantificando a ingestão de alimentos em Caenorhabditis elegans medindo a depuração bacteriana

Quantificando a ingestão de alimentos em Caenorhabditis elegans medindo a depuração bacteriana

Um ensaio para medir os efeitos do etanol sobre a velocidade de Locomotion

Medição Caenorhabditis elegans Expectativa de Vida em 96 placas de microtitulação Bem

Medição dos Efeitos de bactérias em