Este protocolo foi originalmente desenvolvido no Fred Hutchinson Cancer Research Center em Seattle por Xiaolan Ye e Michael Petrascheck no Laboratório de Linda Buck. A versão detalhada acima foi preparado para fazer todo o procedimento disponível para a comunidade em geral. Agradecemos a Carol Taylor, Sarah e Andy LeBoeuf Tomacelli pela leitura crítica do protocolo. Este é manuscrito # 2866 do The Scripps Research Institute. O Laboratório de Petrascheck é financiado pelo programa ADI Novartis.

Resumo: O protocolo é dividido em quatro partes. Parte 1 descreve como preparar as bactérias alimentação. Parte 2 descreve como preparar a cultura worm. Parte 3 descreve como pontuação vida. Parte 4 mostra alguns resultados representativos, e Parte 5 descreve como preparar as soluções necessárias. Experimentos vida levar várias semanas para ser concluído. Para cada etapa da semana de protocolo, dia e hora do dia está incluído para facilitar o planejamento. O estágio L4 (Dia 0) é usado como ponto de referência para todo o protocolo. 1. Preparação de bactérias que se alimentam Esta seção descreve a preparação das bactérias alimentação. O E. específicas coli cepa utilizada para alimentar C.elegans é chamado OP50. Antes deste protocolo, para evitar a contaminação cruzada da cultura verme com outras bactérias, a cepa OP50 foi feito carbenicilina / Ampicilina resistentes 21. Prepare o OP50 4-5 dias de antecedência. Todos os materiais em contacto com OP50 devem ser estéreis. Dia -7: quinta-feira (1 semana): Inocular 5 ml de TB contendo 100 mcg / ml ampicilina e 0,1 mcg / ml anfotericina B com uma colônia OP50 única e incubar durante a noite a 37 ° C em um agitador bacteriana. Dia -6: sexta-feira (1 semana). 8:30 da manhã. Inocular cedo para dar tempo suficiente para a cultura para atingir a saturação <ol><li> Diluir a cultura da noite para o dia OP50 1:2000 em 300 TB mL contendo 50 mcg / ml ampicilina. Incubar a cultura em um shaker bacteriana por 8-12 horas a 37 ° C até à saturação é atingido. Não permita que a cultura a crescer mais de 14 horas. </li><li> Transferir o OP50 em um tubo de centrifugação estéril, pré-ponderada. Pellet o OP50 por centrifugação por 10 min a 3500 rpm (2200 xg) em uma centrífuga de mesa. </li><li> Desprezar o sobrenadante e ressuspender o pellet OP50 em água estéril e re-pellet por centrifugação. Repita esta lavagem duas vezes. </li><li> Depois da segunda lavagem, retire cuidadosamente toda a água restante. Nenhuma água deve ser deixado no tubo. Pesar o tubo de centrifugação contendo o pellet e subtrair o peso do tubo de centrifugação vazia, a fim de determinar o peso do sedimento. </li><li> Completamente re-suspensão do sedimento em S-completa para uma concentração de 100 mg / mL. Não aglomerados deve ser deixado. </li><li> A concentração de 100 mg / mL OP50 deve corresponder a 2 x10 10 bactérias / mL. Use um espectrômetro foto para determinar o número de bactérias por mL, se a relação entre a densidade ótica eo número de bactérias por mL é conhecido. Se necessário, ajustar a concentração da solução de alimentação OP50 a 2 x10 10 bactérias / mL. </li><li> Armazenar os OP50solution a 4 ° C até ser utilizado para a cultura worm. </li></ol> 2. Preparação de uma Cultura Worm Synchronous Esta seção descreve a preparação da cultura worm. Seu objetivo é gerar uma população em idade síncrona de worms. Todos os materiais em contacto com C.elegans após o tratamento de lixívia na etapa 5 devem ser estéreis. Placas são mantidos a 20 ° C salvo indicação em contrário. Dia -6: sexta-feira (1 semana), 16:00: Transfer os animais para um prato fresco <ol><li> Dê uma placa NGM 50-10 dias de idade em que a maioria da população sem-fim consiste de larvas L1 fome. </li><li> Esterilizar uma espátula de metal por pouco tempo de aquecimento é mais um bico de Bunsen. Deixe esfriar. Use a espátula resfriado a cortar pedaços de agar da placa contendo os vermes famintos. Transferência de vários desses pedaços em uma nova placa de 10 centímetros NGM semeados com OP50. Incubar por aprox. 65 horas a 20 ° C até que a maioria da população sem-fim é composto por adultos gravídico. O tempo que leva para os animais L1 fome para crescer em adultos gravid pode variar de cepa para cepa. </li></ol> -3 Dia: segunda-feira (2 semanas) 10:00: Estabelecer uma população síncrona <ol start="3"><li> Coletar worms da placa de 10 cm, lavando-as fora do prato com água mL 10/05 estéril. Transferir a solução worm / água em um tubo cônico de 15 mL. </li><li> Lave os vermes por centrifugação 2 min em uma centrífuga de mesa em 1200 rpm (280 xg). Elimine o sobrenadante e adicionar 10 mL de água. Repetir. </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 5 mL de lixívia preparada / solução de NaOH (2,5 lixívia mL, 1 mL de NaOH 10N, 6,5 mL H 2 O). Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente até que os vermes abrir. Certifique-se de vortex suavemente a cada minuto. Monitorar o progresso da reação sob o microscópio de dissecação. </li><li> Assim que todos os adultos se dissolver, adicionar 5 mL de tampão M9 para neutralizar a reação. </li><li> Lave os ovos três vezes com 10 mL tampão M9 por centrifugação 2 min a 2500 rpm (1100 xg). </li><li> Lave os ovos uma vez com 10 mL S-completo por centrifugação 2 min a 2500 rpm (1100 xg). </li><li> Remover o sobrenadante, adicionar 10 mL S-completo e transferir a solução para um tubo cônico de 50 mL fresco. Adicionar 30 mL de S-complete para um volume final de 40 mL. Agite suavemente o tubo durante a noite a temperatura ambiente em um nutator ou dispositivo similar. </li></ol> Dia -2: terça-feira (2 semanas), o meio-dia 12:00: Seed os animais em placas <ol start="10"><li> No âmbito de dissecação, verificar se os vermes nascidos durante a noite. Determinar a concentração de worms na solução S-completo por contagem do número de worms em 10 gotas mL usando um escopo de dissecação. Contar, pelo menos, 10 gotas para cada amostra. </li><li> Re-suspender a worms em uma concentração de 8-10 worms / mL em S-completa. Adicionar carbenicilina (stock 100 mg / mL) a uma concentração final de 50 mcg / mL e anfotericina B (stock 250 mcg / mL) para uma concentração final de 0,1 mg / mL. Agitar em um nutator. Se preparando quantidades maiores de vermes, use um frasco de 600 mL nunclon com tampa de filtro. </li><li> Em 2:30 adicionar o OP50 preparada na parte 1 para uma concentração final de 6 mg / mL (= 1,2 x10 9 bactérias / mL). Devolver o OP50 a 4 ° C. </li><li> Transferência de 120 mL da solução worm/OP50 em cada poço de uma placa de 96 poços. Use 96 placas bem com um fundo transparente. Certifique-se manter os vermes em suspensão, enquanto pipetagem. </li><li> Selar a placa usando uma fita isolante para evitar a contaminação e evaporação. Agite a placa em uma placa de microtitulação shaker por 2 min e incubar por 2 dias a 20 ° C até os animais atingirem o estágio L4. </li></ol> Dia 0: quinta-feira (2 semanas) antes do meio dia: Esterilizar animais adicionando Fluorodeoxyuridine (FUDR) <ol start="15"><li> Para esterilizar os animais adicionar 30 mL de uma solução estoque 0,6 mM FUDR a cada poço. Esta etapa traz o volume final em cada poço a 150 mL e reduz a concentração final de OP50 de 6mg / ml a 5 mg / mL (1x10 9 bactérias / mL). Selar a placa usando fita selantes e agitá-lo por 2-3 min em uma placa de microtitulação shaker. Se o OP50 foi adicionado às 2:30 no dia -2, é importante que o FUDR é adicionado antes do meio dia. Retorno placas para a incubadora de 20 ° C </li></ol> Dia 1: sexta-feira (2 semanas): Adicionar drogas para a cultura <ol start="16"><li> Por 9h00 a maioria dos animais deve ser gravid e contêm vários ovos cada. Adicionar as drogas cujo efeito no tempo de vida é para ser testado na concentração desejada. Se dissolver a droga em DMSO a concentração final de DMSO não deve exceder 0,6%, como DMSO concentrações superiores a 0,6% C.elegans encurtar sua vida útil. Após a adição da droga, selar as placas com fita isolante e agitá-lo por 2-3 min em uma placa de microtitulação shaker. Retorno placas para a incubadora de 20 ° C </li><li> Adicionando as drogas podem, ocasionalmente, matar alguns animais por placa, especialmente se estiver usando um outro solvente que a água. Use um microscópio invertido para verificar se há animais mortos. Geralmente, não deve ser inferior a 10 animais mortos por placa de 96 poços. Retorno pratos para a 20 ° C incubadora. </li></ol> Dia 4: segunda-feira (3 semanas): selantes Alterar <ol start="18"><li> Para permitir que o oxigênio fresco para entrar a cultura remover o selante, espere um minuto e feche o prato. Agite a placa por 2-3 minutos em uma placa de microtitulação shaker. Repita uma vez por semana. </li></ol> Dia 5: terça-feira (3 semanas): Adicionar novo OP50 para evitar a fome <ol start="19"><li> Adicionar 5 mL da 100 mg / mL OP50 solução que foi preparada na parte 1 a cada um dos 96 poços para evitar a fome. </li></ol> 3. Pontuação de Lifespan. Esta seção descreve como a sobrevivência da população sem-fim sincronizado da Parte 2 é monitorada até que os animais morreram. Para observar os animais nos 96 pratos bem, use um microscópio invertido com um objetivo 2x ou 2.5x. Registro de dados de sobrevivência três vezes por semana; segunda, quarta e sexta-feira. Use movimento para determinar se os animais estão vivos ou mortos. Luz forte, luz especial azul, induz os animais a se mover. Não retire os animais mortos a partir do ensaio. Ocasionalmente, os animais que não se moveu e estavam determinados mortos na contagem anterior pode se mover mais tarde. <ol><li> No dia 0, no início do experimento contar o número total de vermes em cada poço. Censor poços que contêm mais de 18 animais a partir da análise como animais nesses poços não terá o suficiente OP50 e irá mostrar os efeitos da restrição alimentar. </li><li> A fim de aumentar a chance de que os animais se movem agitar a placa de 96 poços em uma placa de microtitulação shaker por 2 min. antes da contagem. </li><li> Em cada sessão contando data de registro e número de animais quese movem como animais vivos. Movimento em líquidos é muito mais fácil do que em meios sólidos e pode ser induzida por luz forte. O uso de uma maior ampliação pode ajudar a detectar movimentos muito sutis, como os da ponta da faringe. Tais movimentos sutis são muitas vezes o único movimento observado em animais muito velhos. </li><li> Retorno placas para a incubadora de 20 ° C </li><li> Repita o passo 2-4 a cada dois ou três dias até que todos os animais são mortos. </li></ol> 4. Resultados representante. Esta seção mostra um exemplo de como manter registros dos dados gerados por este tempo de vida do ensaio e alguns resultados representativos. Figura 1A mostra um exemplo de como gravar dados de expectativa de vida durante este ensaio. Uma folha excel é usado para rastrear a sobrevivência das populações em cada poço. Para cada bem, é coordenar na placa, a tensão, a droga, concentração da droga e do número total de animais vivos no dia 0 (X0) é gravada no início do experimento. Data de registo, bem como o número de animais mortos vivos e três vezes por semana a fim de seguir a sobrevivência das diversas populações em cada poço. Para o gráfico dos resultados, calcular a fração de animais vivos para cada dia e enredo como uma função do tempo em dias. P-valores devem ser calculados utilizando pacotes estatísticos como STATA ou software similar. A vida útil média de C.elegans é dependente da temperatura. Figura 1B mostra que as mudanças dependem da temperatura na expectativa de vida são reproduzidas exatamente pela expectativa de vida de microtitulação com base ensaio 22. Da mesma forma, o ensaio de placa de microtitulação reproduz mudanças na vida de mutantes relatado para ter tempo de vida que diferem dos animais tipo selvagem N2 23-24 25 (Figura 1C). O ensaio também pode ser usado para fazer declarações mais quantitativa. Em média Fig1D vida é plotado como uma função da concentração mirtazapina 7. Cada ponto de dados representa a vida útil média de 12/07 população, cada um vivendo de uma forma diferente também. Mesmo que o número de animais por bem é relativamente baixa (5-15 animais) a variação bem-bem é relativamente pequena, como pode ser visto a partir as barras de erro. <img src="/files/ftp_upload/2496/2496fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. A placa de microtitulação com base lifespan ensaio reproduz com precisão as mudanças na expectativa de vida relatadas na literatura. (A) Os dados da amostra coletada em uma planilha excel. Durante cada sessão data de contagem, de coordenadas do bem e do número de animais vivos e mortos foi registrado. No início do experimento, o número total de animais em cada poço foi determinado. (B) Curva de sobrevida de tipo selvagem (N2) animais cultivados a 20 ° C e 25 ° C. (C) As curvas de sobrevida de estirpes portadores de mutações que afetam a vida. Todas as quatro cepas foram testadas em paralelo a 20 ° C. (D) curva de resposta da dose de mirtazapina N2 animais tratados. A média de expectativa de vida é plotado como uma função da concentração de mirtazapina. Barras de erro indicam o EPM de 8 poços por condição. 5. Materiais. M9 buffer, 1000 mL <ul><li> 6 g Na 2 HPO 4 </li><li> 3 g KH 2 PO 4 </li><li> 5 g de NaCl </li><li> 0,25 g MgSO 4 7H 2 O ∙ </li><li> Adicione água deionizada para 1000 mL </li><li> Autoclave </li></ul> PH Potassiumphosphate tampão 6.0, 1000 mL <ul><li> 136 g KH 2 PO 4 </li><li> Adicionar água deionizada até 900 mL </li><li> Ajustar o pH para 6,0 com KOH 5M </li><li> Adicione água deionizada para 1000 mL </li><li> Autoclave </li></ul> Traço solução de metal <ul><li> 1,86 g Na 2 EDTA </li><li> 0,69 g FeSO 4 7H 2 O ∙ </li><li> 0,20 g MnCl 2 ∙ 4H 2 O </li><li> 0,29 g ZnSO 4 7H 2 O ∙ </li><li> 0,016 g CuSO 4 </li><li> 1000 mL de água deionizada </li><li> Autoclave e armazenar no escuro. </li></ul> S-basal média, 1000 mL <ul><li> 5,9 g NaCl </li><li> 50 mL de fosfato de potássio 1M, pH 6,0 </li><li> 1000 mL de água deionizada </li><li> Autoclave </li><li> Deixe a solução arrefecer e adicionar 1 mL de colesterol 5mg / mL (dissolvido em Et-OH). </li></ul> 1M citrato de potássio, 1000 mL <ul><li> 268,8 g de citrato tripotássio </li><li> 26,3 ácido cítrico </li><li> Adicionar 900 mL de água deionizada </li><li> Ajustar o pH para 6,0 com KOH 5M </li><li> Adicione água deionizada para 1000 mL </li><li> Autoclave </li></ul> S-médio completo, 1000 mL <ul><li> 977 mL S-basal </li><li> 10 mL de citrato pH 1M de potássio 6 (estéril) </li><li> Rastreamento 10 mL de solução de metais (estéril) </li><li> 3 ml 1M CaCl 2 (estéril) </li><li> 3 mL 1M MgSO 4 (estéril) </li></ul> Agar NGM <ul><li> 3.0G NaCl </li><li> 2,5 g peptona(Pancreático de caseína, digerir) </li><li> Agar 17g </li><li> Adicionar água deionizada para 975 mL e uma barra de agitação </li><li> Autoclave </li><li> Após autoclavagem arrefecer a 55 ° C e adicionar os seguintes componentes: <ul><li> 0,5 mL de CaCl 2 1M (estéril) </li><li> 1 mL de Colesterol 5mg / mL em etanol </li><li> 1 mL de 1M MgSO 4 (estéril) </li><li> 25 tampão Potassiumphosphate mL, pH 6,0 (estéril) </li></ul></li></ul> TB, 1000 mL <ul><li> 12g Bacto Triptona </li><li> Extrato de levedura 24 g </li><li> 4 mL de glicerol </li><li> Adicionar 900 mL de água deionizada </li><li> Autoclave </li><li> Após autoclavagem arrefecer a 55 ° C e adicione o componente seguinte: <ul><li> adicionar 100 mL de 0.17M KH 2 PO 4 / 0.72MK 2 HPO 4 </li></ul></li></ul> 0,6 mM Fluorodeoxyuridine (FUDR, sigma # cat F0503), 1000 mL <ul><li> 100 mg FUDR </li><li> Dissolver em 670 mL estéreis S-completar, fazer 10 mL ou 45 mL alíquotas. </li><li> Armazenar a -20 ° C. </li></ul> 100 mg / mL carbenicilina, 10 mL <ul><li> 1 g carbenicilina </li><li> 10 mL de água deionizada estéril </li><li> Estéril filtrado e alíquota </li><li> Armazenar a -20 ° C. </li><li> Use a uma concentração final de 50 mcg / mL </li></ul> 250ug / ml anfotericina B, 4 mL <ul><li> 1mg anfotericina B </li><li> 4 mL Et-OH </li><li> Armazenar a -20 ° C </li><li> Use a uma concentração final de 0,1 mg / mL </li></ul>

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span.">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mech. Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).</li><li>Ailion, M., Inoue, T., Weaver, C. I., Holdcraft, R. W., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosecretory+control+of+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Neurosecretory control of aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7394-7397 (1999).</li><li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type.">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366, 461-464 (1993).</li><li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+life-span+in+Caenorhabditis+elegans+by+four+clock+genes.">Determination of life-span in Caenorhabditis elegans by four clock genes.</a> Science. 272, 1010-1013 (1996).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo apresentado permite a medição de C.elegans vida em 96 placas de microtitulação. Como mostrado nos resultados representante seção, de forma confiável replica achados prévios e fornece informações quantitativas. Com este ensaio conseguimos exibido mais de 89.000 moléculas para o seu efeito sobre C.elegans vida. Para efeitos de drogas-triagem, medindo vida em um formato de placa de 96 poços de microtitulação tem várias vantagens sobre o ensaio de mídia clássica sólido. Ele reduz o trabalho necessário para a preparação de mídia, a quantidade de espaço de incubação, ea quantidade de droga necessária. O formato de 96 poços ea instalação de microscopia permitem a automação do ensaio inteiro para exames de alto throughput. Durante o desenvolvimento do ensaio vários valores para cada variável e suas combinações foram testadas para os seus efeitos sobre C.elegans vida. Estes testes incluíram concentração OP50 diferentes variando de 3 a 10 mg / mL (3, 4, 6, 8, 10 mg / mL), número diferente de worms por poço variando de 7 a 45 (7, 10, 15, 22, 45 worms / poço), os volumes de cultura diferentes que variam de 40-150 mL por poço (40, 60, 80, 100, 120, 150 mL), e mudanças na composição buffer. Se alimentado com uma OP50 carbenicilina resistente, nem carbenicilina nem anfotericina B nas concentrações indicadas foram encontrados para afetar C.elegans vida. Agitação suave contínuo de placas, como é frequentemente recomendada em C.elegans cultura líquida, foi encontrado dispensável para os pequenos volumes utilizados neste ensaio. Agitação suave, porém, é necessário se placas de microtitulação com poços maiores devem ser usados. Os valores indicados neste protocolo foram cuidadosamente selecionados com base na comparação estatística das diferentes condições testadas. A característica mais surpreendente deste ensaio é provavelmente o fato de que C.elegans pode ser mantida em 96 placas de bem que são seladas com fita adesiva. Side-by-side comparações não revelaram qualquer diferença na expectativa de vida de animais cultivadas em placas sem lacre, em placas seladas com um selante plástico, ou em placas vedadas com selantes que permitem troca de ar. Em todas as três condições, os animais desenvolveram muito homogênea de L1 a adultos gravid no prazo de 65 horas e mostrou expectativa de vida muito semelhantes. Animais cresceu em paralelo em NGM desenvolveu um pouco mais rápido, mas esta diferença foi independente da ausência ou presença de um selador. O protocolo apresentado é baseado em bactérias vivas, mas pode ser adaptado para as bactérias mortas. No entanto, em um ensaio de líquidos uma única bactéria pode sobreviver e se multiplicar rapidamente re-popular a cultura. Em nossas mãos, a única maneira confiável para matar as bactérias na medida em que eles podem ser usados ​​para a cultura líquido é de tratamento prolongado das bactérias com radiação gama. Um ponto importante a considerar no planejamento de um experimento de vida é o poder de detecção. Depende do tamanho do efeito, o efeito da droga de interesse devem ser testados em poços múltiplos. Em um ensaio típico de 4 tratados com o fármaco e 4 poços de controlo, que corresponde aproximadamente a 40-50 animais cada, deveria ser suficiente para detectar um aumento de 30% na expectativa de vida em mais de 95% dos experimentos. Aumenta de 14% só são detectados em 60% dos casos e, portanto, exigem mais poços replicar. A riqueza de dados gerados por este tempo de vida do ensaio pode ser usado para desenvolver experiência ou cepa específica modelos Gompertz paramétricos 1. Estes modelos Gompertz são úteis para determinar o poder de detecção e para estimar o número de falsos positivos e negativos para grandes telas. Verificou-se as previsões destes modelos em experimentos cegos e os usou para estimar o número de falsos negativos em telas de grandes dimensões (resultados não publicados). Em resumo, nós antecipamos que o ensaio apresentados serão de grande utilidade para identificar as moléculas pequenas que estender o tempo de C.elegans e estudar os mecanismos subjacentes.

A correction to the article Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates was made.

Erratum: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Amphotericin B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>cat# 171375</td>
<td>Also called Fungizone</td>
</tr>
<tr>
<td>FUDR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>cat# F0503</td>
<td>FUDR is inactivated by heat, thaw in cold water</td>
</tr>
<tr>
<td>Mianserin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>M2525-250MG</td>
<td>Use as positive control at 50&mu;M final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyproheptadine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>cat#C6022-MG</td>
<td>Alternative positive control at 10 &mu;M final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Sealing Tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>cat# 236370</td>
<td>Polyester, non-sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>96 well plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>cat# 351172</td>
<td>Non-treated, transparent, sterile individual packaged, polystyrene</td>
</tr>
<tr>
<td>Nunclon flask</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>cat# 178883</td>
<td>used for large volumes</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

measuring caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates

Expectativa de vida é um processo biológico regulado por várias vias genéticas. Uma estratégia para investigar a biologia do envelhecimento é estudar os animais que as mutações em componentes porto de idade-regulação caminhos. Se essas mutações perturbam a função da via idade-regulação e, portanto, alterar a vida útil de todo o organismo, eles oferecem importantes perspectivas mecanicistas 1-3. Outra estratégia para investigar a regulação da vida útil é a utilização de pequenas moléculas para perturbar a idade regulamentar caminhos. Até à data, um número de moléculas são conhecidos por prolongar sua vida útil em vários organismos modelo e são utilizados como ferramentas para estudar a biologia do envelhecimento 16/04. O número de moléculas identificadas até agora é pequeno se comparado ao &quot;conjunto de ferramentas&quot; genético que está disponível para estudar a biologia do envelhecimento. Caenorhabditis elegans é um dos modelos princípio usado para estudar o envelhecimento devido à sua genética excelente e curta duração de três semanas. Mais recentemente, C.elegans tem emergido como um organismo modelo para telas de fenótipo baseado drogas 5,7,16-20 por causa de seu pequeno tamanho e sua capacidade de crescer em placas de microtitulação. Aqui apresentamos um ensaio para medir C.elegans vida em 96 placas de microtitulação. O ensaio foi desenvolvido e utilizado com sucesso para a tela de grandes bibliotecas de moléculas que se estendem C.elegans vida 7. A confiabilidade do ensaio foi avaliada em testes de múltipla: primeiro, através da medição do tempo de vida de animais de tipo selvagem crescidas em diferentes temperaturas, em segundo lugar, através da medição do tempo de vida dos mutantes, com expectativa de vida alterado, em terceiro lugar, medindo mudanças na expectativa de vida em resposta a diferentes concentrações da mirtazapina antidepressivo. A mirtazapina tem sido mostrado previamente para estender o tempo em C.elegans 7. Os resultados destes testes mostram que o ensaio é capaz de reproduzir os achados anteriores de outros ensaios e quantitativa. O formato de microtitulação também faz esse ensaio vida compatível com sistemas de tratamento automatizado líquido e permite a integração em plataformas automatizadas.

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Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Neste protocolo, apresentamos um método para medir<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Tempo de vida em 96 placas de microtitulação.

Medição Caenorhabditis elegans Expectativa de Vida em 96 placas de microtitulação Bem

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

measuring-caenorhabditis-elegans-life-span-96-well-microtiter

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

36.4K visualizações.  The Scripps Research Institute. Neste protocolo, apresentamos um método para medir Caenorhabditis elegans Tempo de vida em 96 placas de microtitulação.

Vídeo: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

Medição Caenorhabditis elegans Expectativa de Vida em meios sólidos

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Biologia

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and chronological life spans are two established paradigms used to study aging in yeast. Replicative aging is defined as the number of daughter cells a single yeast mother cell produces before senescence; chronological aging is defined by the length of time cells can survive in a non-dividing, quiescence-like state 2. We have developed a high-throughput method for quantitative measurement of chronological life span. This method involves aging the cells in a defined medium under agitation and at constant temperature. At each age-point, a sub-population of cells is removed from the aging culture and inoculated into rich growth medium. A high-resolution growth curve is then obtained for this sub-population of aged cells using a Bioscreen C MBR machine. An algorithm is then applied to determine the relative proportion of viable cells in each sub-population based on the growth kinetics at each age-point. This method requires substantially less time and resources compared to other chronological lifespan assays while maintaining reproducibility and precision. The high-throughput nature of this assay should allow for large-scale genetic and chemical screens to identify novel longevity modifiers for further testing in more complex organisms.

Chronological aging in yeast refers to the loss of cell viability associated with time in stationary phase. Here we describe a high-throughput method for quantitatively determining yeast chronological life span.

Quantificar Yeast Life Span cronológica por conseqüência de células envelhecidas

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Medição Span vida replicativa na levedura de brotamento

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Lapso de tempo Microscopia de embriogênese inicial em Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice Cap: Um Método para Crescer Arabidopsis Plantas e tomate em placas de 96 poços para High-Throughput Genotipagem

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos: Sincronização e observação

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Extração de prostaglandina e Análise em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Medição de resistência de Estresse Oxidativo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Em placas de 96 poços de microtitulação

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

Medição da Toxicidade do Peptídeo RAN em C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Medição Caenorhabditis elegans Expectativa de Vida em 96 placas de microtitulação Bem

Resumo

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Medição Caenorhabditis elegans Expectativa de Vida em meios sólidos

Quantificar Yeast Life Span cronológica por conseqüência de células envelhecidas

Medição Span vida replicativa na levedura de brotamento

Lapso de tempo Microscopia de embriogênese inicial em Caenorhabditis elegans

Ice Cap: Um Método para Crescer Arabidopsis Plantas e tomate em placas de 96 poços para High-Throughput Genotipagem

Básico

Extração de prostaglandina e Análise em

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Medição de resistência de Estresse Oxidativo

Medição da Toxicidade do Peptídeo RAN em C. elegans