Este trabalho foi apoiado pela Fundação britânica do coração (PG/13/60/30406) e da Universidade de Birmingham.

Todos os procedimentos de animais foram aprovados pelo corpo de revisão ética Animal Welfare e o Home Office UK (Reino Unido, projeto licença 40/3745). Camundongos C57BL/6 fundo, 8-12 semanas, 19-25 g de peso de corpo, de ambos os sexos são usados.
1. animal anestesia
<ol>
	<li>Coloque um rato em uma câmara de indução e induzir anestesia por uma mistura de 5% de isoflurano com 100% de oxigênio. Utilização de uma taxa de fluxo de 0,5 L/min. espere até o mouse completamente para de se mover e sua frequência de respiração torna-se rara.</li>
	<li>Remover o mouse da câmara e raspar o abdômen com uma tosquiadeira elétrica. Remova pelos do abdômen tão completamente quanto possível para evitar a contaminação da cavidade abdominal.</li>
	<li>Coloque o mouse na posição supina e nariz do mouse em um cone ligado ao sistema de anestesia. Diminua a porcentagem de isoflurano para 2-3% (a porcentagem exata pode variar ligeiramente de animal para animal). Certifique-se que o animal está dormindo com sua taxa respiratória, sendo mais baixo do que o habitual, mas evitando ofegante. Se ofegante ocorre, diminua a porcentagem de isoflurano em 0,5%.
	<ol>
		<li>Verifica o reflexo de pedal para confirmar anesthetization adequado e começar a cirurgia, só se for negativo. Aplica o vet pomada sobre os olhos para evitar ressecamento.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aplicar uma solução de antibactericida (1% Hibitane) sobre do mouse abdômen e limpar a área usando um algodão estéril bud de forma excluindo potencial re-contaminação do local cirúrgico (por exemplo, dentro para fora em uma forma circular). Repeti 3 vezes.</li>
</ol>
2. aplicação da estenose da veia cava inferior e recuperação de Mouse
Nota: Todos os instrumentos, bem como materiais (cotonetes, gaze, soro etc.) entrar em contacto com o campo cirúrgico deve ser estéril. O operador deve lavar as mãos antes da cirurgia e usar luvas estéreis e vestido durante o procedimento. Microscópio identificadores devem ser dispostos em uma folha estéril.
<ol>
	<li>Dar ratos um tratamento antidor antes da cirurgia e durante todo o período experimental. Por exemplo, use a buprenorfina 0,1 mg/kg por via subcutânea 30 minutos antes da cirurgia e depois a cada 12 horas até que o animal é sacrificado. Como trombose neste método desenvolve-se da mesma forma a inflamação estéril, evite usar anti-inflamatórios como uma pré-medicação.</li>
	<li>Cobrir o mouse com um pano estéril e faça um buraco na cortina para expor o local da cirurgia. Usando a tesoura, faça uma incisão ao longo da linha média abdominal, 1,5 cm abaixo do esterno. Usando cotonetes exteriorize os intestinos ao lado esquerdo do mouse e cubra-os com gaze estéril embebida em solução salina morna (37 ° C) para evitar ressecamento.</li>
	<li>Identifique a veia cava inferior e seus ramos colaterais (pode haver 0, 1 ou 2 deles) na direção caudal do local de fusão entre a veia cava inferior com a veia renal esquerda. Ligam todos os ramos do lado visível com 7-0 inerte Prolene suturas como próximo a veia cava inferior quanto possível.
	<ol>
		<li>Não tente segurar os ramos laterais com a pinça diretamente mas prefiro puxar para cima segurando do tecido adiposo em torno deles com pinças em uma mão e fazercom um túnel por baixo do ramo com a pinça na outra mão. Não feche agências volta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Segurando os tecidos circunvizinhos com fórceps, puxe a veia cava inferior acima e esquerda produzindo tensão na pequena área entre a veia cava inferior e a aorta exatamente no ângulo entre a veia cava inferior e a veia renal esquerda. Leve em conta que é praticamente impossível separar a veia cava inferior (na direção caudal) nem a 2-3 mm abaixo da aorta.</li>
	<li>Usando movimentos divergentes com pontas de pinças em sua mão direita faça um buraco entre a aorta e a veia cava inferior. Tenha em mente que os movimentos mais feito, maior a chance de danificar a nave. Idealmente, tente minimizar o número de movimentos para 3-5.</li>
	<li>Prepare um pedaço de inertes sutura Prolene 7-0, de cerca de 2 cm de comprimento. Coloque-o na cavidade peritoneal do mouse lado esquerdo do operador na proximidade para a veia cava inferior.</li>
	<li>Puxe a veia cava inferior e saiu novamente. Insira suas dicas certo fórceps no orifício entre a aorta e a veia cava inferior para que as dicas aparecem do outro lado da veia cava inferior. Leve a sutura e puxe de volta através do orifício(Figura 3).</li>
	<li>Faça um nó provisório com a sutura, mas não fechá-lo. Coloque a agulha 30G ("um espaçador") dobrado como um gancho para o nó e agora fecha-lo (Figura 3B).</li>
	<li>Remova o espaçador (Figura 3C).</li>
	<li>Retorno do intestino para a cavidade peritoneal com um algodão bud e distribuí-las igualmente nele.</li>
	<li>Feche o peritônio com suturas de vicryl 6-0 usando loops contínuos. Feche as brechas primeiras e o últimas como um nó.</li>
	<li>Pele perto usando grampos metálicos.</li>
	<li>Injetar o mouse com 0,5 mL de quente (37 ° C) glicose soro fisiológico por via subcutânea para restaurar o equilíbrio líquido do organismo.</li>
	<li>Coloque o mouse em uma gaiola individual em um quarto ou câmara morna (25 ° C) e colocar comida e água no compartimento do gel. Observe até que o mouse está totalmente recuperado (geralmente, em torno de 1 h).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Heit, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+venous+thromboembolism+in+the+community.">The epidemiology of venous thromboembolism in the community.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (3), 370-372 (2008).</li><li>Huang, W., Goldberg, R. J., Anderson, F. A., Kiefe, C. I., Spencer, F. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrolytic+inferior+vena+cava+model+(EIM)+to+study+thrombogenesis+and+thrombus+resolution+with+continuous+blood+flow+in+the+mouse.">The electrolytic inferior vena cava model (EIM) to study thrombogenesis and thrombus resolution with continuous blood flow in the mouse.</a> Thromb Haemost. 109 (6), 1158-1169 (2013).</li><li>Brill, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrahepatic+high-density+lipoprotein+receptor+SR-BI+and+apoA-I+protect+against+deep+vein+thrombosis+in+mice.">Extrahepatic high-density lipoprotein receptor SR-BI and apoA-I protect against deep vein thrombosis in mice.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (8), 1841-1847 (2012).</li><li>Diaz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+review+of+mouse+models+of+venous+thrombosis.">Critical review of mouse models of venous thrombosis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (3), 556-562 (2012).</li><li>Brandt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+vein+thrombus+formation+induced+by+flow+reduction+in+mice+is+determined+by+venous+side+branches.">Deep vein thrombus formation induced by flow reduction in mice is determined by venous side branches.</a> Clin Hemorheol Microcirc. 56 (2), 145-152 (2014).</li><li>Geddings, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+weaknesses+of+a+new+mouse+model+of+thrombosis+induced+by+inferior+vena+cava+stenosis:+communication+from+the+SSC+of+the+ISTH.">Strengths and weaknesses of a new mouse model of thrombosis induced by inferior vena cava stenosis: communication from the SSC of the ISTH.</a> J Thromb Haemost. 12 (4), 571-573 (2014).</li><li>Alvarado, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+mice+have+increased+thrombotic+potential:+sex+differences+in+a+mouse+model+of+venous+thrombosis.">Male mice have increased thrombotic potential: sex differences in a mouse model of venous thrombosis.</a> Thromb Res. 127 (5), 478-486 (2011).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, um protocolo da estenose de veia cava inferior, que imita a distorção do fluxo de sangue, um importante factor desencadeante para TVP, é apresentado. Estenose do IVC induz o desenvolvimento de trombos em 65-100% de camundongos C57BL/6, no prazo de 48 h e 25-50% de ratos dentro de 2-6 h6,8,23 (Brill A, dados não publicados, 2016). Uma grande limitação do método é a variabilidade no trombo tamanho24 (Figura 4), que é observado após a curto prazo (6 h) e a longo prazo estenose (48 h) IVC. As razões para tal variabilidade (dado que as mesmas condições, tais como o espaçador, anestesia etc., são usados) permanecem obscuras, mas se pode especular que anatômica variações entre os ratos (por exemplo, largura do IVC, número e localização das laterais e traseira Ramos) subjazem a este fenómeno. A variabilidade no tamanho do trombo torna a prevalência de trombose (% dos ratos com um trombo) o resultado principal. Prevalência de trombose pode ser comparada usando uma tabela de contingência e teste exato de Fisher. Um dos experimentos foi uma exceção quando o trombo reduzido tamanho com a mesma prevalência de trombose após injeção de anticorpos inibindo podoplanin observou-se 7.
Este método é especialmente útil quando é estudada a iniciação de trombose venosa. Permite investigar eventos iniciais na parede do vaso, tais como o recrutamento de células, levando eventualmente à trombose. Pro - ou anti - thrombotic efeitos de drogas podem ser avaliados usando este modelo, com prevalência de trombose, sendo uma leitura preliminar. Estenose de 48 h é aplicável para revelar um fenótipo anti-trombótica, Considerando que a estenose h 6 pode ser usado se um fenótipo prothrombotic é esperado. Análise histológica do trombo e parede circunvizinha de veia cava inferior também pode ser realizada.
A questão que se ramifica o lado deve ser ligado ou deixou patente permanece aberta. Um grupo tem demonstrado que a ligadura dos ramos laterais não aumenta o tamanho do trombo e localização de uma filial do lado mais perto do que 1.5 mm ao site de ligadura da veia cava inferior prejudica dramaticamente trombo desenvolvimento25. Encerramento de ramos laterais pode induzir lesão endotelial neles e também aumentar o tempo de cirurgia26. Em nossas mãos, falta de encerramento do ramo lateral diminui substancialmente prevalência de trombose (abaixo de 10-30% após a estenose de 48 h; Brill, inéditos) e, portanto, nós ligate todos os ramos de lado visível.
Idealmente, devem ser utilizados littermate controlos, como ratos, mesmo no fundo mesmo, mas de diferentes fontes, podem ter prevalência de trombose ligeiramente diferente. Se é estudado o efeito da TVP em si em todos os parâmetros (por exemplo, bioquímico), animais com operação devem ser usados. Ratos de operação submeter-se o mesmo procedimento, mas a ligadura ao redor da veia cava inferior é fechada frouxamente e deixou lá sem produzir estenose.
O erro mais frequente (uma etapa crítica) neste protocolo é um esforço para separar a aorta e a veia cava inferior não é precisamente no ângulo entre os vasos mas um pouco menor, que geralmente resulta em sangramento. Quando uma hemorragia ocorre, boa recuperação do mouse torna-se improvável e recomenda-se parar o experimento e a eutanásia do animal. Normalmente, os ratos recuperar bem, mover-se dentro da jaula e substancialmente não perder peso. Recomendamos usar ratos acima de 20g para machos e fêmeas e manter animais (especialmente os machos) em gaiolas individuais após a cirurgia até o final do experimento para evitar combates e ferimentos. Tem sido relatado em outro modelo (eletrolítico) de TVP que camundongos machos produzem trombos maiores do que as fêmeas27. Análise de nossos dados não revelou diferença substancial na prevalência de trombose entre ratos machos e fêmeas (Brill, não publicado). Portanto, pesquisadores são incentivados a realizar experimentos usando o modelo de estenose de veia cava inferior em ratos de ambos os sexos.
Desvendar de suturas e/ou grampos pode não ser descartada especialmente em experiências de tempo (uma semana e mais). Assim, os ratos devem ser verificados pelo menos duas vezes por dia especificamente para integridade de sutura e uma atenção especial deve ser dada ao aparecimento de vestígios de sangue na roupa de cama a gaiola.
Note que, como qualquer outro modelo animal, estenose da veia cava inferior tem suas limitações em termos de tradução para os seres humanos. Por exemplo, IVCs murino não possuem válvulas, Considerando que a TVP humana se desenvolve dentro de válvulas venosas. Além disso, os seres humanos têm orientação vertical da coluna vertebral com a bomba muscular, sendo um importante mecanismo de aceleração do fluxo sanguíneo nas veias. Em contraste, os ratos têm orientação na coluna horizontal com nenhuma função da bomba muscular em apoiar o sangue de retorno ao coração. Essas limitações devem ser consideradas ao traduzir os dados do mouse para a doença humana.

Trombose venosa profunda (TVP) é o desenvolvimento de trombos em veias profundas, geralmente (mas não só) nas pernas. Em conjunção com embolia pulmonar (PE; designado juntos como tromboembolismo venoso, TEV) se desenvolve em aproximadamente 900.000 americanos anualmente e representa um problema grave para a saúde e o problema econômico1,2. PE, uma complicação da TVP, ocorre quando um trombo fica isolado de sua localização inicial e atinge os pulmões, o que podem causar morte e insuficiência respiratória. O número de mortes de VTE excede a mortalidade por AIDS, acidentes de tráfego e câncer de mama, combinado3.
O principal fator causando a TVP, além de conhecidas razões, tais como câncer ou trauma, é a falta de mobilidade 4,5. Isto pode resultar de cirurgia (especialmente ortopédica), paralisia, voos de longa distância ou outros motivos. Fluxo de sangue nas veias depende da bomba muscular e, portanto, resultados de imobilização do membro no sangue estagnado fluem nas válvulas venosas, que leva a trombose. O objetivo do método aqui descrito é recapitular tal sangue fluxo distorção6,7. Restrição parcial do fluxo na veia cava inferior (VCI) imita condições criadas em válvulas venosas humanas e resulta na formação de um trombo estrutura semelhantes à de trombos humana6. A grande parte de um trombo é vermelho e consiste em hemácias, fibrina e incorporação de plaquetas. Trombos tenham uma pequena "parte branca" enriquecida em plaquetas (Figura 1), que se assemelham a "linhas de Zahn" descritas no humanos trombos venosos. Ambas as partes do trombo também contenham neutrófilos8, que estão entre as primeiras células a ser recrutado no local do trombo futuro6,9. Neutrófilos na parte vermelha expulsar neutrófilos armadilhas extracelulares (redes), Considerando que os neutrófilos na parte branca parecem ser desprovido de redes8. Da mesma forma humana TVP, trombose em ratos é acompanhada de níveis de D-dímero elevado plasma (Figura 2). Heparina de baixo peso molecular (Enoxaparina), usada para profilaxia de TVP em pacientes, também previne trombose em ratos. Uma importante vantagem deste método é a ausência de denudação endotelial9, que é característica do humano TVP10. Esta característica torna estenose de veia cava inferior em um modelo mais clinicamente relevante da TVP do que, por exemplo, a indução da trombose por cloreto férrico, que induz a denudação endotelial e no qual trombos consistem predominantemente de plaquetas11, 12,13. Um modelo de estase completa na veia cava inferior é preferido por várias equipes14,15,16. Em contraste com estenose, em que o fluxo residual é mantido no vaso, aplicação do êstase interrompe completamente o fluxo e, portanto, limita a acessibilidade das substâncias sistemicamente administradas ao site da trombose. Além disso, parece que os mecanismos subjacentes a trombose induzida por estenose e estase são diferentes: estenose resulta no desenvolvimento de inflamação local (ativação do endotélio, liberação do conteúdo do corpo de Weibel-Palade, recrutamento de células do sistema imunológico e as plaquetas à parede do vaso) causar "immunothrombosis"6,9,17, Considerando que a estase parece induzir bastante trombose baseia, em particular, fator tecidual e outra coagulação e mecanismos relacionados com fibrinólise18,19,20. Assim, os modelos de estenose e estase refletem ligeiramente diferentes aspectos do desenvolvimento do trombo venoso, embora seus mecanismos certamente podem se sobrepor. Modelo IVC eletrolítico (EIM) de TVP21,22 induz um trombo obstruindo parcialmente a parede do vaso. Portanto, é conveniente para testar os efeitos da administração sistêmica de diferentes drogas no crescimento do trombo. Esse modelo, no entanto, assume o rompimento da integridade da parede da veia cava inferior (inserção de uma agulha) e indução da trombose por corrente elétrica, tornando a relevância deste mecanismo fisiopatológico pelo menos discutível.

<table style="border-collapse:collapse;width:536pt" width="715">
	<colgroup>
		<col style="width:162pt" width="216" />
		<col style="width:160pt" width="213" />
		<col style="width:89pt" width="119" />
		<col style="width:125pt" width="167" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">C57BL/6 mice</td>
			<td class="xl63" style="width:160pt" width="213">Charles River</td>
			<td class="xl63" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl66" style="width:125pt" width="167">8 - 10 weeks old, bothe genders</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">Scissors</td>
			<td class="xl63" style="width:160pt" width="213">WPI</td>
			<td align="right" class="xl63" style="width:89pt" width="119">15922</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">Scissors</td>
			<td class="xl63" style="width:160pt" width="213">WPI</td>
			<td align="right" class="xl63" style="width:89pt" width="119">14003</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">Dumont 5/45 forceps</td>
			<td class="xl63" style="width:160pt" width="213">FST</td>
			<td class="xl63" style="width:89pt" width="119">11251-35</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">7-0 Prolene suture</td>
			<td class="xl63" style="width:160pt" width="213">Ethicon</td>
			<td class="xl63" style="width:89pt" width="119">W8725</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">6-0 Vicryl suture</td>
			<td class="xl63" style="width:160pt" width="213">Ethicon</td>
			<td class="xl63" style="width:89pt" width="119">W9981</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">Cotton buds</td>
			<td class="xl63" style="width:160pt" width="213">Spar</td>
			<td class="xl63" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">Millswabs sterile&#160;</td>
			<td class="xl63" style="width:160pt" width="213">Millpledge veterinary&#160;</td>
			<td align="right" class="xl63" style="width:89pt" width="119">611950</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">Drapes</td>
			<td class="xl67">Kruuse</td>
			<td align="right" class="xl63" style="width:89pt" width="119">141765</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">Glucose Saline-Aqupharm3</td>
			<td class="xl67">Animal Care</td>
			<td class="xl63" style="width:89pt" width="119">XVD589</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="46" style="height:34.5pt">
			<td class="xl63" height="46" style="width:162pt;height:34.5pt" width="216">Clear H20 HydroGel 98% sterile water&#160;</td>
			<td class="xl67">Clearh2o</td>
			<td class="xl63" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">Buprenorphine</td>
			<td class="xl67">National Veterinary Supplies</td>
			<td class="xl63" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">Isoflurane vaporizer</td>
			<td class="xl67">General Anaesthetic Services</td>
			<td class="xl63" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl63" height="42" style="width:162pt;height:31.5pt" width="216">IsoFlo 100% W/W inhalation vapour, liquid</td>
			<td class="xl63" style="width:160pt" width="213">National Veterinary Supplies</td>
			<td class="xl63" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">Sterilizer Steri350</td>
			<td class="xl63" style="width:160pt" width="213">Inotech</td>
			<td class="xl63" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:162pt;height:15.75pt" width="216">Microscope Olympus SZX10</td>
			<td class="xl63" style="width:160pt" width="213">Olympus</td>
			<td class="xl63" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stenosis of the inferior vena cava: a murine model of deep vein thrombosis

Profunda veia trombose (TVP) e sua complicação devastadora, embolia pulmonar, são um problema de saúde grave, com alta mortalidade. Mecanismos de formação de trombos nas veias permanecem obscuros. Falta de mobilidade (por exemplo, após cirurgia ou voos de longa distância) é um dos principais fatores levando a TVP. As consequências fisiopatológicas da falta de mobilidade é a estagnação do fluxo de sangue nas válvulas venosas. Aqui, um modelo é descrito que imita tais perturbações de fluxo como um fator de trombose-condução. Neste modelo, a restrição de fluxo parcial (estenose) na veia cava inferior (VCI) é criada. Encerramento de cerca de 90% do lúmen da veia cava inferior para 48 h resulta no desenvolvimento de trombos estruturalmente semelhantes dos seres humanos. As semelhanças são: i) a maior parte do volume do trombo é vermelho, ou seja, consiste de células vermelhas do sangue e fibrina, ii) a presença de uma parte branca (linhas de Zahn), iii) não-desnudada monocamada endotelial, iv) elevado D-dímero plasmático e v) a possibilidade de evitar trombose por heparina de baixo peso molecular. Limitações incluem tamanho variável de trombos e o fato de que uma determinada percentagem do selvagem-tipo ratos (0 - 35%) pode não produzir um trombo. Além da observação visual e medição, trombos podem ser visualizados por tecnologias não invasivas, tais como a ultra-sonografia, que permite o monitoramento da dinâmica do desenvolvimento do trombo. Em pontos de tempo mais curtos (1-6 h), microscopia intravital pode ser aplicada para observar diretamente eventos (por exemplo, recrutamento de células da parede do vaso) precedendo a formação de trombos. Uso desse método por várias equipes em todo o mundo permitiu descobrir os mecanismos básicos de iniciação de TVP e identificar alvos em potencial que podem ser benéficos para a sua prevenção.

Aqui, um modelo da TVP induzida pela distorção de fluxo na veia cava inferior é descrito. Indução de estenose no IVC inicia distorção e estagnação do fluxo sanguíneo e depois de um tempo (no caso, 48 h) resulta no desenvolvimento de um trombo, DVT estruturalmente semelhante ao ser humano trombos (Figura 1A). A presença de um trombo dentro da veia cava inferior é facilmente detectável visualmente (Figura 1B). Uma semelhança importante entre o modelo e a TVP humana é níveis de D-dímero elevado plasma (Figura 2). D-dímero é um produto de degradação da fibrina e sua presença no sangue sugere que um processo trombótico ativo está acontecendo.
O modelo é apresentado passo a passo na Figura 3A C. A veia cava inferior é cuidadosamente exposta, é feito um buraco entre a veia cava inferior e a aorta e uma sutura (Prolene 7-0) é puxada através do orifício por baixo a veia cava inferior. Então a veia cava inferior é ligada por sutura sobre um espaçador (agulha 30G, Figura 3D), depois que o espaçador é removido. Este procedimento permite que cerca de 90% fechamento do lúmen do IVC, deixando os restantes 10% patente. Isso garante a estagnação do fluxo de sangue levando a trombose.
A Figura 4 demonstra a grande desvantagem do modelo, de tamanho variável de trombo. Todos estes trombos foram obtidos no mesmo experimento realizado em ratos masculinos tipo selvagem da mesma origem, idade e peso semelhante. Embora todos os ratos produzidos trombos (prevalência de trombose de 100%), seu tamanho varia claramente em uma escala larga.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56697/56697fig1.jpg"> 
Figura 1: Representante trombo após restrição/estenose de 48 h. (A), um típico trombo após 48 h IVC estenose. Nota vermelha (enriquecido em células vermelhas do sangue) e branco (enriquecido em plaquetas) peças. Veia cava inferior (B) com (esquerda) ou sem (direita) um trombo. Escala de barras = 2 mm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56697/56697fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56697/56697fig2.jpg"> 
Figura 2 : Elevados níveis de plasma D-dímero após aplicação de estenose de veia cava inferior. Os ratos foram submetidos a estenose de veia cava inferior. Sangue foi tirada em pontos de tempo indicado, 1:9 estabilizado com citrato de sódio 3,8%, plasma foi preparado por centrifugação (2.300 x g, 5 min) e os níveis de dímero-D foram determinados por um kit de ELISA de acordo com as instruções do fabricante. Círculos designar operação ratos, cruzes designar estenose de veia cava inferior. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56697/56697fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56697/56697fig3.jpg"> 
Figura 3: Fluxo de restrição/estenose no modelo de veia Cava Inferior (VCI) de DVT em camundongos. Etapas consecutivas do modelo são apresentadas. (A) um buraco entre a veia cava inferior e a aorta é feito e uma sutura é puxada através dele em torno da veia cava inferior. (B) um nó é fechado por um espaçador (agulha 30G). (C) o espaçador é removido: a vista final que o cirurgião vê antes de fechar o mouse. A linha tracejada amarela demarca a veia cava inferior. LRV representa a veia renal esquerda. Escala de barras = 0,2 mm. (D) o espaçador (agulha 30G). Escala de barras = 2 mm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56697/56697fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56697/56697fig4.jpg"> 
Figura 4 . Variabilidade do tamanho do trombo. Os ratos foram submetidos a estenose de veia cava inferior de 48 h. Apresentados são trombos obtidos no mesmo experimento. Barras de escala 2mm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56697/56697fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis

Descrevemos aqui estenose na veia cava inferior como um modelo murino de trombose venosa profunda. Este modelo recapitula a restrição do fluxo de sangue, um dos principais gatilhos de trombose venosa em seres humanos.

Estenose da veia Cava Inferior: um modelo murino de trombose venosa profunda

Deep vein thrombosis (DVT) and its devastating complication, pulmonary embolism, are a severe health problem with high mortality. Mechanisms of thrombus ...

stenosis-inferior-vena-cava-murine-model-deep-vein

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.7K visualizações.  University of Birmingham. Descrevemos aqui estenose na veia cava inferior como um modelo murino de trombose venosa profunda. Este modelo recapitula a restrição do fluxo de sangue, um dos principais gatilhos de trombose venosa em seres humanos.

Vídeo: Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

Modelo murino de CD40-ativação de células B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Imunologia e Infecção

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Indução de enxerto-versus-hospedeiro de Doenças e<em&gt; Em Vivo</em&gt; Monitoramento celular T Usando um modelo murino de MHC de correspondência

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Murine Model of Allergen Induced Asthma

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, with the prevalence increasing.2 As with other diseases, animal models of allergic airway disease greatly facilitate understanding of the underlying pathophysiology, help identify potential therapeutic targets, and allow preclinical testing of possible new therapies. Models of allergic airway disease have been developed in several animal species, but murine models are particularly attractive due to the low cost, ready availability, and well-characterized immune systems of these animals.3 Availability of a variety of transgenic strains further increases the attractiveness of these models.4 Here we describe two murine models of allergic airway disease, both employing ovalbumin as the antigen. Following initial sensitization by intraperitoneal injection, one model delivers the antigen challenge by nebulization, the other by intratracheal delivery. These two models offer complementary advantages, with each mimicking the major features of human asthma.5
The major features of acute asthma include an exaggerated airway response to stimuli such as methacholine (airway hyperresponsiveness; AHR) and eosinophil-rich airway inflammation. These are also prominent effects of allergen challenge in our murine models,5,6 and we describe techniques for measuring them and thus evaluating the effects of experimental manipulation. Specifically, we describe both invasive7 and non-invasive8 techniques for measuring airway hyperresponsiveness as well as methods for assessing infiltration of inflammatory cells into the airways and the lung. Airway inflammatory cells are collected by bronchoalveolar lavage while lung histopathology is used to assess markers of inflammation throughout the organ. These techniques provide powerful tools for studying asthma in ways that would not be possible in humans.

Experimental mouse models of allergic asthma offer new possibilities for studying disease pathogenesis and developing new therapeutics. These models are well suited to measuring factors governing the allergic immune response, airway inflammation, and pulmonary pathophysiology.

Modelo murino de asma induzida alergénio

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

Measurement of Tactile Allodynia in a Murine Model of Bacterial Prostatitis

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently shown that UPEC have an important role in the initiation of chronic pelvic pain2, a feature of Chronic prostatitis/Chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS)3,4. Infection of the prostate by clinically relevant UPEC can initiate and establish chronic pain through mechanisms that may involve tissue damage and the initiation of mechanisms of autoimmunity5.
A challenge to understanding the pathogenesis of UPEC in the prostate is the relative inaccessibility of the prostate gland to manipulation. We utilized a previously described intraurethral infection method6 to deliver a clinical strain of UPEC into male mice thereby establishing an ascending infection of the prostate. Here, we describe our protocols for standardizing the bacterial inoculum7 as well as the procedure for catheterizing anesthetized male mice for instillation of bacteria.
CP/CPPS is primarily characterized by the presence of tactile allodynia4. Behavior testing was based on the concept of cutaneous hyperalgesia resulting from referred visceral pain8-10. An irritable focus in visceral tissues reduces cutaneous pain thresholds allowing for an exaggerated response to normally non-painful stimuli (allodynia). Application of normal force to the skin result in abnormal responses that tend to increase with the intensity of the underlying visceral pain. We describe methodology in NOD/ShiLtJ mice that utilize von Frey fibers to quantify tactile allodynia over time in response to a single infection with UPEC bacteria.

Infection of the prostate may be a contributing factor in mediating pelvic pain in chronic prostatitis. We describe the procedure for preparation of standardized bacterial inoculum, instillation of bacteria into the urethra of male mice and methodology for measuring tactile allodynia in mice over time.

Medição da alodinia táctil em um modelo murino de prostatite bacteriana

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Um modelo murino de Grupo B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Colonização Vaginal

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography

Venous thrombosis is a common condition affecting 1 - 2% of the population, with an annual incidence of 1 in 500. Venous thrombosis can lead to death through pulmonary embolism or results in the post-thrombotic syndrome, characterized by chronic leg pain, swelling, and ulceration, or in chronic pulmonary hypertension resulting in significant chronic respiratory compromise. This is the most common cardiovascular disease after myocardial infarction and ischemic stroke and is a clinical challenge for all medical disciplines, as it can complicate the course of other disorders such as cancer, systemic disease, surgery, and major trauma.
Experimental models are necessary to study these mechanisms. The stasis model induces consistent thrombus size and a quantifiable amount of thrombus. However, it is necessary to systematically ligate side branches of the inferior vena cava to avoid variability in thrombus sizes and any erroneous data interpretation. We have developed a non-invasive technique to measure thrombus size using ultrasonography. Using this technique, we can assess thrombus development and resolution over time in the same animal. This approach limits the number of mice required for quantification of venous thrombosis consistent with the principle of replacement, reduction, and refinement of animals in research. We have demonstrated that thrombus weight and histological analysis of thrombus size correlate with measurement obtained with ultrasonography. Therefore, the current study describes how to induce deep vein thrombosis in mice using the inferior vena cava stasis model and how to monitor it using high frequency ultrasound.

The present protocol describes the steps to obtain venous thrombosis using a stasis model. In addition, we are using a non-invasive method to measure thrombus formation and resolution over time.

Trombose venosa profunda induzida por estase em camundongos monitorado por ultra-sonografia de alta frequência

Venous thrombosis is a common condition affecting 1 - 2% of the population, with an annual incidence of 1 in 500. Venous thrombosis can lead to death ...

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily lead to infections in the dermis which can, in turn, result in the dissemination of pathogens into the bloodstream. Understanding how the immune system fights infections at the very early stage and how the host can eliminate the pathogens is an important step to set the base for future therapeutic interventions. Here we describe a model of Candida albicans infection that can visualize the processes that occur early during an infection, including when the pathogen has passed the epithelial barrier, as well as the immune response elicited by the C. albicans invasion. We used this infection model to perform histological analyses that show the immune cells that infiltrate the skin as well as the presence and localization of the pathogen. Samples collected after the infection can be processed for RNA extraction.

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Here we describe a protocol that allows histological and molecular analysis of skin samples after Candida albicans intradermal injection. This protocol maintains the structural integrity of the skin and allows for the localization of tissue-resident or newly recruited immune cells as well as the pathogen distribution.

Profunda dérmica injeção como um modelo de Candida albicans de infecção da pele para análise histológica

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various pathologies such as cancer, atherosclerosis and diabetes. We have previously shown that dysfunction of the Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2)/ Kelch-like erythroid cell-derived protein 1 (Keap1) signaling pathway leads to extreme ROS imbalance during cutaneous wound healing in diabetes. Since ROS levels are an important indicator of progression of wound healing, specific and accurate quantification techniques are valuable. Several in vitro assays to measure ROS in cells and tissues have been described; however, they only provide a single cumulative measurement per sample. More recently, the development of protein-based indicators and imaging modalities have allowed for unique spatiotemporal analyses. L-012 (C13H8ClN4NaO2) is a luminol derivative that can be used for both in vivo and in vitro chemiluminescent detection of ROS generated by NAPDH oxidase. L-012 emits a stronger signal than other fluorescent probes and has been shown to be both sensitive and reliable for detecting ROS. The time lapse applicability of L-012-facilitated imaging provides valuable information about inflammatory processes while reducing the need for sacrifice and overall reducing the number of study animals. Here, we describe a protocol utilizing L-012-facilitated in vivo imaging to quantify oxidative stress in a model of excisional wound healing using diabetic mice with locally dysfunctional Nrf2/Keap1.

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

We describe a non-invasive in vivo imaging protocol that is streamlined and cost-effective, utilizing L-012, a chemiluminescent luminol-analog, to visualize and quantify reactive oxygen species (ROS) generated in a mouse excisional wound model.

Na Vivo Imagens de espécies reativas de oxigênio em um Murine ferida modelo

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

Digestão do fígado murino para um fluxo Cytometric análise de células endoteliais linfáticas

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically modified strains, the vast number of analyses that can be performed on harvested soft and hard tissues. However, many of these systems are subject to procedural criticisms. As an alternative, the ligature-induced model of periodontal disease, driven by the localized development and retention of a dysbiotic oral microbiome, can be employed, which is rapidly induced and relatively reliable. Unfortunately, the variants of ligature-induced murine periodontitis protocol are isolated to focal regions of the periodontium and subject to premature avulsion of the installed ligature. This minimizes the amount of tissue available for subsequent analyses and increases the number of animals required for study. This protocol describes the precise manipulations required to place extended molar ligatures with improved retention and usage of a novel rinse technique to recover oral neutrophils in mice with an alternative approach that mitigates the aforementioned technical challenges.

This article presents a protocol for establishing a ligature-induced model of murine periodontitis involving multiple maxillary molars, resulting in larger areas of the involved gingival tissue and bone for subsequent analysis as well as reduced animal usage. A technique to assess oral neutrophils in a manner analogous to human subjects is also described.

Modelo robusto induzido por ligadura de periodontite de murine para a avaliação de neutrófilos orais

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically ...

Estenose da veia Cava Inferior: um modelo murino de trombose venosa profunda

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