A facilidade de imagem in vivo no Imperial College foi financiado pelo MRC.

1. Ratos Preparação <ol><li> Comprar ou produzir o suficiente 18-20 g camundongos C57BL/6J necessários para o estudo. </li><li> Se os ratos são comprados de um fornecedor externo, seguindo o transporte para a instalação, habituar camundongos por 1 semana em comida autoclavado e água para estabilizar a microbiota intestinal. </li><li> Pesam-se, orelha de gama, e separar o número necessário de ratinhos por gaiola. </li><li> No dia anterior à infecção, antes de executar qualquer anestesia, verificar se existe isoflurano e oxigénio adequado para a duração do processo. Se necessário, adicione mais isofluorano ou substituir o cilindro de oxigênio. Em seguida, verifique o peso dos catadores anestésicos, se eles ganharam mais de 50 g desde a sua primeira utilização, descartá-las e substituir com catadores frescos. </li><li> Anestesiar ratos utilizando 3% isoflurano na XGI-8 Sistema de Anestesia e depilar usando Veet para 7 min. </li><li> Notas: <ul><li> Depilação completa é essencial, especialmente emcamundongos negros como melanina na pele atenua significativamente o sinal bioluminescente 3,15. </li><li> Depilação de ratos geralmente dura 8-10 dias antes da pele começa a regredir. Para realizar imagem multimodalidade 4D durante períodos mais longos, depilar ratinhos quando necessário de modo a que a área de interesse está nu para as sessões de imagem. </li><li> Ratos estão alojados em um Nível de Biossegurança 2 (NB-2) instalação de confinamento. </li></ul></li></ol> 2. Preparação celular bacteriana <ol><li> Prepara suficiente Burtani caldo Luria e placas de agar suplementadas com canamicina [50 ug mL-1] necessária para o estudo e armazenar a 4 ° C até ser necessário. </li><li> O dia antes da infecção descongelar um criotubo de C. rodentium estirpe ICC180 e imediatamente adicionar um cryobead para 15 ml de caldo LB suplementado com canamicina [50 ug mL-1] e cultura durante a noite a 220 rpm, 37 ° C. Como controle de contaminação médio, preparar um adicionalinocular 15 ml de caldo LB suplementado com canamicina [50 ug mL-1] e da cultura a 220 rpm, 37 ° C. </li><li> Na manhã seguinte (~ 16 horas), verifique o controlo do meio para turbidez como um sinal de crescimento bacteriano. Se o controle é clara, transferir a cultura ICC180 para um tubo falcon e centrifugar a 4.000 rpm. Subsequentemente, lavar o sedimento bacteriano em PBS. Em seguida, ressuspender em 1,5 mL de PBS (1/10 th do volume original de LB suplementado com canamicina) e misturar completamente para criar o inoculo bacteriano. </li><li> Para verificar se ICC180 foi cultivado de forma adequada e é bioluminescente antes da infecção dos camundongos, a imagem do inóculo no IVIS Spectrum CT usando BLI ea configuração automática do assistente Viver 4.3.1 Imagem como descrito anteriormente 1. Nota: <ul><li> Strain ICC180 é um derivado bioluminescente do tipo selvagem C. rodentium ICC169 2. Esta estirpe bacteriana tem o operão lux CDABE incluindo um Kgene de resistência anamycin inserido um pseudogene de xylE no cromossoma 2. </li><li> Realizar todas cultura bacteriana utilizando técnicas assépticas standard e, se necessário ou comprar consumíveis / reagentes estéreis ou autoclave antes de usar. </li><li> No passo 2.4, a leitura de bioluminescência (p / s / cm 2 / SR) pode ser utilizado para estimar o número de bactérias antes da infecção dos ratinhos. </li></ul></li></ol> 3. Infecção de camundongos com Bioluminiscente C. rodentium e Avaliação da colonização bacteriana <ol><li> Antes da infecção, verificar se existe isoflurano e oxigénio adequado para a duração do processo. Se necessário, adicione mais isofluorano ou substituir o cilindro de oxigênio. Em seguida, verifique o peso dos catadores anestésicos, se eles ganharam mais de 50 g desde a sua primeira utilização, descartá-las e substituir com catadores frescos. </li><li> Camundongos anestesiar com 3% isoflurano usando um XGI-8 AnaestheSistema sia para proporcionar retenção humano. </li><li> Misture o inoculo bacteriano e desenhar cuidadosamente 0,2 ml (aproximadamente 5 x 10 9 ufc ICC180) para dentro da seringa. </li><li> Remover camundongos do sistema de anestesia um de cada vez e nuca deles, segurando firmemente a pele atrás do pescoço com o polegar eo indicador. </li><li> Empurrar a agulha de gavagem para o telhado da boca, sobre a lingueta, e para baixo do esófago e injectar o inoculo bacteriano para o estômago. </li><li> Após sonda oral dos ratos, acompanhar a sua marcha e respiração por sinais de sofrimento que pode ser um sinal de que o inóculo bacteriano foi entregue para os pulmões. Eutanásia quaisquer ratinhos que foram inoculados nos pulmões. </li><li> Ratinhos não infectados gavagem com 200 ul de PBS como um controle de veículos, tal como descrito nos passos de 3,1-3,6. </li><li> Para confirmar que a sonda oral foi realizada corretamente, imagem camundongos infectados infectados e simulada no IVIS Spectrum CT usando BLI ea configuração automática no the LivingAssistente 4.3.1 imagem como descrito anteriormente 1. </li><li> Determinar os números de bactérias viáveis ​​no inoculo por diluição em série em PBS e manchas em triplicado em agar LB suplementado com canamicina [50 ug mL-1]. </li><li> Calcular a quantidade de ICC180 ufc / mL, encontrando uma diluição onde existem aproximadamente 5-50 colónias e contar o número de colónias a partir de cada ponto de diluição em que a diluição e registar que as colónias foram contadas no. Subsequentemente, calcular o número médio de ufc (a partir de três pontos) e multiplicando este valor pelo factor de diluição de 50 (cada ponto é de 20 ul de 1 ml da amostra original) e à diluição das colónias foram contadas no, dando ufc / ml. </li><li> Monitorar a colonização dos ratinhos diariamente, recolhendo as fezes de cada ratinho, para um tubo de Eppendorf de pré-pesado (pesado num equilíbrio fino) e dilui-se de 1/10 em PBS com base no peso da amostra (0,1 g ml -1). </li><li> Determinar os números de bactérias viáveis ​​emas fezes por diluição em série em PBS e manchas em triplicado em placas de agar LB suplementado com canamicina [50 ug mL-1]. </li><li> Calcular o número de bactérias viáveis ​​por grama de fezes seguindo o passo 3.9, em seguida, multiplicar o número de ufc / mL pelo factor de diluição fecal em PBS (passo 3.10) de 0,1 g ml -1 para dar ufc / g. </li><li> Para determinar se os ratinhos foram inoculados com uma cultura pura ICC180 e que todas as colónias são bioluminescente. Tome as placas de ágar da Etapa 3.8, avaliar a morfologia da colônia bacteriana ou por olho ou escolher uma colônia representante da chapa e analisar por microscopia de luz. Se necessário, a identificação de bactérias pode ser realizada pela tensão de colónias de PCR específico para avaliar a pureza da cultura. Subsequentemente, as placas de imagem no IVIS Espectro de CT utilizando BLI como descrito no passo 3.7 e verificar que 100% das colónias na placa são bioluminescente. Notas: <ul><li> No passo 3.4, ao inserir a agulha gavage, Se você sentir resistência, não forçar a agulha gavage, pois isso faz com que o inóculo para ir para os pulmões. Em vez disso, volte a inserir a agulha e tente novamente suavemente. </li><li> Passo 3.1 é opcional e camundongos pode ser oral gavaged sem anestesia, dependendo da política de bem-estar animal institutos. </li><li> Fezes devem ser semeadas no dia em que eles são coletados. C. rodentium vai crescer até se deixado a 4 ° C durante a noite em PBS, e fará com que a quantificação de CFU / g de fezes de estar incorrecta. </li></ul></li></ol> 4. Diário Composite luz difusa tomografia 3D com μCT Imagem (DLIT-μCT) de camundongos infectados Considerações de bem-estar animal: DLIT-μCT envolve imageamento óptico DLIT integrado com um rápido, de baixo dose de radiação μCT digitalização (~ 23 mGy para uma varredura duas mouse, ~ 53 mGy para uma única varredura mouse) de um animal imobilizado. Esta dose acumula com cada sessão de imagem, de modo que o objectivo é manter a dose como low quanto possível (e sempre bem abaixo da DL 50/30) enquanto ainda a realização do estudo. Em alguns casos, se não houver nenhum sinal de infecção num BLI analise convencional de ratos, a verificação μCT pode ser evitada para minimizar ainda mais a dose. Embora a dose é mantida tão baixa quanto possível, de prolongados estudos se houver alguma preocupação com a exposição à radiação, os ratos serão sacrificados ao primeiro sinal de sintomas prejudiciais ou no final do período de imagiologia μCT. <ol><li> Antes de imagem, inicializar o IVIS Spectrum CT e verifique se as travas de segurança de raios-X estão funcionando e que o estágio é aquecida na temperatura correta (37 ° C) para a imagem latente. Posteriormente, a verificar o nível de isoflourane no sistema de anestesia e o peso dos captadores anestésicos. Se necessário, adicione mais isofluorano e se os catadores ganharam mais de 50 g desde a sua primeira utilização, descartá-las e substituir com catadores frescos. </li><li> Configure o Spectrum CT para que os parâmetros de imagem queexecutar o recurso de exposição automática na Vida 4.3.1 Imagem são otimizados para luciferase bacteriana imagem. Selecione Editar&gt; Preferências&gt; Aquisição e janela de exposição automática. Em seguida, selecione&gt; Faixa de Valores&gt; Exp. Tempo (em segundos) e definir a&gt; Max. para 300s. Por fim, selecione&gt; Alvo Count (mínimo)&gt; luminescente e definido para 10.000 pontos. </li><li> Insira a uma plataforma de imagem mouse na Spectrum CT e prumo lo na anestesia. </li><li> Ligue o raio-X de segurança de bloqueio e inicializar os IVIS. </li><li> Uma vez que o IVIS Spectrum CT foi inicializado, anestesiar os ratos com 3% de isofluorano usando um XGI-8 Anestesia sistema para proporcionar retenção humano. </li><li> Para determinar se é necessário realizar uma varredura DLIT-μCT, pré-imagem dos camundongos usando BLI como descrito anteriormente 1, em uma plataforma de imagem mouse. Se um sinal robusto é obtido o mouse é adequado para imagens DLIT. Deixe o rato anestesiado em um rato imagem plataform após a verificação BLI pronto para DLIT-μCT. </li><li> Use o Assistente de Imagem na imagem viva 4.3.1 software para configurar a digitalização DLIT-μCT. O Assistente de Imagem determina automaticamente o FOV, tempo de exposição, F-stop e binning para o DLIT eo FOV, tempo de exposição, conjuntos de filtros e binning para a imagem μCT para dar a melhor relação sinal-ruído. Quando solicitado pelo Assistente Imaging, incluir apenas a 560, 580, 600 e 620 nm filtros de emissão e selecionar o rato varredura μCT. Em seguida, clique&gt; Adquirir para iniciar a imagem. </li><li> Retorne o rato anestesiado para sua jaula depois de imagem, remover o plataforma de imagem do rato do Spectrum CT e desinfectar com 1% Tri-gene. Se necessário, substituir a almofada de espuma que o rato é posicionado sobre a minimizar o risco de contaminação cruzada entre os ratos. </li><li> Imagem de ratinhos diariamente até ao dia 8 pós-infecção (PI) utilizando DLIT-μCT, como descrito nos passos 4,1-4,8, para gerar os dados de imagem longitudinais necessárias para fazer uma 4D movie de infecção. Nota: <ul><li> No passo 4.7, recomendamos o uso dos filtros de emissão de 560-620 nm para a bioluminescência bacteriana imagem. Embora o pico de bioluminescência é de cerca de 485 nm, devido à óptica de tecidos (a atenuação significativa do azul / verde fótons por tecidos de murino), que é importante para usar os fotões de laranja / vermelho para reconstruções 3D como facilitar o cálculo do sinal de profundidade . </li><li> As configurações de &#39;auto&#39; exposição em Viver 4.3.1 imagem para DLIT precisa ser ajustado para otimizar a quantidade de fótons capturados eo tempo máximo de imagem usado para cada conjunto de filtros. </li><li> É apenas necessário para realizar a pré-BLI imagiologia descrito no passo 4.6, quando o pesquisador não é certo se existe um sinal detectável bioluminescente, por exemplo, quando se utiliza um novo modelo de infecção. </li></ul></li></ol> 5. Reconstrução 3D de DLIT-μCT de imagem de dados <ol><li> Estar aberta 4.3.1 software de imagem e selecione&gt;, Navegar e abra a pasta que contém os arquivos DLIT-μCT. </li><li> Abra o arquivo DLIT-μCT em the Living Image Browser, por exemplo C. rodentium Dia 1 PI clicando em Load. </li><li> Na paleta de ferramentas selecione&gt; Superfície Topografia&gt; rato Nude, ajustar o limite, e, em seguida, clique em&gt; Gerar Superfície. Se a reconstrução da superfície é bem sucedido, um contorno da superfície será exibido na janela de visualização em 3D. </li><li> Para ver o scan μCT prestados na janela de visualização em 3D, esconder o contorno da superfície (Clique&gt; Ferramentas de óptica 3D e desmarque&gt; Tela objeto de superfície), ou diminuir a opacidade da superfície (Clique&gt; Ferramentas de óptica 3D e ajustar a&gt; opacidade barra deslizante). </li><li> Para fornecer a localização anatómica detalhada do DLIT reconstrução 3D, é necessário alterar os dados volumétricos μCT 3D (scan) de modo que apenas o esqueleto do rato é visível e que tem o contraste óptimo. Clique&gt; Ferramentas de multimodalidade 3D eo histograma select&gt; logarítmica, Gradient Iluminação, Qualidade e Denoise. Finalmente, ajuste o controle deslizante de Histograma para a direita e ver o 3D volumétrica de dados de alteração de contraste. Continue ajustando os dados até que apenas os ossos são claramente visíveis. Se desejar, altere a cor para os pontos de função de transferência no histograma. </li><li> Em seguida, selecione&gt; DLIT Reconstrução 3D na paleta de ferramentas e certifique-se de que apenas o 560, 580, 600 e 620 nm conjuntos de filtros, que são necessários para a luciferase bacteriana imagem in vivo, foram selecionados. Clique em&gt; Iniciar. O menu Janela de visualização de dados irá aparecer mostrando os sinais BL espectralmente filtrada a partir do rato que foi fotografada em 2D. Estes sinais são limiarizados automaticamente pelo software, mas pode ser ajustado manualmente, se necessário, utilizando guias na parte inferior do menu. O limiar para determinar a intensidade mínima de dados (representada como uma percentagem do sinal máximo na imagem) que irá ser incluído como dados na reconstrução. </li><li> Em seguida, selecione&gt; DLIT Reconstrução 3D na paleta de ferramentas e verifique se as propriedades ópticas utilizadas para a reconstrução DLIT estão corretas. Selecione&gt; guia Propriedades e certifique-se de que as configurações de propriedades do tecido é definido para o tecido mouse, Spectrum Origem está definida para bactérias. </li><li> Clique&gt; Reconstruir para executar a reconstrução DLIT. </li><li> Para gerar o DLIT-μCT 3D clique filme&gt; Ferramentas&gt; Animação 3D e selecione Opções&gt; preset Animações&gt; CCW eixo Y e&gt; Duração Total&gt; 10 segundos (25 quadros por segundo). Uma vez que as definições para a animação em 3D são imprensa correto&gt; Gravar e salvar as reconstruções 3D DLIT-μCT como. Avi marcados com experiência, grupo e tempo ponto em uma pasta separada. Nota: <ul><li> É importante ao realizar reconstruções em 3D de dados DLIT-μCT usar um PC com a vida 4.3.1 Imagem e um pacote de serviços instalados e que o PC tem uma placa de vídeo adequado para executar o software de imagem multi-modalidade. Thé um software pode ser baixado, e as especificações da GPU estão contidos nas notas de lançamento ( <a href="http://www.caliperls.com/support/software-downloads.htm" target="_blank">http://www.caliperls.com/support/software-downloads.htm</a> ). </li><li> Se as reconstruções 3D DLIT-μCT aparecer para trás depois de ter sido salvo, o seu computador está executando uma versão antiga do seu driver de gráficos e isso pode ser corrigido baixando uma atualização do site dos fabricantes. </li><li> Na etapa 5, apresentamos as nossas definições preferidas para gerar reconstruções 3D DLIT-μCT. No entanto, existem vários pontos durante as reconstruções em 3D, onde os parâmetros que não são discutidos neste protocolo podem ser modificados. Para um guia completo para reconstruções em 3D usando o 4.3.1 imagem viva por favor consulte o manual de instruções dos fabricantes. </li><li> É importante criar as reconstruções em 3D usando as configurações idênticas na ferramenta de imagem multi-modalidade para que eles sejam comparáveis. Além deisso, ao criar as reconstruções 3D DLIT-μCT, é importante para fazer os vídeos usando o mesmo número de quadros por segundo e duração total (comprimento), caso contrário, o calendário do vídeo 4D não é homogênea. </li></ul></li></ol> 6. Geração de um filme 4D de C. Infecção rodentium <ol><li> Claramente rotular todas as reconstruções 3D DLIT-μCT com a experiência correta, ponto de tempo e de grupo em uma pasta de fácil acesso. </li><li> Crie um novo arquivo no Windows Live Movie fabricante e inserir as reconstruções DLIT-μCT em ordem cronológica, desde o dia 1 PI utilizando a guia ferramentas da pasta preparada no passo 6.1. </li><li> Adicionar legendas para o início de cada vídeo que descreve o ponto de tempo, por exemplo Dia 1 PI, selecionando o vídeo DLIT-μCT apropriado e, em seguida, selecione Home&gt; Adicionar legenda. Uma caixa de texto aparecerá na tela, onde a legenda apropriada é adicionado. Ajuste o tamanho da fonte, estilo, cor e justificação como desired usando guias idênticas para o Microsoft Word na barra de ferramentas do software. Finalmente, mover a legenda para o canto superior esquerdo do vídeo. </li><li> Repita o passo 7.3 para todos os vídeos DLIT-μCT. </li><li> Adicionar uma página de título, por exemplo C. rodentium dias após a infecção 1-8 clicando Início&gt; título. Uma caixa de texto aparecerá na tela onde o título apropriado é adicionado a um slide em branco. Ajuste o tamanho da fonte, estilo, cor e justificação como desejado usando abas idênticas para o Microsoft Word na barra de ferramentas do software. </li><li> Salve o projeto como um projeto movie maker * MMP em uma pasta apropriada com o título do filme. Este passo é essencial se você quiser alterar o filme. </li><li> Salve o filme como um arquivo WMV.. Clique no menu Movie Maker&gt; Salvar filme&gt; para computador. </li><li> Converter o arquivo movie maker usando um conversor de arquivo. Avi ou outro tipo de arquivo adequado compatível com o computador. Notas: <ul><li> Recomenda-se que os filmes 4Dsão gerados em um PC com o Windows Live Movie Maker instalado ( <a href="http://windows.microsoft.com/en-GB/windows7/products/features/movie-maker" target="_blank">http://windows.microsoft.com/en-GB/windows7/products/features/movie-maker</a> ) e um bom programa de multi-mídia capaz de reproduzir. wmv ou. avi tipos de arquivos. </li></ul></li></ol>

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Produção e acesso gratuito a este artigo é patrocinado pela PerkinElmer. Os autores Kevin P, Francis, Jeff Meganck e Chaincy Kuo são funcionários da Caliper-A PerkinElmer Company. Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com os procedimentos científicos Animals Act 1986 e foram aprovados pelo comitê de ética local.

O filme 4D de infecção bacteriana fornece uma ferramenta útil para visualizar e interpretar grandes quantidades de dados de imagem multi-modalidade com rapidez e facilidade. Esta técnica facilita a análise pormenorizada de como uma infecção se espalha por meio de um rato individual e pode ser utilizado para investigar a forma como a eliminação de hospedeiro ou de genes bacterianos ou estratégias de intervenção particular, efeito da carga bacteriana, distribuição e localização durante um estudo longitudinal 7. Estes vídeos também fornecem materiais didáticos úteis e um meio de divulgação de informações ao público. Existem vários passos críticos neste protocolo que poderiam afectar a qualidade dos dados obtidos a partir de DLIT-μCT imagem e a capacidade para elaborar um vídeo 4D da infecção. A parte mais importante deste protocolo é a infecção bem sucedida e homogênea de ratos com C. rodentium. É essencial que os ratinhos usados ​​para o estudo são entre 18-20 g e que o bactericidariais inóculos são preparados e cerca de 5 x 10 9 ufc, como descrito anteriormente 2,3. Antes da infecção dos ratos, é importante verificar que o inoculo é bioluminescente utilizando o Espectro de CT e uma vez que o inóculo foi preparado, tem de ser continuamente homogeneizada antes de cada rato é gavaged para assegurar que os ratos recebem doses infecciosas semelhantes. A imagem DLIT-μCT de camundongos foi otimizado para que a função de exposição automática no software 4.3.1 imagem viva determina automaticamente os parâmetros de imagem otimizado para o sinal de estar bem acima do ruído. No entanto, a função de auto-exposição depende de configurações definidas pelo utilizador e os parâmetros que devem ser modificados tal como descrito no procedimento. Não fazer isso irá resultar em imagens de baixa com um baixo número de fótons coletados que não resultar em uma progressão evidente na infecção, como as configurações de fábrica do Spectrum CT para auto-exposição estão programados para os tumores de imagem expressandofirefly luciferase. Reconstruções realizadas utilizando 560-620 nm dar o melhor acordo entre os dados medidos e simulados e, portanto, são os dados mais confiáveis ​​para incluir na reconstrução. Uma limitação para a utilização de DLIT-μCT é que a radiação ionizante a partir da analise μCT provoca danos de radiação sub-letais, que é cumulativa ao longo de um estudo longitudinal 18. Exposição de radiação sub-letal pode enfraquecer a resposta imune, causar danos no ADN e apoptose em órgãos internos 19. Em última análise, os danos da radiação sub-letal cumulativo pode causar a morte, se o LD 50/30 para a radiação ionizante é ultrapassado, o que se situa entre 5 e 7 Gy, dependendo da estirpe de ratinho e da idade dos ratos utilizados 18,20,21. Embora alguns dos danos molecular das radiações ionizantes podem curar, desde o princípio primordial é estimar a dose de forma conservadora, este não é normalmente contabilizados no planejamento do estudo. Em vez disso, o objetivo é ficar o mais below esses limites quanto possível, enquanto ainda realizar os objetivos do estudo. Isto é particularmente importante no presente estudo, devido à resposta imunitária normal à infecção, a frequência de imagem, e o facto transgénicas, imuno-formado, ou fortemente os animais infectados podem ser mais sensíveis à radiação ionizante. Ao planear a experiência para gerar um filme 4D da infecção, é importante ter em conta a duração da experiência, o número de μCT verifica necessário durante este período e o LD 50/30 para a radiação ionizante para a estirpe de ratinho a ser utilizado. Outra limitação potencial ao DLIT-μCT é a força de expressão do repórter no interior da estirpe bacteriana a ser utilizada, pois isso irá afectar os limites de detecção de bactérias e tempos de imagem. É altamente recomendável que os pesquisadores usam validado cepas bacterianas que são totalmente virulenta, mas otimizado para máxima lux operon expressão, como demonstrado anteriormente para BLI2,3. Uma ressalva ao projeto atual da imagem 4D é que cada filme é composto de exames individuais DLIT-μCT que têm diferente escala fóton. Isto pode tornar as imagens difíceis de interpretar se as alterações para a localização de focos BL, ou a sua intensidade ser subtil, ou se houver uma atenção intensa BL rodeado por focos fraco múltipla. Portanto, para a visualização longitudinais, é importante para manter as barras de cor consistentes entre os pontos de tempo. O conceito de um filme 4D da infecção pode ser aplicado a qualquer agente patogénico bacteriano adequadamente rotulado. Desenvolvimento futuro desta técnica terá como objetivo usar a fluorescência tomografia (FLIT), bem como DLIT para facilitar a investigação da resposta do hospedeiro à infecção usando uma combinação de patógenos bacterianos bioluminescentes e injetáveis ​​fluorescentes perto sondas infravermelhas para investigar respostas do hospedeiro à infecção. Em adição a isso, neste protocolo, sódescrevem a utilização de bactérias bioluminescentes para criar 4D filmes de infecção. No entanto, em alguns casos, pode ser necessário o uso de bactérias marcadas fluorescentes, por exemplo marcados com IRFP, de modo que o repórter bioluminescente pode ser utilizado para a investigação genética hospedeiro durante a infecção. Mais importante, o uso de imagens multi-modalidade combinando DLIT / FLIT-μCT permitirá investigar de forma não invasiva vários parâmetros durante uma infecção bacteriana, o que vai contribuir significativamente para a redução, refinamento e substituição do uso de animais em pesquisa científica conforme descrito na iniciativa da NC3R ( <a href="http://www.nc3rs.org.uk/" target="_blank">http://www.nc3rs.org.uk/</a> ).

Modelos de pequenos animais, em especial os que utilizam ratos, são rotineiramente utilizados para investigar patogênese bacteriana ou para testar estratégias de intervenção para infecções, tais como antibióticos, probióticos, prebióticos e vacinas 1-7. As principais leituras experimentais de infecções animais pequenos são carga de patógenos, localização espacial e temporal da infecção, e alterações na resposta imunológica do organismo infectado. Em imagiologia óptica in vivo é uma ferramenta valiosa para a pesquisa de doenças infecciosas e pode ser utilizado para monitorizar múltiplas Leituras experimentais, através da utilização de genes repórteres (proteínas fluorescentes, luciferase, beta-lactamase, etc), corantes fluorescentes, nanopartículas ou sondas quimioluminescentes apontado a um processo biológico da proteína, ou microrganismo 6. Imagem de bioluminescência (BLI) é uma modalidade de imagiologia óptica utilizado para monitorar a colonização de pequenos animais, tais como ratinhos e ratos, por bactericida patogénicaria 3,6,8,9. Os ratinhos são infectados com as bactérias recombinantes que expressam uma luciferase, tal como o operão lux CDABE de Photorhabdus luminescens. Estas bactérias, em seguida, pode ser detectado através da sua produção de luz, utilizando um CCD com base no sistema de imagem in vivo 3,6,9. É importante ressaltar que apenas micro-organismos metabolicamente ativas são bioluminescentes (BL), ou seja, somente as células bacterianas viáveis ​​são detectados por esta metodologia 10,11. Usando 2D BLI, o local da fonte de BL é inferida a partir da superfície do animal, onde o sinal é emitido 8. A localização anatómica exacta dos focos BL in vivo tem de ser determinada através da análise ex vivo de órgãos 3,6,9 Em contraste, a luz difusa 3D tomografia composto (DLIT) pode ser usado para compilar uma reconstrução 3D quantitativa do BL fonte 12. DLIT é realizada através da recolha de imagens BL tiradas com filtros ópticos passa-banda estreitos e definidosposteriormente, introduzindo-os em uma tomografia óptica reconstrução 3D algoritmo difuso 1,7,12,13. Actualmente, imagiologia multimodalidade é o único método disponível para se verdadeira localização anatómica não-invasivo de focos bioluminescente in vivo, sem a necessidade de análise ex vivo. Recentemente, foi utilizada uma combinação de DLIT co-registradas com μCT de imagem para avaliar Citrobacter rodentium (C. rodentium) dinâmica de colonização após o tratamento profilático com uma bactéria probiótica 7. C. rodentium é um patógeno entérico específico murino usado para infecção humana com modelo enteropatogênico e enterhemorrhagic Escherichia coli 14. C. infecção rodentium provoca colite, normalmente associada com perda moderada de peso, diarréia, polarizada Th1 de resposta imune e alterações patológicas distintas, incluindo hiperplasia da cripta do cólon e anexando e discreto lesão formatiem 14. Além disso, C. patogênese rodentium tem sido exaustivamente estudada usando BLI e sua dinâmica de colonização em camundongos C57BL/6J estão bem documentados, fazendo com que esta bactéria um microorganismo modelo ideal para uso com multi-modalidade de imagem 3,4,7. Este protocolo é o primeiro a descrever uma metodologia para imagiologia DLIT-μCT integrada de uma infecção bacteriana utilizando uma única plataforma multimodalidade imagiologia, o IVIS Espectro de CT, e a geração de um filme 4D mostra os verdadeiros dinâmica desta infecção não-invasiva.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioluminescent C. rodentium</td>
			<td>Frankel lab</td>
			<td>ICC180</td>
			<td>Wiles et al., 2004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veet</td>
			<td>Boots</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane (100% v/v)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Oxygen</td>
			<td>BOC Medical</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.10285.0500</td>
			<td>25 g in 1L Demineralised water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.10283.0500</td>
			<td>37 g in 1L Demineralised water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate</td>
			<td>Sigma (Fluka)</td>
			<td>60615</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical Falcon tubes</td>
			<td>BD (Falcon)</td>
			<td>352070</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universals</td>
			<td>Corning (Gosselin)</td>
			<td>E5633-063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD (Plastipak)</td>
			<td>300013</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved</td>
			<td>Vet Tech</td>
			<td>DE005</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbanks (Cryovial)</td>
			<td>Pro-Lab Diagnostics</td>
			<td>PL.170/Y</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum CT</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>133577 Rev A/ Spectrum CT</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6kVA UPS</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI-8 anesthesia system</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>118918</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAF-8 Anaesthesia filter charcoal</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>118999/00</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image v4.3.1 SP1</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop shaking incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 44</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d multimodality imaging of citrobacter rodentium infections in mice

Este protocolo descreve os passos necessários para monitorar longitudinalmente uma infecção bacteriana bioluminescente utilizando luz difusa tomografia composto 3D integrado com μCT (DLIT-μCT) ea posterior utilização dos dados para gerar um filme de quatro dimensional (4D) do ciclo de infecção. Para desenvolver os filmes de infecção 4D e para validar a imagem DLIT-μCT para estudos de infecção bacteriana utilizando um IVIS Spectrum CT, usamos a infecção com bioluminescente C. rodentium, o que faz com que a auto-limitante colite em ratos. Neste protocolo, descrevemos a infecção de camundongos com bioluminescente C. rodentium e monitoramento não-invasivo da colonização por diária de imagens DLIT-μCT e enumeração de bactérias das fezes para 8 dias. O uso do IVIS Spectrum CT facilita perfeita co-registo de exames ópticos e μCT utilizando uma plataforma de imagem única. A baixa modalidade μCT doses permite a imagem dos camundongosem vários momentos durante a infecção, oferecendo localização anatômica detalhada dos focos de bactérias bioluminescentes em 3D sem causar artefatos da radiação cumulativa. É importante ressaltar que os filmes 4D de camundongos infectados fornecer uma poderosa ferramenta analítica para monitorar a dinâmica de colonização de bactérias in vivo.

A infecção de camundongos C57BL/6J com 5 x 10 9 ufc C. rodentium é um modelo de infecção bacteriana e bem descritas resulta numa infecção gastrointestinal auto-limitante e que os picos entre 6-8 dias após a infecção e dura entre 3 a 4 semanas 2,14. A infecção está confinada ao lúmen intestinal pelo sistema imunitário dos murinos e, como consequência, as bactérias são continuamente eliminados nas fezes. Colonização de ratos por C. rodentium pode ser monitorado de forma não invasiva por enumeração bacteriana direta das fezes, ou imagem de bioluminescência 2,3. Este manuscrito descreve um protocolo otimizado para executar 3D e 4D multimodalidade de imagem de C. rodentium dentro ratos para monitorizar a carga bacteriana e localização durante a infecção. Os resultados apresentados na Figura 1 demonstram os controlos que são necessários para imagiologia 4D bem sucedido. Antes da infecção de ratinhos é essencial para dissuadirmina que o inoculo bacteriano utilizado é bioluminescente (Figura 1A) e que, após a administração por sonda oral de um rato com bioluminescente C. rodentium, que o sinal pode ser observado no estômago do animal, e não nos pulmões (Figura 1B) 16. Além de controlar a colonização bacteriana utilizando imagiologia bioluminescente, é boa prática para quantificar o número de bactérias nas fezes, que é usado como uma medida indirecta da colonização bacteriana da mucosa gastrointestinal Figura 2 demonstra a carga bacteriana típica nas fezes feita a partir de 8 C57BL6 / J. os ratos que foram infectadas com aproximadamente 5 x 10 9 ufc ICC180 e monitorizada durante 8 dias PI Colonização aumenta a partir do dia 2 até o dia PI 6-7, onde os picos de infecção a ~ 5 x 10 10 ufc / g; que está em consonância com os relatórios anteriores 2,3,17. Para enfatizar a importância da avating a propagação da infecção em um único rato, Figuras 1B e 3, bem como um vídeo ter sido gerados a partir do mesmo rato após C. rodentium infecção, tal como descrito acima. Diariamente DLIT-μCT foi utilizado para avaliar a distribuição espacial das bactérias bioluminescentes dentro deste rato, usando o esqueleto como uma referência anatómica. Figura 3 demonstra a reconstrução DLIT-μCT de um rato infectado com C57BL/6J ICC180 em três pontos chave hora PI Em dia 3 PI pequenos focos bioluminescente pode ser observada no cólon, que exibem um aumento moderado na intensidade de bioluminescência durante o dia 5 PI com pouca alteração na distribuição espacial. No dia 7 de PI observou-se um aumento significativo na bioluminescência ea bioluminescente focos espalhados por todo o cólon. Video 1 é uma compilação de reconstruções DLIT-μCT 3D a partir de 1-8 dias PI com ICC180 e ilustra C.rodentium dentro do trato gastrointestinal proximal entre os dias PI 1-2 que se espalha para o cólon no dia 3 PI De 4-6 dias PI os números de bactérias no cólon expandir até um pico no dia 7 PI, onde os focos de bactérias cobre todo o cólon. No dia 8 PI apenas dois focos distintos de bactérias estão presentes no cólon proximal e distal. A capacidade de visualizar a reconstrução 3D completa em cada momento, em ordem cronológica, representa uma poderosa ferramenta para analisar as interações patógeno hospedeiro e é mais fácil de interpretar do que um 3D ainda do mesmo conjunto de dados. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig1.jpg" /> Figura 1. Imagem de bioluminescência 2D A) Bioluminiscente C. rodentium ICC180 inoculo e B) de um rato após administração por sonda oral com 200 mL de inoculo. Arrowhead (&gt;) ilustra bioluminescente C. rodentium </<html> em&gt; no estômago. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig2.jpg" /> Figura 2. C. dinâmica de colonização rodentium. Quantificação C. rodentium unidades formadoras de colônia de fezes por 8 dias PI <img alt="Figura 3" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3.jpg" /> Figura 3. Luz difusa imagem tomografia μCT varredura de bioluminescente C. infecção rodentium de um rato monitorados no dia 3, 5 e 7 PI Arrowhead (&gt;) ilustra a colonização do cólon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50450/50450fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . Video 1.p :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50450/LAB_MEDIA_50450_Frankel_Video1.wmv &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver o vídeo. 4D filme de infecção por C. rodentium de um rato monitorado a partir de 1-8 dias PI

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4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

De imagem multi-modalidade é uma abordagem útil para estudar a colonização bacteriana em modelos de animais pequenos. Este protocolo descreve a infecção de camundongos com bioluminescente<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Eo acompanhamento longitudinal de colonização bacteriana usando luz difusa tomografia 3D composto com μCT imagens para criar um filme 4D de<em&gt; C. rodentium</em&gt; Infecção.

4D Multimodalidade de imagens de<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infecções em Ratos

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

12.9K visualizações.  Imperial College London. De imagem multi-modalidade é uma abordagem útil para estudar a colonização bacteriana em modelos de animais pequenos. Este protocolo descreve a infecção de camundongos com bioluminescente Citrobacter rodentium Eo acompanhamento longitudinal de colonização bacteriana usando luz difusa tomografia 3D composto com μCT imagens para criar um filme 4D de C. rodentium Infecção.

Vídeo: 4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

Usando a luciferase Infecções bacterianas Imagem em camundongos

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Imunologia e Infecção

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

This protocol outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and colitis, as well as the methods used to characterize Citrobacter rodentium infection in mice. C. rodentium is a gram negative, murine specific bacterial pathogen that is closely related to the clinically important human pathogens enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli. Upon infection with C. rodentium, immunocompetent mice suffer from modest and transient weight loss and diarrhea. Histologically, intestinal crypt elongation, immune cell infiltration, and goblet cell depletion are observed. Clearance of infection is achieved after 3 to 4 weeks. Measurement of intestinal epithelial barrier integrity, bacterial load, and histological damage at different time points after infection, allow the characterization of mouse strains susceptible to infection.
The virulence mechanisms by which bacterial pathogens colonize the intestinal tract of their hosts, as well as specific host responses that defend against such infections are poorly understood. Therefore the C. rodentium model of enteric bacterial infection serves as a valuable tool to aid in our understanding of these processes. Enteric bacteria have also been linked to Inflammatory Bowel Diseases (IBDs). It has been hypothesized that the maladaptive chronic inflammatory responses seen in IBD patients develop in genetically susceptible individuals following abnormal exposure of the intestinal mucosal immune system to enteric bacteria. Therefore, the study of models of infectious colitis offers significant potential for defining potentially pathogenic host responses to enteric bacteria. C. rodentium induced colitis is one such rare model that allows for the analysis of host responses to enteric bacteria, furthering our understanding of potential mechanisms of IBD pathogenesis; essential in the development of novel preventative and therapeutic treatments.

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Citrobacter rodentium infection provides a valuable model to study enteric bacterial infections as well as host immune responses and colitis in mice. This protocol outlines the measurement of barrier integrity, pathogen load and histological damage allowing for the thorough characterization of pathogen and host contributions to murine infectious colitis.

O<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Modelo de Rato: Contribuições Estudar patógeno e hospedeiro para Colite Infecciosa

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Crônica de Longo Prazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infecção das vias aéreas em ratos

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Geração e Multi-fenotípica rastreio de alto teor de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; mutantes por transposões

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Culturas placentária e Decidual órgão humano para estudar Infecções na interface materno-fetal

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to the frequent failure of traditional antibiotic treatments. Alternative therapeutics are urgently needed to tackle MDR bacteria.
An innovative non-antibiotic approach, antimicrobial blue light (aBL), has shown promising effectiveness against MDR infections. The mechanism of action of aBL is not yet well understood. It is commonly hypothesized that naturally occurring endogenous photosensitizing chromophores in bacteria (e.g., iron-free porphyrins, flavins, etc.) are excited by aBL, which in turn produces cytotoxic reactive oxygen species (ROS) through a photochemical process.
Unlike another light-based antimicrobial approach, antimicrobial photodynamic therapy (aPDT), aBL therapy does not require the involvement of an exogenous photosensitizer. All it needs to take effect is the irradiation of blue light; therefore, it is simple and inexpensive. The aBL receptors are the endogenous cellular photosensitizers in bacteria, rather than the DNA. Thus, aBL is believed to be much less genotoxic to host cells than ultraviolet-C (UVC) irradiation, which directly causes DNA damage in host cells.
In this paper, we present a protocol to assess the effectiveness of aBL therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in a mouse model of burn injury. By using an engineered bioluminescent strain, we were able to noninvasively monitor the extent of infection in real time in living animals. This technique is also an effective tool for monitoring the spatial distribution of infections in animals.

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacterial strains have emerged as a serious threat to public health, necessitating the development of alternative therapeutics. We present a protocol to evaluate the effectiveness of antimicrobial blue light (aBL) therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in mouse burns by using bioluminescence imaging.

In Vivo Investigation of Antimicrobial Therapy luz azul para-multirresistente Acinetobacter baumannii queimadura Infecções Usando bioluminescência Imagiologia

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

Mycobacterium tuberculosis em camundongos com fluorescência de enzima do repórter de imagem

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ cytosolic concentrations, linked to release from internal stores or an influx through plasma membrane channels, regulate cortical cell processes. Pathogens that adhere to or invade host cells trigger a reorganization of the actin cytoskeleton underlying the host plasma membrane, which likely affects both global and local Ca2+ signaling. Because these events may occur at low frequencies in a pseudo-stochastic manner over extended kinetics, the analysis of Ca2+ signals induced by pathogens raises major technical challenges that need to be addressed.
Here, we report protocols for the detection of global and local Ca2+ signals upon a Shigella infection of epithelial cells. In these protocols, artefacts linked to a prolonged exposure and photodamage associated with the excitation of Ca2+ fluorescent probes are troubleshot by stringently controlling the acquisition parameters over defined time periods during a Shigella invasion. Procedures are implemented to rigorously analyze the amplitude and frequency of global cytosolic Ca2+ signals during extended infection kinetics using the chemical probe Fluo-4.

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Here, we present protocols to visualize calcium (Ca2+) responses elicited by HeLa cells infected by Shigella. By optimizing the parameters of bacterial infection and imaging with Ca2+ fluorescent probes, atypical global and local Ca2+ signals induced by bacteria over a large range of infection kinetics are characterized.

Imagem de Ca2 + respostas durante Shigella infecção das células epiteliais

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

Imagem latente confocal de RNA Double-Stranded e receptores de reconhecimento padrão na infecção pelo vírus de RNA de sentido negativo

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Um do elevado-throughput Shigella-ensaio bactericida específico

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...