Este protocolo usa um microscópio multi-filtro para imagens ao vivo de toda a estrutura da superfície ocular do rato no modelo de camundongo transgênico fluorescente duplo. A combinação de uma plataforma microscópica multifotográfica personalizada e camundongos transgênicos fluorescentes duplos permite a visualização em tempo real da e estrutura da superfície ocular. Para configurar o microscópio multifotônio, selecione a imersão de água 20X, 1,00 NA objetivo e definir o laser de safira de titânio como a fonte de excitação em um microscópio vertical.
Defina o comprimento de onda de saída do laser para 880 nanômetros para EGFP e 940 nanômetros para tdTomato. Inclua dois espelhosdicâmicos para a separação de shg egfp tdTomato e use 434-17, 510-84 e 585-40 filtros de passagem de banda para separar espectralmente os sinais SHG EGFP e tdTomato. Para configurar o suporte dos olhos, depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal em um rato anestotista de 8 a 12 semanas, coloque o mouse no estágio do microscópio aquecido e insira uma sonda de monitoramento de temperatura.
Coloque o mouse em um suporte de mouse esteretaxic personalizado e insira barras de ouvido no meatus auditivo externo. Use fixação de três pontos para fixar o suporte da cabeça e aplique uma solução de cloridrato de oxybuprocaina de 0,4% oxybuprocaine e solução salina à superfície ocular. Cubra as pontas de um par de fórceps Dumont número cinco com o laço do tubo PE.
Após três minutos, realize uma retração manual das pálpebras para confirmar a saliência do globo ocular e coloque cuidadosamente um laço do tubo do suporte de PE ao longo da margem das pálpebras para expor a superfície ocular. E use o botão do suporte para estabilizar o globo ocular com os fórceps. Em seguida, cubra a superfície da córnea com um gel ocular com um índice refrativo de 1.338.
Para imagens seriais Z da superfície córnea, use uma fonte de luz de mercúrio para fotografar o campo de alvo e abrir o software do microscópio. Selecione o multiplicador de fotos apropriado e os ganhos digitais para visualizar a estrutura celular na superfície ocular e defina o primeiro e último slide para permitir a aquisição de uma pilha de imagens. Defina a resolução da imagem para 512 por 512 pixels e a etapa Z para um micrômetro.
Em seguida, clique em começar a coletar imagens seriais Z adquirindo uma imagem ao vivo com uma excitação de 880 nanômetros para a coleta de sinal SHG EGFP e uma imagem ao vivo em uma excitação de 940 nanômetros para a coleta de sinal EGFP tdTomato dentro de cada área. Ao longo da imagem, use o suporte de estágio motorizado do stepper para girar o globo ocular para permitir imagens em toda a superfície córnea. Quando todas as imagens tiverem sido adquiridas, carregue as imagens de série Z em Fiji e selecione o plugin de filtro 3D mediano.
Depois de remover o ruído de fundo, selecione o pacote de filtro de máscara não-har Fiji para afiar as imagens e clicar em contraste automático de brilho para otimizar automaticamente a qualidade das imagens. Após o processamento, salve as imagens como uma sequência de imagens serial e exporte a sequência de imagens para um programa de software de reconstrução 3D apropriado. Em todas as imagens de microscopia multifotúr, apresente os sinais EGFP tdTomato e SHG em pseudo verde, vermelho e ciano, respectivamente, antes de capturar as imagens da estrutura 3D por instantâneo.
A microscopia multifotônio permite a visualização de células superficiais de Asa e Basal no epitélio córnea de camundongos transgênicos fluorescentes duplos. Células únicas da camada basal podem ser mapeadas para a camada superficial, bem como células superficiais em forma hexagonal única. Como revelado pela expressão citoplasmática do sinal tdTomato, o rico sistema vesicular intracelular da proteína da membrana, incluindo o aparelho golgi e o ânticulo endoplasmático está espalhado dentro das células das asas.
Dentro do estroma colágeno, os coratesites em forma de stellate são delineados pela membrana que tem como alvo fluorescentes EGFP nesses camundongos. Os coratesites embutidos no estroma universitário são mais espaçados do que dentro das células endoteliais. Além disso, nervos finos de ramificação dentro do estroma córnea também podem ser visualizados por membrana direcionada a sinais tdTomato e moncaminhas de células endoteliais da córnea demonstram uma forma hexagonal relativamente homogênea conectada em um padrão de favo de mel.
O epitélio limbal consiste de uma a duas camadas de células epiteliais. A cepa transgênica de repórter fluorescente dupla também permite a imagem de capilares dentro da conjuntiva, facilitando a reconstrução da arquitetura 3D dos capilares delineando o endotélio vascular. Estabilizar o globo ocular com pressão moderada sem ferimentos é fundamental para a aquisição de imagens de boa qualidade, pois pressão insuficiente ou excessiva pode comprometer a qualidade da imagem.
Esta plataforma de imagem NVivo pode ser modificada para visualização de estruturas abaixo da superfície ocular e pode ser aplicada a estudos in situ de várias doenças oftálmicas.
