Tierexperimentellen Studien wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften, die durch die institutionellen Animal Care und Nutzung Committee of Texas A & M University durchgeführt. Prüfung und Genehmigung von Biohazard Sicherheitsbeauftragten oder Ausschuss in Ihrer Institution sein erforderlich.
Achtung: Alle Verfahren erfordern BSL3 Containment. Die Mitarbeiter sind verpflichtet, persönlichen Schutzausrüstung zu allen Zeiten zu tragen. Alle Manipulationen sind innen Biosafety Cabinet (BSC) durchgeführt und alle Kleie in Sharps Container entsorgt werden. Arbeit Oberflächen und BSC werden vor Beginn der Arbeit und nach der Arbeit mit gepuffertem Phenol und 70 % Ethanol gereinigt. Verfahren würde normalerweise auf Sicherheitsstufe 3 mit Mycobacterium Tuberculosiserfolgen, sondern für Illustration und Dreharbeiten Zwecke, veranschaulichen die Autoren diese Verfahren auf Biosafety Niveau 2 mit weniger virulenten Bakterien.
(1) Stämme und Kultur Bedingungen
Hinweis: M. Tuberculosis Stamm CDC1551 wird in dieser Studie verwendet, aber jede M. Tuberculosis -Belastung kann auf die gleiche Weise verwendet werden.
<ol><li>Wachsen die Bakterien in M-OADC-TW (7H 9 Brühe ergänzt mit 0,5 % Glycerin, 10 % Ölsäure Traubenzucker komplexe ohne Katalase und 0,05 % Tween-80) mittlere stehen bei 37 ° C auf einem OD-600 von 0,5 (~ 0,2 x 107 KBE).</li>
	<li>Verdünnen Sie die Kultur in M-OADC-TW (Reihe von 01:10 Verdünnungen der Bakterien). Platte die Verdünnungen der Bakterien (105, 106107108) in dreifacher Ausfertigung auf selektive 7 H 11 Platten erlauben die Bestimmung der KBE.</li>
	<li>Vier Wochen bei 37 ° C oder bis Kolonien genau gezählt werden können inkubieren Sie die Platten.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das bakterielle Inokulum 8.534 x g für 5 min um eine Kugel zu erhalten. Waschen Sie die Tablette einmal mit 10 mL Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) und wieder auszusetzen das Pellet in 15 mL Kochsalzlösung (0,9 % NaCl).</li>
</ol>(2) Aerosol Infektion der Mäuse mit einer Madison-Kammer
<ol><li>Können Sie Mäuse, für eine Woche an die neue Umgebung gewöhnen.</li>
	<li>Wiegen Sie die Mäuse vor dem Laden sie in die Kammer.</li>
	<li>Drei Kabel in die Steckerleiste anschließen: die Hauptkammer macht, die Vakuumpumpe und der Luft-Kompressor, in dieser Reihenfolge.</li>
	<li>Schrauben Sie vorsichtig das Glasgefäß. Bringen das Glasgefäß zum Schrank Biosafety und fügen Herausforderung Inokulum ausgesetzt in 15 mL Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) zu erreichen ~ 104 - 106 KBE von Bakterien in der Lunge.</li>
	<li>Schließen Sie den Deckel von Glas im Kabinett der Biosicherheit. Legen Sie das Glas auf die Verneblereinheit und stellen Sie das vertikale Edelstahlrohr so ein, dass das untere Ende (Intake) etwa ein Viertel eines Zoll unter dem Niveau der Flüssigkeit im Glas ist.</li>
	<li>Laden Sie alle Tiere, die notwendig für das Experiment (Saal fasst bis zu 90 Mäuse) in die Kammer und schließen Sie die Riegel an der Tür.</li>
	<li>Überprüfen Sie die wichtigsten (Raum) air-Flow-Meter. Stellen Sie sicher, dass das Zentrum des Schwimmers (Kugel) ca. 50 L/min, gemessen auf der Skala auf der linken Seite betreibt.</li>
	<li>Drücken Sie die Schaltfläche "Start" auf dem Bedienfeld der Kammer. Legen Sie die Luftmenge durch den Kompressor Luft Durchflussmesser (die kleineren m links) als 4 L/min auf die Waage. Überprüfen Sie visuell, um sicherzustellen, dass die Herausforderung Inokulum vernebelt wird.</li>
	<li>Nach 15 min Wenn das rote Licht an der Vorderseite des Bedienfelds angezeigt wird und ein akustisches Signal das Ende des Laufs zeigt, Taste Reset auf der unteren rechten Ecke des Bedienfelds um den Timer zurückzusetzen.</li>
	<li>Halten Sie den kleinen roten Knopf an der Tür der Kammer, das Vakuum zu lösen.</li>
	<li>Öffnen Sie die Tür und entfernen Sie die Tiere. Setzen Sie die Mäuse wieder in ihren Käfigen.</li>
	<li>Zerstäuber Glas zu entfernen und in einem geschlossenen, auslaufsicheren Behälter legen. Stellen Sie den Behälter in die Bio-Sicherheit-Schrank und entsorgen Sie die Herausforderung-Suspension in einen dafür vorgesehenen Abfallbehälter.</li>
	<li>Legen Sie das gebrauchte Vernebler Glas innen ein Biohazard Beutel und Verschließen der Tasche für den Transport zu den Autoklaven.</li>
	<li>Am Ende des Verfahrens Infektion sprühen Sie das Innere der Kammer mit gepuffertem Phenol und 70 % Ethanol und lassen Sie die Kammer für 10 min sitzen.</li>
	<li>Dann wischen Sie alle zugänglichen Innenflächen sehr gründlich. Entsorgen Sie alle kontaminierten Papierhandtücher, etc.. in den Biohazard-Papierkorb. Autoklaven den Papierkorb, Abfallbehälter und Vernebler Gläser verwendet.</li>
	<li>Platziere die Tiere zurück in das Containment-Zimmer bis zu den bildgebenden Zeit-Punkt.</li>
	<li>Am Tag der Bildgebung übertragen Sie die Tiere in einem sekundären Container auf den bildgebenden Raum.</li>
</ol>3. Tier Anästhesie
<ol><li>Die Mäuse mit Isofluran verwenden eine benutzerdefinierte Gasanlage Anästhesie zu betäuben.</li>
	<li>Wiegen Sie jedes der zwei Aktivkohlefilter Kanister befindet sich oben auf die Anästhesie-Einheit.</li>
	<li>Ersetzen Sie durch einen neuen Kanister, wenn das Gewicht 50 g über das Ausgangsgewicht ist.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Vaporizer Gerät dafür ausreichend Isofluran für das Verfahren.</li>
	<li>Platzhalter in der bildgebenden Kammer Bugnase. Legen Sie die Anzahl der Nase Kegel für das Verfahren erforderlichen und verschließen Sie die verbleibenden Öffnungen mit der Nase Kegel-Blocker.</li>
	<li>Schalten Sie die Sauerstoffzufuhr aus dem Hochdruck-Zylinder und 55 Psi festgesetzt.</li>
	<li>Die Evakuierung-Pumpe befindet sich vor dem Anästhesie-Gerät einschalten und auf 8 L/min eingestellt.</li>
	<li>Schalten Sie den Sauerstoff-Schalter befindet sich vor der Anästhesie-Einheit.</li>
	<li>Schalten Sie den Gasstrom der Anästhesie Induktion Kammer die Strömung des Gases bei 1,5 L/min drehen den Gasstrom aufzubrechen.</li>
	<li>Schalten Sie den Gasstrom der bildgebenden Kammer der Strömung des Gases in 0,25 L/min drehen den Gasstrom aufzubrechen.</li>
	<li>Schalten Sie den Verdampfer Isoflurane und setzen Sie ihn auf 2-2,5 %. Passen Sie den Isofluran nach Anzahl und Gewicht der Tiere durch Drehen des Knopfes auf dem Verdampfer Isoflurane (2-2,5 % für eine Maus mit einem Gewicht von ~ 20 g; 4 % für ein Meerschweinchen mit einem Gewicht von 300 g) für das Experiment verwendet wird.</li>
	<li>Legen Sie die Mäuse in der Anästhesie-Kammer und schließen Sie den Deckel. Schalten Sie die Gaszufuhr an der Anästhesie Induktion Kammer.</li>
	<li>Verlassen Sie die Mäuse in der Anästhesie Induktion Kammer für 5-10 min bis vollständig betäubt.</li>
	<li>Sobald die Mäuse betäubt sind, gelten Sie eine optische Salbe für die Augen, sie während der Bildgebung zu schützen.</li>
	<li>Legen Sie die Mäuse in ventralen oder sternale liegen, so dass ihre Nasen in die Bugnase Anästhesie von Mäusen während der bildgebenden Verfahren zu erleichtern platziert werden.</li>
</ol>(4) Reporter Enzym Fluoreszenz (REF) Bildgebung
<ol><li>Injizieren Sie das Substrat (20 µM, 2,5 µL/g Gewicht) durch intraperitoneale Injektion in den infizierten sowie der Kontroll-Mäusen. Die Mäuse sind unter Narkose in der bildgebenden Kammer für weniger als 1 min.</li>
	<li>Starten Sie die imaging-System.</li>
	<li>Initialisieren Sie das System durch Anklicken initialisieren. Warten Sie, bis die Temperatur Bar auf grün wechselt. Hinweis: Die bildgebende Kammer besteht aus einer beheizten Plattform auf Körpertemperatur des Tieres während der Bildgebung.</li>
	<li>Für imaging-Erwerb Einstellung, wählen Sie Leuchtstofflampen | Trans-Beleuchtung für ganze Tier oder Epi-Beleuchtung für Lungengewebe, Struktur und Overlay in Übernahme der Systemsteuerung.</li>
	<li>B Sichtfeld für einzelne Maus und Lampe Niveau zu hoch gesetzt.</li>
	<li>Belichtungszeit auf Auto, mittlere binning, 2-3 für die f/Stop und Erregung Filter bei 745 nm und Emission Filter festgelegt, von 780 nm bis 840 nm.</li>
	<li>Klicken Sie für Sequenz-Setup auf Reihenfolge-Setup, wählen Sie 9-12 Trans-Beleuchtung Punkte im Bereich der Lunge.</li>
	<li>Klicken Sie auf erfassen, für die Bildaufnahme.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger wieder in den Käfig Post-Bildgebung.</li>
	<li>Überwachen Sie die Mäuse bis vollständig erholt oder zur Quantifizierung KBE, wenn zu einem Zeitpunkt des Experiments imaging zu opfern. Führen Sie einen modifizierten Karnofsky-Score um das Wohlergehen von Mäusen, die Post-imaging zu überwachen.</li>
</ol>5. Analyse der REF imaging
<ol><li>Öffnen Sie die imaging-Software.</li>
	<li>Laden Sie Bilddateien durch durchsuchen anklicken.</li>
	<li>Klicken Sie für spektrale Entmischung in der Werkzeugpalette auf Spectral Unmixing und klicken Sie auf die Spektren unmix verpflichtet. Klicken Sie auf Start zu entmischen.</li>
	<li>Klicken Sie für optische Flächenrückführung auf Oberfläche Topographie.</li>
	<li>Wählen Sie Ausrichtung, dorsal, je nach Fell Maus, und klicken Sie auf Generate Oberfläche.</li>
	<li>Zeichnen Sie Bild zuschneiden und Schwelle Bild für eine Region von Interesse. Klicken Sie auf fertig.</li>
	<li>Gehen Sie für Orgel Registrierung zur Registerkarte Registrierung 3D optische Werkzeuge im Dropdown-Menü.</li>
	<li>Organe des Interesses an einer Orgel-Atlas zu registrieren.</li>
	<li>Passen Sie Orgel Größe oder Lage, um die generierten Oberflächentopographie mit Werkzeug "transformieren" ein-/befindet sich auf der Panel-Registrierung Tools an.</li>
	<li>Rufen Sie fluoreszierende Tomographie 3D-Rekonstruktion (FLIT), und wählen Sie analysieren tab. Wählen Sie die Bilder für die Analyse einbezogen werden, Bildtyp, normalisiert Übertragung Fluoreszenz (NTF) Effizienz, klicken Sie auf Start.</li>
	<li>Überprüfen Sie auf alle auswählen und in der Registerkarte "Datenvorschau" zu rekonstruieren.</li>
	<li>Gehen Sie für die Quantifizierung der Fluoreszenz Region von Interesse (ROI)-Tools, ROI Cube, die Orgel von Interesse hinzuzufügen und passen Sie Cube Größe zur Deckung die Orgel von Interesse. Klicken Sie auf 3D ROIs zu messen.</li>
	<li>Im Fenster ROI Messungen zur ROI 3D-Messungen, wählen Sie Datentyp an Quelle Voxel-Messungen-Einheit auf PmolM-1cm-1.</li>
	<li>Sichern Sie und exportieren Sie das Ergebnis der FLIT 3D-Rekonstruktion Analyse in einer Abbildung oder Daten-Datei.</li>
</ol>(6) Quantifizierung der Bakterien von KBE
<ol><li>Die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital-Natrium 0,1 mL (390 mg/mL) einschläfern.</li>
	<li>Suchen Sie nach Pedal Reflex durch Zusammendrücken der Pads der Füße von Mäusen um sicherzustellen, dass keine reflex Reaktion.</li>
	<li>Explant das Lungengewebe von Mäusen, die mit einer sterilen Pinzette und Schere. Homogenisieren des Lungengewebes in 1 mL 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
	<li>10-divisibel serielle Verdünnungen der Lunge Homogenat in sterilen 1 X PBS zu machen.</li>
	<li>Vor Ort für Beschichtung, drei Aliquote von 20 µL der jeweiligen Verdünnung auf der Agarplatte.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platten in einem Inkubator bei 37 ° C und Monitor für Bakterienwachstum.</li>
	<li>Anzahl der Kolonien in den einzelnen vor Ort nach der Inkubationszeit und express als KBE / mL durch Korrektur der Lautstärke und Verdünnung mit folgender Gleichung: KBE / mL = (C/V) x M Wo C = Kolonie zählt pro Spot, V = Volumen der Probe inokuliert auf jeder Platte (mL), und M = Multiplikationsfaktor (Kehrwert der Verdünnung verwendet). Hinweis: Wenn an einer Stelle für ein Probenvolumen von 0,002 mL bei einer Probenverdünnung von 10-411 Kolonien gezählt werden, werden unter Verwendung der Gleichung, die Anzahl der Kolonie berechnet (11/0.02) X 104 = 5,5 x 106 KBE / mL</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lewinson, D. 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Bei der Verwendung von bildgebender Verfahren, wie z. B. REF, gibt es Schlüsselstrategien, die Generierung von stabilen und konsistenten Daten zu ermöglichen. Optische Verfahren erzeugt Streulicht im Gewebe, die die Tiefe der Penetration, auswirken können, da es schwierig ist, in alle Richtungen emittierte Licht einzufangen. Verwendung von einem in der Nähe von Infrarot-Fluorophor (NIR) Substrat für REF Bildgebung mit einer Anregung und Emission Wellenlänge in der Querange von 700-900 nm ermöglicht minimale Absorption das Fluoreszenzsignal durch Säugetier-Gewebe. Die benutzerdefinierten gestaltete Substrat wurde durch die Verknüpfung einer NIR Fluorophor, IRDye 800Cw einen Quencher gebaut IRDye QC-1, von einem Lactam-Ring ermöglicht Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer-basierte abschrecken. IRDye hat ausgezeichnete Gewebe eindringen und Licht Streuung Eigenschaften und hat keinen keine offensichtlich schädliche Wirkung auf Säugetiere36, aus dem Blut und Organe durch 24 h. Fluoreszenz ausgeglichen signalisieren deutlich erhöht, ab 4 h nach Substrat-Verwaltung erreichen maximale Ebenen 6 h nach Verabreichung.
Die bakterielle infektiöse Dosis, die Art der Verwaltung von infektiöse Dosis und das Substrat sowie Zeitpunkte der imaging-Post-Infektion durch Pilotstudien durchführen sollten standardisiert werden, vor dem Einschiffen auf großen, komplexen, Experimente. Pilotstudien können erheblich reduzieren, Zeit und Kosten, wenn eine große Anzahl von Tieren imaging, weil ein Standardverfahren vor dem Ausführen der wichtigsten Experiment optimiert werden kann. Bakterielle Belastungen sollte ermittelt werden, in den Organen/Geweben von Interesse nach Ganzkörper-Bildgebung mit Trans-Beleuchtung und ex Vivo Lunge Bildgebung mit Epi-Beleuchtung um die Quelle des Signals zu überprüfen und bestimmen die Qualität der Korrelation mit bakteriellen Zahlen vorhanden8. Pilot-Studien bieten einen Einblick in die Schwelle der Erkennung, dynamischen Bereich der Technik sowie die Bestimmung der optimalen Versuchsbedingungen für die Bildgebung.
Die Hauptvorteile der Verwendung von REF Bildgebung im Vergleich zu anderen fluoreszenten und biolumineszenten Strategien sind seine hohe Sensibilität und die Fähigkeit zur natürlichen M. Tuberculosis Bild Stämme. REF imaging nutzt das katalytisch robuste Enzym BlaC, die in allen klinischen Isolaten von M. Tuberculosis und Tuberkulose-Komplex Stämme konserviert ist. Die große Empfindlichkeit des REF imaging ist aufgrund der raschen katalytische Rate von BlaC in Kombination mit Eigentumsvorbehalt gespalten fluoreszierende Produkts durch die Wirtszelle. Signalisieren Sie kontinuierlich erhöht, solange das Substrat zur Verfügung, wodurch nahezu unbegrenzte Aufbau des Signals innerhalb der infizierten Zellen und Gewebe ist. Diese erhöhte Empfindlichkeit des REF Bildgebung im Vergleich zu alternativen Ansätzen der Bildgebung ermöglicht spezifische Erkennung von M. Tuberculosis sowohl in Vitro und in Vivo8,23,24, 29.
REF imaging einsetzbar für bakterielle Erkennung ohne gentechnische Veränderungen ermöglichen die direkte Anwendung Infektionsmodell, entweder Labor Tiere8,37 oder menschlichen klinischen Materials29,38 . REF kann verwendet werden, zu erkennen und eine Vielzahl von Krankheitserregern39,40, Bild, da Fluorogenic Substrate für zahlreiche enzymatische Ziele außer BlaC wie Proteasen, Kinasen, Ureases und β-Galactosidases entwickelt werden können. Zeigt jedoch vorsichtig sein, dass das Ziel nachgedacht werden sollte um sicherzustellen es optimale Eigenschaften für die Bildgebung. BlaC stellt ein gutes Modell Enzym für Merkmale, die erfolgreiche Anwendung dieser Strategie sicherstellt. REF imaging bietet eine sofortige auslesen auf bakterielle Last in Lunge bei Infektionen, die stark Fortschritte beschleunigt im Studium der Tuberkulose Pathogenese, da die Bestimmung der bakteriellen Zahlen erfordert in der Regel drei bis sechs Wochen, aber auch in mehr schnellsten wachsenden Organismen, die diese Vorgehensweise sehr viel spart Zeit. REF kann auch verwendet werden, Karzinome an Tuberkulose, ein zentrales Problem bei der Diagnose von nodulären Läsionen in Patienten41,42zu unterscheiden. "REF" dient als neuartige Werkzeug, translationale Tuberkulose Bildgebung zu beschleunigen und kann auch für den Menschen potenziell ermöglicht schnellen Vorhersage von therapeutischen Ergebnissen angewendet werden.

Die langsame Wachstumsrate von M. Tuberculosis ist ein Haupthindernis in schnelle Diagnose von Tuberkulose1,2,3. Während Kultur Diagnose dauert es Wochen basierte, Ergebnisse zu erzielen, hat säurefeste Abstrich diagnostische Einschränkungen4 Kinder5 und Patienten mit humanen Immundefizienz-Virus6,7. Optical imaging-Technologien wurden kürzlich als Alternative zu herkömmlichen Diagnoseverfahren für Tuberkulose8,9anerkannt. Fluoreszenz und Biolumineszenz können verwendet werden, um optisch M. Tuberculosis mit lebenden Tieren in Echtzeit-10,11,12,13,14Bild, 15,16,17,18,19. Optische Verfahren hat den Vorteil einer schnellen und spezifischen Beurteilung einer Infektion mit Mycobacterium Tuberculosis20,21,22.
Wir skizzieren Details für optische Bildgebung von M. Tuberculosis in live Mäuse mit REF. Diese Methode ist sehr spezifisch und sensitiv23,24 , und ähnlich wie bei anderen optischen Methoden ist weniger teuer als andere Methoden der Tuberkulose (TB) imaging25, einschließlich Computertomographie (CT)26, magnetische Magnetresonanz-Bildgebung (MRI)27und F-FDG-Positronen-Emissions-Tomographie/CT (F-FDG-PET/CT)28. REF nutzt benutzerdefinierte fluoreszierende oder biolumineszenten Substrate, die bei der Spaltung durch eine bakterielle Enzym eine fluoreszierende Produkt8,29zu produzieren. Daher hat es den Vorteil, dass eine rekombinante mykobakteriellen Reporter Belastung30,31. Der Bund Substrat beschrieben besteht aus einem Fluorochrom und einen Durstlöscher, verbunden durch ein β-Lactam-Ring, der durch BlaC (β-Lactamase), natürlich konstitutiv durch Tuberkulose-Komplex Mycobacterium8, ausgedrückt hydrolysiert 32. die Bakterien erzeugen direkt Signal durch REF katalytische Aktivität, die Verstärkung von vielen Größenordnungen und empfindliche Detektion von M. Tuberculosisermöglicht.
In dieser Studie verwendeten REF-Substrat hat ausgezeichnete Gewebe eindringen in lebenden Tieren und Hintergrund aufgrund seiner langen Wellenlänge reduziert. Mit dieses langwellige Substrat ist es möglich, einen Schwellenwert von Erkennung für M. Tuberculosis von fast 100 zu erreichen Koloniebildenden Einheiten (KBE) in Vitro und < 1000 KBE in den Lungen von Mäusen in Vivo (ganze Tier)8, 33. REF kann als ein Diagnosetool für Auswurf, klinischen Materials und sogar direkt bei Patienten mit Mikro endoskopische Systeme16,32,33,34 aufgrund seiner hohen Sensitivität und Spezifität verwendet werden. REF kann auf jede klinische Belastung von Tuberkulose angewendet werden, weil es ein natürlich produzierten bakterielle Enzym, BlaC, für die Erkennung in allen Sorten vorhanden verwendet. Diese Eigenschaften machen REF imaging ein wertvolles Werkzeug in der präklinischen Tuberkuloseforschung im allgemeinen therapeutischen Erleichterung sowie Impfstoff Auswertung und Analyse der Pathogenese, aber letztlich auch zur Diagnose Tuberkulose angewandt werden Patienten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:664px;" width="664">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:163px;">VETONE</td>
			<td align="right" style="width:119px;">501027</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:216px;">CNIR800</td>
			<td style="width:163px;">Custom synthesized</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Fatal Plus solution</td>
			<td style="width:163px;">Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">7H9 Middlebrook broth</td>
			<td style="width:163px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OADC Middlebrook enrichment</td>
			<td style="width:163px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">212351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sporcidin</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;">RE-1284F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">7H11 Middlebrook Agar</td>
			<td style="width:163px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">212203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Madison Chamber</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IVIS Spectrum</td>
			<td style="width:163px;">Perkin Elmer</td>
			<td align="right">124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">XGI-8-gas Anesthesia System</td>
			<td style="width:163px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Living Imaging software</td>
			<td style="width:163px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Transparent nose cones</td>
			<td style="width:163px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">M. tuberculosis strain CDC1551</td>
			<td style="width:163px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Female BALB/C mice, 5-7 weeks</td>
			<td style="width:163px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging mycobacterium tuberculosis in mice with reporter enzyme fluorescence

Reporter-Enzym-Fluoreszenz (REF) nutzt Substrate, die spezifisch für Enzyme zur Bildgebung oder Aufdeckung von Fluoreszenz und Biolumineszenz in Zielorganismen von Interesse sind. Wir nutzen BlaC, ein Enzym, das konstitutiv durch alle M. Tuberkulose -Stämme ausgedrückt. REF ermöglicht schnelle Quantifizierung von Bakterien in der Lunge von infizierten Mäusen. Die gleiche Gruppe von Mäusen kann abgebildet werden, zu vielen Zeitpunkten, erheblich Kosten reduzieren, Auflisten von Bakterien schneller ermöglicht neuartige Beobachtungen in Wirt-Pathogen Interaktionen und statistische Aussagekraft zu erhöhen, da mehr Tiere pro Gruppe leicht gepflegt werden . REF ist extrem katalytische aufgrund der BlaC enzymatische Reporter sensitiver und spezifischer aufgrund der benutzerdefinierten Flourescence Resonanz Energietransfer (FRET) oder Fluorogenic Substrate verwendet. REF erfordert keine rekombinante Stämme, normale Wirt-Pathogen Interaktionen zu gewährleisten. Wir beschreiben die Bildgebung von M. Tuberkulose -Infektion mit einem Bund Substrat mit maximalen Emission bei 800 nm. Die Wellenlänge des Substrates ermöglicht empfindliche Tiefengewebe-Bildgebung bei Säugetieren. Wir skizzieren Aerosol-Infektion von Mäusen mit M. Tuberculosis, Anästhesie von Mäusen, Verwaltung der REF Substrat und optische Bildgebung. Diese Methode wird erfolgreich angewendet, zur Bewertung von Wirt-Pathogen Interaktionen und Wirksamkeit der Antibiotika gezielt M. Tuberculosis.

REF Bildgebung von Mäusen zusammen mit nicht infizierten Kontrolle Maus mit M. Tuberculosis infiziert sind in Abbildung 1Adargestellt. Infizierte Mäuse produziert ein signifikant (P = 0,0057) höheren Fluoreszenzsignal aus der Lunge in 6 Wochen nach der Infektion im Vergleich zur Kontrolle auf Substrat Verwaltung. Ein typischen zeitlichen Verlauf der therapeutischen Wirksamkeit gegen M. Tuberculosis mit REF studieren konnte imaging bei Woche, 1, 2, 4, 6, 15, 24 nach der Infektion. Fluoreszenzintensität wird quantifiziert mit Epi-Beleuchtung für Lungengewebe (Abbildung 1B). Das ständig zunehmende Signal von Woche 2 Woche 6 in Lungen von infizierten Mäusen legt nahe, dass REF erfolgreich M. Tuberculosis in-vivoerkennen kann. Ein Tropfen in das Hintergrundsignal des Kontroll-Mäusen zu einem späteren Zeitpunkt (Abbildung 1B) könnte der Anstieg der Körper zugeschrieben werden Masse und Volumen von Mäusen über einen Zeitraum von 6 Wochen, wodurch die Erregung Wellenlänge Eindringen. FLIT 3D-Rekonstruktion von Fluoreszenz Quellen bei Mäusen mit M. Tuberculosis infiziert ist in Abbildung 2Avertreten. Die Bildsequenzen werden an mehreren Punkten der Trans-Beleuchtung in der Maus mit dem gleichen Anregung und Emission Filter-Serie erworben. Diese Bildsequenzen werden dann für FLIT 3D-Rekonstruktion für fluoreszierende Source-Distribution innerhalb der tierischen Thema verwendet. Abbildung 2 A-D zeigt die verschiedenen Richtungen (koronalen, sagittale und 2D-Einzelschicht) der Maus-Tomographie mit Lunge Orgel Registrierung. NTF-Effizienz Karten für die Überprüfung die Wiederaufbau-Qualität sind in Abbildung 2Evertreten. NTF ermöglicht Subtraktion der Hintergrund Lichtverlust von Trans-Beleuchtung Bilder durch ein zusätzliches Bild mit Graufilter eingefangen. Die Aufnahme mit dem spezifischen Erregung Filter (Abbildung 2E gemessen) ist auf das Getriebe Bild gemessen mit der gleichen Emission und eine offene Erregung Filter (Abbildung 2E - simuliert) geben normalisiert. das Signal durch das Substrat allein produziert. Die ähnliche gemessen und simuliert NTF Effizienz Profil sowohl horizontal (Abbildung 2F) und vertikale (Abbildung 2G) Profile mit fast 0 % prozentualen Fehler (Abbildung 2E % Fehler) bietet Hinweise auf eine gute Qualität 3D-Rekonstruktion mit reduzierten Artefakten und verbesserte Signal-Lokalisierung und Empfindlichkeit.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig1.jpg"> Abbildung 1 . Bildgebung des M. Tuberculosis mit ref (A) in-Vivo Bildgebung von Mäusen nicht infizierten und bei 2, 4 und 6 Wochen nach der Infektion mit Mycobacterium Tuberculosis infiziert. Die Farbleiste stellt die Intensität der das Fluoreszenzsignal in Photonen pro Sekunde pro cm2 von Low (gelb), hoch (rot). (B) Quantifizierung der Fluoreszenzintensität von Mäusen mit M. Tuberculosisinfiziert. Fluoreszenz-Werte für beide Kontrolle (schwarz) und infizierte (rot) sind zusammen mit der Standardfehler für jeden Zeitpunkt vertreten. Die Bedeutung der Ergebnisse wurden ermittelt, indem Schüler t-test, p -Werte der < 0,05 wurden als bedeutende. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig2.jpg"> Abbildung 2 . FLIT 3D-Rekonstruktion von Fluoreszenz Quellen bei Mäusen mit M. Tuberculosisinfiziert. Maus-Tomographie in verschiedene Richtungen vertreten; (A) koronalen, (B) sagittale, und (C) 2D-Einzelschicht mit (D) Lunge Orgel Registrierung. Die 3D Region of Interest (ROI) wird als eine rote Würfel in der Lunge für Quelle Messungen dargestellt. (E) NTF Effizienz Karten der gemessenen und simulierten für die Überprüfung der Wiederaufbau-Qualität. Die gemessenen und simulierte NTF-Effizienz-Profil wurde verglichen, die gute Qualität der 3D-Rekonstruktion (ähnliche gemessenen und simulierten NTF Effizienz). F) Horizontal "und" G) vertikale Signal Profile repräsentieren gemessenen (blau) und simuliert (rot) NTF Effizienzkurve. Die horizontalen und vertikalen roten Balken zeigen die Quellposition. Die Farbleiste stellt die Intensität der das Fluoreszenzsignal in Photonen pro Sekunde pro cm2 von Low (blau) zu hoch (rot). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Wir beschreiben die optische Bildgebung von Mäusen mit Mycobacterium Tuberculosis (Mycobacterium Tuberculosis) mit Reporter Enzym Fluoreszenz (REF) infiziert. Dieses Protokoll ermöglicht den sensitiver und spezifischen Nachweis von Mycobacterium Tuberculosis in präklinischen Tiermodellen für die Pathogenese, Therapie und Impfstoff-Forschung.

Mycobacterium Tuberculosis in Mäusen mit Reporter Enzym Fluoreszenz Imaging

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

imaging-mycobacterium-tuberculosis-mice-with-reporter-enzyme

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

7.3K Aufrufe.  Texas A&M Health Science Center. Wir beschreiben die optische Bildgebung von Mäusen mit Mycobacterium Tuberculosis (Mycobacterium Tuberculosis) mit Reporter Enzym Fluoreszenz (REF) infiziert. Dieses Protokoll ermöglicht den sensitiver und spezifischen Nachweis von Mycobacterium Tuberculosis in präklinischen Tiermodellen für die Pathogenese, Therapie und Impfstoff-Forschung.

Serie: Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

Probenvorbereitung von<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extrakte für Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

Wachstum von Mycobacterium tuberculosis Biofilme

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

Eine experimentelle Modell zum Studium Tuberkulose-Koinfektion auf Natur Malaria Übertragung von Mycobacterium tuberculosis Und Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

Der Nachweis eines multiresistenten<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Verstärkung Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Ein 3D-humanem Lungengewebe Modell für funktionelle Studien auf<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infektions

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that enhances the phagocytic functionality of neutrophils. Although extensive studies have unveiled the existence and importance of neutrophil priming during infection and injury, means of visualizing this process in vivo have been unavailable. The protocol provided enables monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals by combining three methodologies: 1) DsRed reporter signal &#8212; used as a measure of priming 2) in vivo neutrophil labeling &#8212; achieved by injection of fluorescence-conjugated anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoclonal antibody (mAb) and 3) intravital confocal imaging. Several critical steps are involved in this protocol: oxazolone-induced mouse ear skin inflammation, appropriate sedation of animals, repeated injections of anti-Ly6G mAb, and prevention of focus drift during imaging. Although a few limitations have been observed, such as the limit of continuous imaging time (~ 8 hr) in one mouse and the leakage of fluorescein isothiocyanate-dextran from blood vessels in the inflammatory state, this protocol provides a fundamental framework for intravital imaging of primed neutrophil behavior and function, which can easily be expanded to examination of other immune cells in mouse inflammation models.

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

Intravital Imaging von Neutrophilen Priming Mit IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mäuse

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Ein Hochdurchsatz-Assay unterstützte Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen agierten zur Bewertung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

Analyse der 18FDG PET/CT Imaging als Werkzeug für Studium Mycobacterium-Tuberkulose -Infektion und Behandlung bei nicht-menschlichen Primaten

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

Modellierung von Tuberkulose Mycobacterium Marinum infizierten Erwachsenen Zebrafisch

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...