Estamos gratos pela assistência técnica do Dr. Suchitra Swaminathan que dirige o núcleo de Northwestern Feinberg escola de medicina Flow Cytometry. Financiamento foi fornecido pela DK101675 (NIH).

Todo o trabalho animal foi aprovado pelo IACUC a noroeste. Todos os experimentos foram concluídos em conformidade e em conformidade com todas as orientações institucionais e regulamentares pertinentes. Para doar sangue de seres humanos, um consentimento informado foi apresentado e assinado; Além disso, todos os seres humanos neste estudo foram tratados em conformidade com as orientações institucionais e federais para o bem-estar humano.
Nota: Os passos de protocolo são listados sob as subseções a seguir: (i) Mouse isolamento de célula da medula óssea; (ii) PMN isolamento de murino medula óssea; (iii) PMN isolamento de sangue humano; (iv) MP isolamento de PMN sobrenadantes (por ultracentrifugação); (v) a caracterização de MPs por mancha ocidental; (vi) caracterização de MPs por citometria de fluxo; (viii) a aplicação do MPs isolados para estudo ferida cura
1. Mouse isolamento de célula da medula óssea
<ol style="margin-left: 40px;"><li>
Dissecação do fêmur e tíbia das patas do rato
	<ol>
<li>Prepare uma caixa de eutanásia (por exemplo, uma caixa de dica vazio 1ml) para inalação de anestesia. Adicione algumas gotas de 100% de isoflurano em um pano estéril gravado no interior de uma tampa de caixa plástica. Conforme novas diretrizes IACUC, animais não deve entrar em contato direto com isoflurano, assim, coloque um suporte de ponta entre o rato e a gaze contendo o isoflurano. Nota: Isoflurano é um poderoso anestésico inalatório e deve ser manuseado com extremo cuidado dentro de uma coifa.</li>
		<li>Eutanásia em ratos conforme recomendação IACUC. Coloca um rato dentro da caixa de eutanásia descrita na etapa 1.1.1 para 1-5 min até que tenha cessado de respirar. Assegurar a morte do animal, realizando um deslocamento cervical.</li>
		<li>Levante a pele abdominal usando o aço inoxidável, 12 cm curvada, pinça de 0,17 X 0,1 mm e cortar a pele, a meio caminho entre as extremidades superiores e inferiores. Tirar a pele daqui a secção mais distal do corpo do mouse, incluindo nas extremidades inferiores. Com 10 cm de comprimento, em linha reta dissecando a tesoura, remover os músculos das pernas traseiras e deslocar a articulação do quadril, deixando a cabeça do fémur intacto.</li>
		<li>Use a tesoura para dissecar os músculos do fêmur e da tíbia e separar o fêmur a tíbia. Certifique-se de que as extremidades dos ossos permanecem intactas, pois eles contêm quantidades significativas de medula óssea.</li>
		<li>Retire toda a carne restante rolando os ossos dentro de uma toalha de papel. Coloque os ossos limpos em uma placa de Petri contendo meio livre de soro (SFM, i.e., médio modificado águia de Dulbecco (DMEM) sem soro ou antibióticos).</li>
		<li>Lave os ossos em etanol a 70% e depois em SFM.</li>
		<li>Prepare 50 mL de SFM em um tubo cónico de 50 mL. Carregar 10 mL de SFM em uma seringa de 10 mL e anexá-lo a uma agulha de calibre 25 e 5/8 de polegada.</li>
		<li>Apare a extremidade dos ossos com uma tesoura até uma abertura para a medula óssea (cor avermelhada) é visível.</li>
		<li>Lave as células da medula óssea para um novo tubo de 50 mL. Utilize uma seringa de 10 mL com uma agulha de calibre 26 e 5/8 de polegada com cerca de 3 mL/osso de SFM. Quando terminar a lavagem, Ressuspender as células no tubo pipetando (pontas aplicadoras descartáveis 1ml plástico) para quebrar os agregados de células.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. o PMN isolamento de murino de medula óssea
<ol><li>
Lise de eritrócitos
	<ol>
<li>Pelota de medula óssea coletada por centrifugação a 350 x g por 8 min a 4 ° C.</li>
		<li>Ressuspender as células em 20 mL de 0,2% NaCl para aproximadamente 20-30 s para lisar a fração de eritrócitos. Não exceda 30 s como isto irá resultar em lise PMN. Adicionar 20 mL de 1,6% NaCl para restaurar a pressão osmótica. Nota: Este passo pode levar à ativação de PMN muito pouco.</li>
		<li>Lave as células com 2 mL de PBS e centrífuga como na etapa 2.1.1 acima. Remova o sobrenadante.</li>
		<li>Prossiga para isolar PMN por centrifugação gradiente de densidade.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolamento de neutrófilos por centrifugação gradiente de densidade
	<ol>
<li>Polysucrose e sódio diatrizoate soluções warm, com densidades de 1,119 g/mL e 1,077 g/mL (ver Tabela de materiais), à temperatura ambiente (RT) antes do uso.</li>
		<li>Prepare polysucrose e sódio gradientes diatrizoate frescos, imediatamente antes da aplicação de célula da medula óssea por camadas lentamente 3 mL da solução de densidade acima de 3 mL da solução de densidade de 1,119 g/mL em tubos cônico de 15 mL de 1,077 g/mL. Nota: A preparação da solução de gradiente demasiada antecedência irá resultar em mistura das camadas e pobre pureza dos neutrófilos e recuperação.</li>
		<li>Resuspenda o pellet de células de medula óssea em 1 mL de PBS gelado e sobrepor a suspensão resultante da célula no topo do diatrizoate polysucrose e sódio gradiente (lentamente, para evitar a mistura das camadas).</li>
		<li>Centrífuga para 30 min a 850 x g a 25 ° C, a RT, sem freio. Manter os reagentes à RT para a separação eficaz dos neutrófilos de outras células presentes na medula óssea. Defina o centrifugador a desaceleração lenta para permitir o gradiente eficientemente ser formado e mantido após a etapa de centrifugação.</li>
		<li>Localize visualmente uma camada de células mononucleares na interface de PBS e 1,077 g/mL de solução de densidade (camada superior). Remova esta camada e o resto da solução de densidade sem perturbar a banda PMN.</li>
		<li>Colete uma camada inteira de PMN e alguns dos polysucrose subjacente e sódio diatrizoate 1,119 g/mL de solução em tubos de 15 mL com uma pipeta de transferência. Nota: A pureza do PMN isolado vai depender de uma completa remoção de camada superior.</li>
		<li>Cubra os tubos com filtrado PBS (filtrada através de um filtro de tamanho de poro de 0,1 µm) e centrifugar 300 x g por 5 min, a 4 ° C.</li>
		<li>Lave o PMN peletizadas com 2 mL de PBS usando condições de centrifugação, como na etapa 2.2.7.</li>
		<li>Resuspenda em 1 mL de PBS filtrada e contar o PMN isolado por hemocytometer. Nota: Para este método de isolamento, a pureza PMN resultante equivale a ~ 85-90%, como foi avaliada por citometria de fluxo. O restante fracções a contaminar constituída principalmente por linfócitos mononucleares.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Estimulação do PMN para induzir liberação de MP Nota: PMN pode ser estimulada para libertar MPs usando várias condições de activação, incluindo N-formyl-l-methionyl-leucyl-l-phenylalanine (fMLF), phorbol-12-miristato-13-acetato (PMA) ou interferão gama (relato). Importante, antes da simulação, PMN deve ser mantidos no gelo em todos os momentos.<ol>
<li>Pelota PMN (300 x g, 5 min, 4 ° C) e ressuspender em 0.1 µm filtrada Balanced Salt (HBSS) solução do Hank, contendo o agente estimulante de escolha. Para a estimulação ideal, use solução de estimulação de 100 µ l por PMN 10 milhões para 20-30 min a 37 ° C em tubos de 15 mL. Nota: As seguintes concentrações de ativadores foram usadas com sucesso em nosso trabalho anterior: fMLF (0,5-1 µM para humanos e 2-5 µM para rato PMN), PMA (200 nM) e relato (100 ng/mL). Se o lançamento do pre-etiquetados MPs é desejado, incubar unstimulated PMN (1-5 x 106) com N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC (ver Tabela de materiais) (1 µM em 100 µ l HBSS, 15 min, a 37 ° C). Prossiga com as etapas 2.3.1-2.3.3.</li>
		<li>Spin para baixo a 850 x g por 5 min a 4 ° C, para remover o PMN e sobrenadantes sem célula de transferência para novos tubos de microcentrifuga de 1,5 mL.</li>
		<li>Para isolamento de MP de sobrenadantes sem célula, continue a etapa 4.2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. o PMN isolamento do sangue humano
<ol><li>
Recrute voluntários saudáveis para a extração de sangue de acordo com as orientações institucionais IRB.
	<ol>
<li>Colete o sangue do antebraço de um voluntário saudável em tubos de citrato de sódio, contendo 5ml comercialmente disponíveis (ver Tabela de materiais).</li>
		<li>Pipetar 5 mL de solução de diatrizoate de dextrano e sódio (densidade de 1,113 g/mL, consulte Tabela de materiais) em tubos de 15ml estéril e, lentamente, camada 5 mL de recém isoladas do sangue periférico humano em cima dela.</li>
		<li>Centrifuga os tubos para 50 min em 400 x g em RT (25 ° C) com baixa aceleração e sem freio.</li>
		<li>No final da centrifugação, remova o plasma e células mononucleares (camada superior) utilizando uma pipeta de sucção plástica estéril.</li>
		<li>Transferi a camada inferior (PMN) para um novo tubo cônico estéril 50 mL.</li>
		<li>Adicionar um volume igual de 0,45% NaCl para PMN (misture bem e delicadamente girando o tubo).</li>
		<li>Centrifugação por 10min a 400 x g a 25 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lise de eritrócitos
	<ol>
<li>Adicionar 10 mL de água gelada e estéril para células peletizadas para 45 s seguido de 10 mL de estéril gelada 1,8% NaCl para restaurar a pressão osmótica. Nota: Todos os passos seguintes para isolamento de PMN devem ser realizados no gelo para evitar a ativação de PMN e lançamento prematuro do MP. A etapa de Lise em si resulta em ativação de PMN menor mas não significativa, no entanto, é essencial para isolar uma população PMN pura para ensaios funcionais.</li>
		<li>Centrifugar as células por 10 min a 250 x g a 4 ° C, com desaceleração suave.</li>
		<li>Repita as etapas 3.2.1 e 3.2.2.</li>
		<li>Resuspenda PMN em 5 mL de HBSS gelada sem cálcio ou magnésio. Contar as células ao vivo totais (usar um hemocytometer e viabilidade de coloração na diluição de 1:2, consulte a Tabela de materiais) antes de estimulação. Nota: PMN isolado deve ser usado para estimulação ou outras experiências até 2 horas de isolamento, para evitar alterações funcionais e celulares e morte celular.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. MP isolamento de PMN ativados sobrenadantes
Nota: Um protocolo similar é usado para a isolação de MPs de PMN murino e humano.
<ol><li>Pelota PMN (300 x g, 5 min, 4 ° C) e ressuspender em 0.1 µm filtrado solução HBSS, contendo o agente estimulante de escolha (por exemplo 1 µM fMLF, ver Nota: 2.3.1). Para a estimulação ideal use solução de estimulação de 100 µ l por PMN 10 milhões para 20-30 min a 37 ° C em tubos de 15 mL.</li>
	<li>Estimulação seguir, spin para baixo PMN ativados a 600 x g por 5 min a 4 ° C e transferir sem célula sobrenadantes para novos tubos de 1,5 mL microcentrifuge.</li>
	<li>Centrifugue o sobrenadante PMN-limpou a 13.000 x g, 10 min, 4 ° C para remover detritos celulares e transferir o sobrenadante apurado para um novo tubo de se.</li>
	<li>Centrífuga para 1h a 100.000 x g, a 4 ° C. Remova os sobrenadantes antes do armazenamento do MP. Conforme necessário, loja peletizado MPs em parafina selado tubos se a-80 ° C até o uso em experimentos.</li>
</ol>5. exame do PMN-MPs pela mancha ocidental
<ol><li>Adicionar o buffer de SDS 1% (50-200 µ l com pH de 100 mM Tris: 7,4) ao MPs de Pelotas (da etapa 4.4), transferência para novos tubos de 1,5 mL microcentrifuga e ferver o MPs lisado por 5 min. Nota: O número de deputados e o volume de tampão de Lise deve ser ajustado e otimizado para cada proteína de interesse.</li>
	<li>
Carrega quantidades iguais de PMN-MPs por lane em carregar o buffer que contém 10% de β-mercapto-etanol. Nota: Com o nosso método carregamos MPs que foram isoladas com o mesmo número de PMN estimulada.<ol>
<li>Separar os lysates por SDS-PAGE em gel de poliacrilamida de 10% (use V 50-100 para 1-1.5 h) e transferência de proteínas totais para membranas de nitrocelulose como descrito9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bloco de membranas para 1 h com leite desnatado de 5% em 0.05% Tween-20 Tris salino e incube-lo com um primário apropriado (durante a noite a 4 ° C), seguido por anticorpos secundarios conjugados a HRP.</li>
	<li>Visualize as bandas adicionando solução de quimiluminescência para a membrana e exposição de um filme de raio-x dentro de um estojo à prova de luz (1-24 h).</li>
</ol>6. exame do PMN-MPs por citometria de fluxo
<ol><li>
Para coloração de anticorpo, dilua a anticorpos apropriadamente no buffer de FACS (PBS com 0,1 mM EDTA, 0,1% de azida de sódio). Ressuspender peletizado PMN-MPs (derivado de 1-3 x 106 condição/PMN) em solução de anticorpo 100 µ l.
	<ol>
<li>Se a mancha para anexina V, resuspenda peletizado PMN-MPs em buffer anexina V contendo 5 µ l de conjugado FITC anexina V. Se co coloração com anticorpos, adicione os anticorpos desejados (para uma Tabela de materiais, consulte exemplo) diretamente para a solução de anexina V. Adicionar corante fluorescente lipídico, N-(2-aminoethyl) maleimide (ver Tabela de materiais), em 1 concentração de µM em 100 µ l de tampão de FACS para rotular e identificar o MPs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar o MPs na coloração de solução pelo menos 20 min a 4 ° C.</li>
	<li>Lave o MPs por ultracentrifugação (1 h a 100.000 x g, a 4 ° C); desprezar o sobrenadante.</li>
	<li>Resuspenda em buffer de FACS e executar os exemplos de um citômetro de fluxo designado equipado com uma unidade eletrônica melhorada para aumento da sensibilidade (ver Tabela de materiais).</li>
</ol>7. os pedidos de PMN-MPs isolados estudar a função PMN na cicatrização de feridas
<ol><li>
Administração in vivo de PMN-MPs para feridas do cólon
	<ol>
<li>ANESTHETIZE ratos por uma injeção intraperitoneal de uma mistura de cetamina (100 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg). Confirmar a anestesia por pedal reflex (pitada de dedo firme) e ajustar conforme necessário.</li>
		<li>Coloque o mouse sobre seu estômago e usando a pinça de biopsia de 28 cm e um endoscópio equipado com uma câmera de alta resolução (tais como um endoscópio veterinário para uso de animais pequeno, consulte Tabela de materiais), gerar 3-5 feridas superficiais ao longo da face dorsal da dois pontos. Após a conclusão do ferimento, ratos de retorno para uma gaiola colocado sobre uma esteira de temperatura controlada (37 ° C) até que se recuperou.</li>
		<li>Anestesia os ratos (como na etapa 7.1.1). Use um endoscópio para obter imagens dos ferimentos infligidos 24 h (dia 1) pós-ferindo. Deixe os ratos recuperar como na etapa 7.1.2.</li>
		<li>Ao mesmo tempo (24h pós-ferimento), administre murino PMN-MPs derivados de 2 x 106 PMN em 100 µ l de HBSS + diretamente em cada local de ferida usando uma microinjeção de colonoscopia-baseado sistema (uso uma agulha 29g)9. Três dias mais tarde (4º dia pós-ferindo) anestesia os ratos (como na etapa 7.1.1) e usa um endoscópio para readquirir imagens de cura feridas. Deixe os ratos recuperar como na etapa 7.1.2.</li>
		<li>Usando o software de análise de imagem preferida (ver Tabela de materiais), regiões de contorno visível ferimento em imagens adquiridas, medida da área do mesmo ferida nos dias 1 e 4 pós-ferindo e calcular a porcentagem de fechamento da ferida.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Humanos epiteliais células em vitro cicatrização de feridas
	<ol>
<li>Contagem de Caco-2 BBe ou T84, humanas células epiteliais intestinais por hemocytometer e semente de 5 x 105 células/poço em placas de cultura de 24-bem. Incube as células em uma câmara de padrão de incubação a 37 ° C e 5% de CO2. Caco-2 BBe ou T84 alcançar confluência dentro de 48 h9. Para cultura de células epiteliais, use DMEM e DMEM-F12 (50: 50) com suplementos como anteriormente descrito9.</li>
		<li>Gerar feridas zero mecânicas na monocamada usando uma ponta de pipeta e baixa sucção conforme descrito anteriormente,4,9. Adquirir imagens de áreas ferida imediatamente após riscar usando um microscópio de interferência diferencial de contraste de fase invertida (objectivos de utilização 5x ou 10x), para ser usado como um tempo = ponto de referência 0.</li>
		<li>Adicionar MPs (derivados de 2-4 X 106 PMN) de monocamadas de células epiteliais feridos de riscado e incubar por 24 h adicional (48 h pós-ferimento, a 37 ° C com 5% CO2). Neste momento re-adquira imagens das feridas-zero.</li>
		<li>Use o software de análise de imagem preferida (consulte Tabela de materiais) para medir áreas de ferimento em t = 0 e t = 48 h. calcular a porcentagem de fechamento da ferida, determinando a diferença na área ferida nos pontos de tempo selecionado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hickey, M. J., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+immunity:+the+host-pathogen+encounter+in+blood+vessels.">Intravascular immunity: the host-pathogen encounter in blood vessels.</a> Nat Rev Immunol. 9 (5), 364-375 (2009).</li><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nat Rev Immunol. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation.">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).</li><li>Butin-Israeli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+of+microparticles+by+neutrophils+onto+inflamed+epithelium:+a+new+mechanism+to+disrupt+epithelial+intercellular+adhesions+and+promote+transepithelial+migration.">Deposition of microparticles by neutrophils onto inflamed epithelium: a new mechanism to disrupt epithelial intercellular adhesions and promote transepithelial migration.</a> FASEB J. , (2016).</li><li>Gasser, O., Schifferli, J. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-derived+microvesicles+enter+cartilage+and+protect+the+joint+in+inflammatory+arthritis.">Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis.</a> Sci Transl Med. 7 (315), (2015).</li><li>Andersson, T., Dahlgren, C., Lew, P. D., Stendahl, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+expression+of+fMet-Leu-Phe+receptors+on+human+neutrophils.+Correlation+to+changes+in+the+cytosolic+free+Ca2++level+and+action+of+phorbol+myristate+acetate.">Cell surface expression of fMet-Leu-Phe receptors on human neutrophils. Correlation to changes in the cytosolic free Ca2+ level and action of phorbol myristate acetate.</a> J Clin Invest. 79 (4), 1226-1233 (1987).</li></ol>

Os autores não têm nenhum conflito de interesses, de qualquer tipo relacionado com a presente comunicação

Protocolos para o isolamento e caracterização de MPs PMN-derivados são descritos na presente comunicação. Vários pontos chaves de críticos devem ser tomados em consideração para o sucesso do procedimento. Primeiro, o PMN deve ser isolada fresco e deve ser usado em experimentos com até 2 horas de isolamento para impedir a desgranulação e activação espontânea. Toda manipulação de PMN durante o isolamento e até ao ponto de estimulação deve ser executada no gelo para evitar a activação e prematuro MP ve...

Recentemente, "micropartículas/aumentada" provenientes do citosol celular ou membrana plasmática tornaram-se de grande interesse científico, como dados emergentes sugerem que estas estruturas, que variam de 50-1.000 nm de diâmetro, podem carregar informações biológicas e Servi como um método não-canônicos de comunicação celular. Imunológico derivado de células MPs e particularmente aqueles produzidos por neutrófilos polimorfonucleares (PMN) são de grande interesse, dado o papel importante de PMN no anfitrião defesa1,2, respostas inflamatórias3e cicatrização de feridas 4. é intrigante, até agora, inúmeros relatos mostraram funções pró-inflamatórias e anti-inflamatórias do PMN-MPs5, sugerindo um potencial contexto-, doença, espécie- e papel de órgão específico de MPs.
Protocolos descritos na presente comunicação fornecem um método econômico, inovadora e adaptável para estudar a função do MPs na saúde e na doença. São aplicáveis a muitos organismos modelo, órgãos e as condições de estimulação. Eles permitem a identificação de vários tipos de MPs e podem ser usados no futuro para abordar suas funções pro-inflamatórias e antiinflamatórias. Como exemplo, descrito aqui é como estudar a função de PMN-MPs em epiteliais ferida cura in vitro e em vivo. O protocolo apresentado para isolamento de rato PMN derivadas da medula óssea foi adaptado com algumas modificações de um método descrito anteriormente6.
Além disso, os protocolos descritos neste estudo permitem para a detecção e caracterização de marcadores específicos que podem ser encontrados na PMN-MPs por dois métodos complementares: Western blot e citometria de fluxo. Encontramos que immunoblotting de MPs usando protocolos padrão5 é fácil e confiável, no entanto, os avanços recentes na sensibilidade dos instrumentos de citometria de fluxo e relação de sinal-para-ruído melhorada agora permitam para posterior análise de MPs usando esse método. Os protocolos descritos neste estudo incorporam avanços recentes e recomendações de artigos originais de pesquisa, incluindo modificações de velocidade de centrifugação e tempo, a adição da amostra de filtragem e congelamento/armazenamento condições7 , 8e como reduzir o "ruído de fundo", aumentar o limite de detecção do PMN-MPs e discriminar entre diferentes tamanhos de MPs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:968px;" width="967">
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">DMEM</td>
			<td style="width:181px;">Corning</td>
			<td style="width:181px;">10-041-CV</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">Fetal Bovine Serum (Heat inactivated)</td>
			<td style="width:181px;">Atlanta Biologics</td>
			<td style="width:181px;">S11150</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:257px;">Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)</td>
			<td style="width:181px;">GIBCO</td>
			<td style="width:181px;">15140</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">0.5 M EDTA</td>
			<td style="width:181px;">Fisher</td>
			<td style="width:181px;">BP2482</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:257px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">S9888</td>
			<td style="width:348px;">Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">Sterile filtered Histopaque 1077</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">Sterile filtered Histopaque 1119</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">11191</td>
			<td style="width:348px;">Density 1.119 g/ml.&#160; Solution of polysucrose and&#160; sodium diatrizoate. Bring to room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium</td>
			<td style="width:181px;">Cellgro</td>
			<td style="width:181px;">210-40-CV</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">Ethyl Alcohol (200 proof)</td>
			<td style="width:181px;">Decon labs</td>
			<td style="width:181px;">2701</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">HBBS</td>
			<td style="width:181px;">Corning</td>
			<td style="width:181px;">21-022-CV</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">T8154&#160;SIGMA</td>
			<td style="width:348px;">Diluted 1:2 for cell viability counting</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:181px;">Abbot</td>
			<td style="width:181px;">50033</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">Anti-human CD11b-APC conjugated</td>
			<td style="width:181px;">Biolegend</td>
			<td style="width:181px;">301350</td>
			<td style="width:348px;">Clone ICRD44 (Final concetration: 1 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">BODIPY FL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B10250</td>
			<td style="width:348px;">N-(2-aminoethyl) maleimide&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Annexin V Binding Buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>422201</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Calibration Beads for Flow Cytometry</td>
			<td>BioCytex</td>
			<td>7803</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">FITC Annexin V</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>640906</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Polymorphprep</td>
			<td>Axis-Shield PoC AS</td>
			<td></td>
			<td style="width:348px;">Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">C57BL/6 mice</td>
			<td style="width:181px;">Jackson Labs</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:257px;">15 ml centrifuge tubes</td>
			<td style="width:181px;">Corning</td>
			<td style="width:181px;">430053</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">50 ml centrifuge tubes</td>
			<td style="width:181px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:181px;">352070</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">25 ml serological pipettes</td>
			<td style="width:181px;">Celltreat</td>
			<td style="width:181px;">229225B</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">10 ml serological pipettes</td>
			<td style="width:181px;">Celltreat</td>
			<td style="width:181px;">229210B</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">5 ml serological pipettes</td>
			<td style="width:181px;">Celltreat</td>
			<td style="width:181px;">229205B</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">Pasteur pipettes&#160;</td>
			<td style="width:181px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:181px;">357575</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles)</td>
			<td style="width:181px;">BD</td>
			<td style="width:181px;">305122</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">100 &#181;m cell strainers</td>
			<td style="width:181px;">Celltreat</td>
			<td style="width:181px;">229485</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:257px;">Vacutainer tubes</td>
			<td style="width:181px;">BD</td>
			<td style="width:181px;">367251</td>
			<td style="width:348px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP)</td>
			<td>BD</td>
			<td>(SORP)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Swinging bucket centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75007210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>(L8-80 M)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Micro-centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;VV-17703-15 (Fresco 17)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Swinging bucket centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;75004503 (Megafuge 40R)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Biopsy forceps, 28 cm</td>
			<td>Storz</td>
			<td>27071zj</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Image J</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td>Open source&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of neutrophil-derived microparticles for functional studies

Micropartículas de derivado de neutrófilos polimorfonucleares (PMN)-MPs) são bicapa lipídica, aumentada esféricas com tamanhos que variam de 50 – 1.000 nm de diâmetro. MPs são uma recém evoluindo, parte importante de máquinas de sinalização e comunicação célula a célula. Por causa de seu tamanho e a natureza de sua libertação, até recentemente, existência de MP foi negligenciada. No entanto, com tecnologia melhorada e métodos analíticos a sua função na saúde e na doença está a emergir. Os protocolos aqui apresentados destinam-se a isolar e caracterizar PMN-MPs pelo immunoblotting e citometria de fluxo. Além disso, vários exemplos de implementação são dadas. Esses protocolos para isolamento de MP são rápidos e de baixo custo e não exigem o uso de kits caros. Além disso, eles permitem a rotulagem do MPs após isolamento, bem como pré-marcação de células de origem antes da liberação do MP, usando um corante fluorescente de membrana específicos para visualização e análise por citometria de fluxo. Esses métodos, no entanto, tem várias limitações, incluindo a pureza do PMN e MPs e a necessidade de instrumentação analítica sofisticada. Um citômetro de fluxo high-end é necessário confiável analisar MPs e minimizar falsas positivas leituras devido ao ruído ou autofluorescência. Os protocolos descritos podem ser usados para isolar e definir a biogênese de MP e caracterizam seus marcadores e variação na composição sob diferentes condições de estimulantes. Heterogeneidade de tamanho pode ser explorada para investigar se o conteúdo de partículas de membrana contra exosomes é diferente, e se cumprem papéis diferentes na homeostase do tecido. Finalmente, seguir isolamento e caracterização de MPs, sua função na resposta celular e vários modelos de doença (incluindo, desordens inflamatórias associadas PMN, tais como doenças inflamatórias intestinais ou lesão pulmonar aguda) podem ser explorados.

Análise de fluxo representativo cytometric do MPs que foram isoladas de humanos e mouse PMN são mostrados na Figura 1. A heterogeneidade de tamanho do PMN-MPs pode ser avaliada por comparação com grânulos de tamanhos conhecidos como mostrado na Figura 1A, B para humanos MPs. nota, sem diferenças significativas na heterogeneidade de tamanho foram observadas entre o rato e MPs humanas. Da mesma forma, usando ...

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Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Novos protocolos são descritos aqui para isolar e caracterizar micropartículas derivadas de humanos e neutrófilos de rato. Estes protocolos utilizam ultracentrifugação, citometria de fluxo e immunoblotting técnicas para analisar o conteúdo de micropartículas, e eles podem ser usados para estudar o papel das micropartículas derivados de vários tipos de células na função celular.

Isolamento e caracterização de micropartículas de neutrófilos-derivado para estudos funcionais

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

isolation-characterization-neutrophil-derived-microparticles-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.1K visualizações.  Northwestern University. Novos protocolos são descritos aqui para isolar e caracterizar micropartículas derivadas de humanos e neutrófilos de rato. Estes protocolos utilizam ultracentrifugação, citometria de fluxo e immunoblotting técnicas para analisar o conteúdo de micropartículas, e eles podem ser usados para estudar o papel das micropartículas derivados de vários tipos de células na função celular.

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Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

Isolamento de células do sistema imunológico funcional cardíaca

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Imunologia e Infecção

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Isolamento de citometria de fluxo de células primárias Murino Tipo II epiteliais alveolares de Estudos funcionais e Molecular

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

Isolamento, purificação e Rotulagem de neutrófilos da medula óssea do rato de Estudos funcionais e Experimentos de transferência adotiva

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is initiated by interaction of the pathogen with intestinal epithelial cells. This interaction leads to disruption of intercellular structures such as tight junctions (TJ). TJ ensure sealing of the epithelial layer to separate host tissue from gut lumen. Recent studies provide evidence that disruption of TJ by the parasitic protein EhCPADH112 is a prerequisite for E. histolytica invasion that is accompanied by epithelial barrier dysfunction. Thus, the analysis of molecular mechanisms involved in TJ disassembly during E. histolytica invasion is of paramount importance to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis. This article presents an easy model that allows the assessment of initial host-pathogen interactions and the parasite invasion potential. Parameters to be analyzed include transepithelial electrical resistance, interaction of EhCPADH112 with epithelial surface receptors, changes in expression and localization of epithelial junctional markers and localization of parasite molecules within epithelial cells.

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Human infection by Entamoeba histolytica leads to amoebiasis, a major cause of diarrhea in tropical countries. Infection is initiated by pathogen interactions with intestinal epithelial cells, provoking the opening of cell-cell contacts and consequently diarrhea, sometimes followed by liver infection. This article provides a model to assess the early host-pathogen interactions to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis.

Análise do dano epitelial Produzido pela<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infecção

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

Detecção de glicogênio no sangue periférico células mononucleares com Periodic Acid Schiff Coloração

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading microorganisms. In addition, neutrophils play a central role in the immune surveillance of tumor cells. They have the ability to recognize tumor cells and induce tumor cell death either through a cell contact-dependent mechanism involving hydrogen peroxide or through antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Neutrophils with anti-tumor activity can be isolated from peripheral blood of cancer patients and of tumor-bearing mice. These neutrophils are termed tumor-entrained neutrophils (TEN) to distinguish them from neutrophils of healthy subjects or na&#239;ve mice that show no significant tumor cytotoxic activity. Compared with other white blood cells, neutrophils show different buoyancy making it feasible to obtain a &#62; 98% pure neutrophil population when subjected to a density gradient. However, in addition to the normal high-density neutrophil population (HDN), in cancer patients, in tumor-bearing mice, as well as under chronic inflammatory conditions, distinct low-density neutrophil populations (LDN) appear in the circulation. LDN co-purify with the mononuclear fraction and can be separated from mononuclear cells using either positive or negative selection strategies. Once the purity of the isolated neutrophils is determined by flow cytometry, they can be used for in vitro and in vivo functional assays. We describe techniques for monitoring the anti-tumor activity of neutrophils, their ability to migrate and to produce reactive oxygen species, as well as monitoring their phagocytic capacity ex vivo. We further describe techniques to label the neutrophils for in vivo tracking, and to determine their anti-metastatic capacity in vivo. All these techniques are essential for understanding how to obtain and characterize neutrophils with anti-tumor function.

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

Isolamento e Caracterização de neutrófilos com propriedades anti-tumorais

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Um modelo de tecido Pulmão humano 3D para estudos funcionais em<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infecção

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.

We have established a technique for the isolation, phenotypic characterization and functional analysis of immune cells from murine gingiva.

Isolamento, caracterização e exploração funcional da célula de rede gengival Imune

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

Isolamento e Caracterização de citometria de fluxo de linfócitos de murino Intestino Delgado

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the allograft early after transplantation, mount a graft reactive response against the transplanted organ, and initiate organ rejection2. Recent data suggest that suppressive macrophages facilitate successful long-term transplantation3 and are required for the induction of transplantation tolerance4. This suggests a multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation, and function, which demands a new roadmap for the isolation and analysis of macrophage function5. Due to the plasticity of macrophages, it is necessary to provide a methodology to isolate and characterize macrophages, depending on the tissue environment, and to define their functions according to different scenarios. Here, we describe a protocol for immune characterization of graft-infiltrating macrophages and the methods we used to functionally evaluate their capacity to inhibit CD8+ T proliferation and to promote CD4+Foxp3+ Treg expansion in vitro.

Macrophages are plastic cells of the hematopoietic system that have a crucial role in protective immunity and homeostasis. In this report, we describe optimized in vitro techniques to phenotypically and functionally characterize graft-infiltrating regulatory macrophages that accumulate in the transplanted organ under tolerogenic conditions.