Name: isolation and characterization of neutrophil-derived microparticles for functional studies
Uploaded: 2018-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies at JoVE.com

우리는 북서부 Feinberg 학교의 의학 교류 Cytometry 코어를 실행 하는 박사 Suchitra Swaminathan의 기술 지원에 대 한 감사입니다. 자금 (NIH) DK101675에 의해 제공 했다.

모든 동물 일 북서부 IACUC에 의해 승인 되었다. 모든 실험은 모든 관련 규제 기관 지침 준수에 따라 완료 되었습니다. 인체 혈액 기부에 대 한 동의 제시 되었고 서명; 또한,이 연구에서 모든 인간의 과목 인간의 복지에 대 한 기관 및 연방 정부 지침에 따라 치료 했다.
참고: 프로토콜 단계는 다음 하위 섹션 아래에 나열 됩니다: (i) 마우스 골 수 세포 격리; (ii) PMN 격리에서 Murine 골; (iii) PMN 별개로 인간 혈액; (iv) MP 별개로 PMN Supernatants (로 Ultracentrifugation); (v) 서 부 럽;에 의해 MPs의 특성 (vi) Cytometry;에 의해 MPs의 특성 (8 세)의 응용 프로그램 격리 된 MPs 연구 상처 치유
1. 마우스 골 수 세포 격리
<ol style="margin-left: 40px;"><li>
대 퇴 골과 경골 마우스 뒷 다리에서의 해 부
	<ol>
<li>흡입 마 취에 대 한 (예를 들어, 빈 1 mL 팁 상자) 안락사 상자를 준비 합니다. 100 %isoflurane 녹화 플라스틱 상자 뚜껑의 안쪽에 메 마른 헝겊에 몇 방울을 추가 합니다. 새로운 IACUC 지침에 의하여 하지 동물 isoflurane와 직접 접촉에와 서, 따라서 마우스와는 isoflurane 포함 된 거 즈 팁 홀더를 배치 한다. 참고: Isoflurane 강력한 inhalational 마 취 이며 증기 두건 안쪽 극단주의 함께 처리 되어야 합니다.</li>
		<li>IACUC 추천에 의하여 쥐 안락사 그것은 호흡을 정지 했다 때까지 1-5 분 1.1.1 단계에서 설명한 안락사 상자 안에 마우스를 놓습니다. 자 궁 경부 전위를 수행 하 여 동물의 죽음을 확인 합니다.</li>
		<li>족집게 0.17 m m X 0.1 m m 스테인리스, 곡선, 12 cm를 사용 하 여 복 부 피부와 위와 더 낮은 사지 사이 절반 방법 피부를 잘라. 여기에서 더 낮은 말단을 포함 하 여 마우스 신체의 가장 말 초 부분에 피부 껍질. 10 cm 긴, 똑바로 해 부가 위, 뒷 다리에서 근육을 제거 하 고 대 퇴 골 머리 그대로 엉덩이 관절 탈 구.</li>
		<li>가 위를 사용 하 여 대 퇴 골 및 경골 근육 해 부 및 대 퇴 골은 경골에서 분리. 뼈의 끝 그대로 그대로 골의 상당한 금액을 포함 하는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>종이 타월 내 뼈를 압 연 하 여 모든 나머지 살을 제거 합니다. 혈 청 무료 매체 (SFM, 즉, 혈 청 또는 항생제 없이 Dulbecco의 수정 독수리의 매체 (DMEM))를 포함 하는 페 트리 접시에 깨끗 한 뼈를 놓습니다.</li>
		<li>70% 에탄올에 그리고 SFM에 뼈를 씻어.</li>
		<li>50 mL 원뿔 튜브에 SFM의 50 mL를 준비 합니다. 10 mL 주사기에 SFM의 10 mL를 로드 하 고 25 및 5/8 인치 계기 바늘에 첨부.</li>
		<li>골 수 (붉은 색) 하 여 표시 될 때까지 위는 뼈의 끝을 잘라.</li>
		<li>새로운 50 mL 튜브로 골 수 세포를 플러시. 10 mL 주사기를 사용 하 여 약 3 mL/뼈 SFM의 26, 5/8 인치 계기 바늘. 끝나면 홍 조 셀 집계를 (사용 일회용 1 mL 플라스틱 팁)를 pipetting으로 튜브에 세포를 resuspend.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PMN 격리 Murine 골 수에서
<ol><li>
붉은 세포 세포의 용 해
	<ol>
<li>Centrifuging 350 x g 4 ° c.에 8 분에 의해 수집 된 골 수를 작은</li>
		<li>0.2%의 20 mL에 셀 펠 릿 resuspend lyse 적혈구 분수를 약 20-30 s NaCl. 30을 초과 하지 않도록이 s PMN 세포 귀 착될 것 이다. 추가 20 mL 1.6%의 NaCl osmolality 복원 하. 참고:이 단계는 매우 작은 PMN 활성화 이어질 수 있습니다.</li>
		<li>씻으십시오 2 mL PBS와 2.1.1 위의 단계 에서처럼 원심 분리기의 셀. 제거는 상쾌한.</li>
		<li>분리 PMNs 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 진행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
조밀도 기온 변화도 원심 분리에 의해 호 중구의 격리
	<ol>
<li>따뜻한 polysucrose와 나트륨 diatrizoate 솔루션, 1.119 g/mL 및 1.077 g/mL ( 재료의 표참조), 사용 하기 전에 실내 온도 (RT)의 밀도와.</li>
		<li>Polysucrose와 나트륨 diatrizoate 그라디언트 신선한, 천천히 1.077 g/mL 밀도 솔루션 15 mL 원뿔 튜브에 1.119 g/mL 밀도 솔루션의 이상 3 mL의 3 mL을 레이어 링 하 여 골 수 세포 응용 프로그램 직전 준비 합니다. 참고: 사전에 너무 멀리 그라데이션 솔루션의 준비 레이어 및 가난한 호 중구 순도 복구 발생 합니다.</li>
		<li>얼음 처럼 차가운 PBS의 1 mL에 골 셀 펠 릿을 resuspend와 polysucrose와 나트륨 diatrizoate 위에 결과 세포 현 탁 액을 오버레이 그라데이션 (천천히, 레이어 혼합을 피하기 위해).</li>
		<li>850 x g 브레이크 없이RT에서 25 ° c에서 30 분 동안 원심 분리기. 골 수에 있는 다른 세포는 호 중구의 효과적인 분리에 대 한 RT에는 시 약을 계속. 그라데이션 효율적으로 형성 하 고 원심 분리 단계 후에 유지 될 수 있도록 천천히 감속에 있는 원심 분리기를 설정 합니다.</li>
		<li>시각적으로 단 셀 레이어를 PBS와 1.077 g/mL 밀도 솔루션 (상위 계층)의 인터페이스에서 찾습니다. PMN 밴드를 방해 하지 않고이 레이어와 밀도 솔루션의 나머지 부분을 제거 합니다.</li>
		<li>15 mL 튜브 전송 피 펫을 사용 하 여 전체 PMN 레이어 및 기본 polysucrose와 나트륨 diatrizoate 1.119 g/mL 해결책의 일부를 수집 합니다. 참고: 격리 PMNs의 순도 상위 계층의 완전 한 제거에 따라 달라 집니다.</li>
		<li>필터링 된 PBS (0.1 µ m 기 공 크기 필터를 통해 필터링)와 4 ° c.에서 5 분, 300 x g에서 원심 분리기 튜브 탑</li>
		<li>2.2.7 단계에서 원심 분리 조건을 사용 하 여 PBS의 2 mL와 수송과 PMNs 워시.</li>
		<li>필터링 된 PBS의 1 mL에 resuspend 및 격리 PMNs hemocytometer 여. 참고:이 격리 방법에 대 한 결과 PMN 순도에 도달 ~ 85-90%, cytometry에 의해 평가 되었다. 분수를 오염 하는 나머지 단 세포의 주로 구성 되어 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MP 출시를 유도 하기 위해 PMN 자극 참고: PMNs MPs N-formyl-l-methionyl-leucyl-l-phenylalanine (fMLF), phorbol-12-myristate-13-아세테이트 (PMA), 또는 인터페론 감마 (IFNγ)를 포함 하 여 다양 한 활성화 조건을 사용 하 여 릴리스를 자극 수 있습니다. 중요 한 것은, 시뮬레이션, 이전 PMNs 지켜져야 한다 얼음에 항상.<ol>
<li>펠 릿 PMNs (300 g, 5 분, 4 ° C) 및 0.1 µ m에 resuspend 포함 하는 선택의 자극 에이전트 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 솔루션, 필터링. 최적의 자극에 대 한 15 mL 튜브에 37 ° C에서 20-30 분 동안 10 백만 PMNs 당 100 µ L 자극 솔루션을 사용 합니다. 참고: 다음 활성 제 농도 성공적으로 우리의 이전 작품에 사용 되었다: fMLF (0.5-1 µ M 인간과 마우스 PMNs에 대 한 2-5 µ M에 대 한), PMA (200 nM), 및 IFNγ (100 ng/mL). 사전 분류 MPs의 릴리스를 원하는 경우 unstimulated PMNs 품 어 (1-5 10 배6) N-(2-aminoethyl) maleimide-FITC와 ( 재료의 표참조) (100 µ L HBSS, 15 분, 37 ° C에서에서 1 µ M). 진행 단계 2.3.1-2.3.3.</li>
		<li>PMNs 제거 하 고 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브 셀 무료 supernatants 전송 하 4 ° C에서 5 분 동안 850 x g에 아래로 회전 합니다.</li>
		<li>셀 무료 supernatants 별개로 MP, 4.2 단계로 계속.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 인간의 혈액에서 PMN 격리
<ol><li>
기관 IRB 지침에 따라 혈액 추출에 대 한 건강 한 자원 봉사자를 모집 합니다.
	<ol>
<li>상용 5 mL 나트륨 시트르산 포함 된 튜브 ( 재료의 표참조)로 건강 한 자원 봉사자의 팔 뚝에서 피를 수집 합니다.</li>
		<li>Dextran 및 나트륨 diatrizoate 솔루션의 5 mL를 플라스틱 (1.113 g/mL의 조밀도 재료의 표참조) 살 균 15 mL 튜브와 천천히 레이어 위에 갓 고립 된 인간 주변 혈액 5 mL로.</li>
		<li>50 분 낮은 가속 RT (25 ° C)에서 g x 400와 아무 브레이크 튜브 원심</li>
		<li>원심 분리의 끝에, 플라스마와 단 세포 (상위 계층) 살 균 플라스틱 흡입 피 펫을 사용 하 여 제거 합니다.</li>
		<li>레이어 (PMNs) 새로운 살 균 50 mL 원뿔 튜브로 전송 합니다.</li>
		<li>0.45%의 동일한 볼륨 추가 NaCl PMNs (믹스 잘 부드럽게 튜브를 회전 하 여)을.</li>
		<li>25 ° c.에 400 x g에서 10 분 원심 분리기</li>
	</ol>
</li>
	<li>
붉은 세포 세포의 용 해
	<ol>
<li>45 수송과 셀에 얼음 처럼 차가운, 살 균 물 10 mL를 추가 s 뒤에 10 mL의 얼음 처럼 차가운 살 균 1.8% NaCl osmolality 복원 하. 참고: PMN 격리에 대 한 모든 다음 단계 PMN 활성화 및 조기 MP 출시 방지 하기 위해 얼음에 수행 되어야 한다. 그러나 자체 세포 단계 결과 사소한 그러나 중요 하지 PMN 활성화에,, 그것은 기능 분석에 대 한 순수한 PMN 인구를 분리 하는 데 필수적입니다.</li>
		<li>부드러운 감속으로 4 ° C에서 250 x g에서 10 분 동안 셀 원심</li>
		<li>3.2.1, 3.2.2 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>얼음 처럼 차가운 HBSS 칼슘 또는 마그네슘의 5 ml에서 PMNs resuspend. 총 라이브 셀 (hemocytometer와 생존 1:2 희석에 얼룩을 사용 하 여 테이블의 자료를 참조 하십시오) 자극 하기 전에. 참고: 격리 PMNs 수 사용 해야 자극 또는 절연의 2 h 이내 다른 실험에 대 한 변경 기능 및 세포와 세포 죽음을 피하기 위해 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. MP 격리 활성화 PMN Supernatants에서
참고: 비슷한 프로토콜 murine 인간과 PMNs에서 MPs의 절연을 위해 사용 됩니다.
<ol><li>펠 릿 PMNs (300 g, 5 분, 4 ° C) 및 0.1 µ m에 resuspend 필터링 HBSS 솔루션을 포함 하는 선택의 자극 에이전트 (예 1 µ M fMLF 참조 참고: 2.3.1). 최적의 자극에 대 한 15 mL 튜브에 37 ° C에서 20-30 분 동안 10 백만 PMNs 당 100 µ L 자극 솔루션을 사용 합니다.</li>
	<li>다음 자극, 활성화 PMNs 600 x g 4 ° C에서 5 분 동안에 아래로 회전 하 고 새로운 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포 무료 supernatants 전송.</li>
	<li>PMN 허가 상쾌한 13000 x g, 10 분, 세포 파편을 제거 하 고 새로운 ultracentrifuge 관으로 지운된 상쾌한 전송 하 4 ° C에서 원심</li>
	<li>4 ° c.에 100000 x g에서 1 시간을 위한 원심 분리기 Supernatants MP 저장 하기 전에 제거 합니다. 필요에 따라 저장소 수송과 MPs 파라핀 실험에서 사용까지-80 ° C에서 ultracentrifuge 관 봉인에.</li>
</ol>5. 서양 Blotting에 의해 PMN MPs의 검사
<ol><li>1 %SDS 버퍼 추가 (50-200 µ L 100 mM Tris ph: 7.4) MPs를 펠 렛 (4.4 단계)에서 전송 새로운 1.5 mL microcentrifuge 관에 고 5 분 동안 lysed MPs를 삶아. 참고: 수 MPs와 세포의 용 해 버퍼 볼륨 조정 고 관심사의 각 단백질에 대 한 최적화 될 해야 합니다.</li>
	<li>
Β-mercapto-에탄올 10%를 포함 하는 버퍼를 로드 레인 당 같은 양의 PMN MPs를 로드 합니다. 참고: 우리의 방법으로 우리 자극된 PMNs의 동일한 수에서 고립 되었다 MPs 로드 합니다.<ol>
<li>10 %polyacrylamide 젤에 SDS 페이지 lysates 분리 (50-100 V을 사용 하 여 1-1.5 h에 대 한) 니트로 막에 총 단백질 설명된9로 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>막 5% 비-지방 우유 0.05% 트윈 20 Tris 버퍼 염 분에서 1 시간에 대 한 차단 하 고 뒤에 보조 HRP 활용 된 항 체 (하룻밤에 4 ° C), 적절 한 기본으로 품 어.</li>
	<li>막 하는 광선이 카세트 (1-24 h) 내부는 x 선 필름에 노출 chemoluminescence 솔루션을 추가 하 여 밴드를 시각화 합니다.</li>
</ol>6. Cytometry에 의해 PMN MPs의 검사
<ol><li>
항 체 얼룩이 지기 위해 FACS 버퍼 (PBS 0.1 m m EDTA, 0.1% 나트륨 아 지 드)에 적절 하 게 항 체 희석. Resuspend 수송과 PMN MPs (10 x 1-3에서 파생 된6 PMNs/조건) 100 µ L 항 체 솔루션에서.
	<ol>
<li>Annexin V에 대 한 얼룩, FITC 활용 Annexin V의 5 µ L를 들어 Annexin V 버퍼에 수송과 PMN MPs를 resuspend. 공동 항 체와 얼룩, Annexin V 솔루션에 직접 원하는 항 체 (대 한 예에서는 참조 테이블의 재료)를 추가 합니다. 추가 지질 형광 염료, N-(2-aminoethyl) maleimide ( 재료의 표참조), 레이블 및 MPs 식별 하 FACS 버퍼의 100 µ L에 1 μ M 농도에서.</li>
	</ol>
</li>
	<li>4 ° c.에 20 분 이상 솔루션 얼룩에 MPs를 품 어</li>
	<li>Ultracentrifugation (4 ° C에서 100000 x g에서 1 h);에 의해 MPs를 씻어 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>FACS 버퍼에 resuspend 및 증가 한 감도 위해 업그레이드 된 전자 장치를 갖춘 지정 된 교류 cytometer에서 샘플을 실행 ( 재료의 표참조).</li>
</ol>7. 상처 치유에 PMN 함수 공부 절연된 PMN MPs에 대 한 응용 프로그램
<ol><li>
Vivo에서 관리 PMN MPs의 저 승 상처
	<ol>
<li>케 타 민 (100mg/kg) 및 xylazine (5 mg/kg)의 혼합물의 복 주사 하 여 쥐를 anesthetize. 페달 반사 (회사 발가락 핀치)에 의해 마 취를 확인 하 고 필요한 조정.</li>
		<li>그것의 위에에 28 cm 생 겸 고해상도 카메라가 장착 된 내 시경을 사용 하 여 마우스를 두고 (작은 동물 사용에 대 한 수의 내 시경 같은 재료의 표참조), 생성의 등 쪽 측에 따라서 3-5 표면 상처는 콜론입니다. 완료 되 면 부상, 반환 쥐 감 금 소에 복구 될 때까지 온도 제어 (37 ° C) 매트에 배치.</li>
		<li>(단계 7.1.1) 에서처럼 마우스 anesthetize 내 시경을 사용 하 여 해 상처 후 24 시간 (1 일) 부상의 이미지. 마우스 단계 7.1.2로 복구 하자.</li>
		<li>(24 시간 후 부상) 동시에 murine PMN MPs에9시경 기반 microinjection 시스템 (29 G 바늘 사용) 사용 하 여 각 상처 사이트에 HBSS + 직접 100 µ L에서 2 x 106 PMNs에서 파생 된 관리. 3 일 (7.1.1 단계)로 마우스를 anesthetize 하 고 내 시경을 사용 하 여 상처 치유의 이미지를 다시 가져오는 나중 (4 일 후 부상). 마우스 단계 7.1.2로 복구 하자.</li>
		<li>선호 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 인수 이미지, 측정 같은 영역 일 1과 4 후 부상, 상처와 상처 폐쇄의 비율을 계산에서 (참조 테이블의 자료), 개요 보이는 상처 영역.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
인간 상피 세포 생체 외에서 상처 치유
	<ol>
<li>수 Caco-2 BBe 또는 T84, hemocytometer 씨앗 5 x 105 셀/잘 24-잘 문화 접시에 의해 인간 장 상피 세포. 37 ° C, 5% CO2표준 보육 챔버에 세포를 품 어. Caco-2 BBe 또는 T84 48 h9에서 confluency 도달. 상피 세포 문화, 이전 DMEM과 DMEM-F12 (50: 50) 보조 제와 함께 사용 설명9.</li>
		<li>앞에서 설명한4,9피 펫 팁 및 낮은 흡입을 사용 하 여 단층에 기계적 스크래치 상처를 생성 합니다. 시간으로 사용 되는 반전된 단계 대조 미분 간섭 현미경 (사용 5 배 또는 10 배 목표)를 사용 하 여 긁 직후 상처 영역에의 이미지를 수집 = 0 참조 포인트.</li>
		<li>긁힌 상처 상피 세포 monolayers를 MPs (2-4 X 106 PMNs에서에서 파생 됨)을 추가 하 고 추가 24 h (48 h 후 부상, 5% CO2와 37 ° C에서)에 대 한 품 어. 이 이번에 다시 처음 상처의 이미지를 취득 합니다.</li>
		<li>선호 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 ( 재료의 표참조) t 상처 영역 측정 하 = 0, t 선택한 시간 지점에서 상처 영역에서 차이 확인 하 여 48 h. 계산 상처 폐쇄의 비율 =.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hickey, M. J., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+immunity:+the+host-pathogen+encounter+in+blood+vessels.">Intravascular immunity: the host-pathogen encounter in blood vessels.</a> Nat Rev Immunol. 9 (5), 364-375 (2009).</li><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nat Rev Immunol. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation.">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).</li><li>Butin-Israeli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+of+microparticles+by+neutrophils+onto+inflamed+epithelium:+a+new+mechanism+to+disrupt+epithelial+intercellular+adhesions+and+promote+transepithelial+migration.">Deposition of microparticles by neutrophils onto inflamed epithelium: a new mechanism to disrupt epithelial intercellular adhesions and promote transepithelial migration.</a> FASEB J. , (2016).</li><li>Gasser, O., Schifferli, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+polymorphonuclear+neutrophils+disseminate+anti-inflammatory+microparticles+by+ectocytosis.">Activated polymorphonuclear neutrophils disseminate anti-inflammatory microparticles by ectocytosis.</a> Blood. 104 (8), 2543-2548 (2004).</li><li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments.">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> J Vis Exp. (77), e50586 (2013).</li><li>Shet, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+blood+microparticles:+technical+aspects+and+challenges.">Characterizing blood microparticles: technical aspects and challenges.</a> Vasc Health Risk Manag. 4 (4), 769-774 (2008).</li><li>Dey-Hazra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+microparticles+by+flow+cytometry:+influence+of+centrifugation,+filtration+of+buffer,+and+freezing.">Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing.</a> Vasc Health Risk Manag. 6, 1125-1133 (2010).</li><li>Slater, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Microparticles+Deliver+Active+Myeloperoxidase+to+Injured+Mucosa+To+Inhibit+Epithelial+Wound+Healing.">Neutrophil Microparticles Deliver Active Myeloperoxidase to Injured Mucosa To Inhibit Epithelial Wound Healing.</a> J Immunol. 198 (7), 2886-2897 (2017).</li><li>Enjeti, A. K., Lincz, L., Seldon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-maleimide+as+a+generic+stain+for+detection+and+quantitation+of+microparticles.">Bio-maleimide as a generic stain for detection and quantitation of microparticles.</a> Int J Lab Hematol. 30 (3), 196-199 (2008).</li><li>Headland, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-derived+microvesicles+enter+cartilage+and+protect+the+joint+in+inflammatory+arthritis.">Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis.</a> Sci Transl Med. 7 (315), (2015).</li><li>Andersson, T., Dahlgren, C., Lew, P. D., Stendahl, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+expression+of+fMet-Leu-Phe+receptors+on+human+neutrophils.+Correlation+to+changes+in+the+cytosolic+free+Ca2++level+and+action+of+phorbol+myristate+acetate.">Cell surface expression of fMet-Leu-Phe receptors on human neutrophils. Correlation to changes in the cytosolic free Ca2+ level and action of phorbol myristate acetate.</a> J Clin Invest. 79 (4), 1226-1233 (1987).</li></ol>

저자는이 통신에 관련 된 어떤 종류의 충돌의 관심을가지고

이 통신 프로토콜 격리 및 PMN 파생 된 MPs의 특성화에 대 한 설명 합니다. 몇 가지 중요 한 요점 절차의 성공에 대 한 계정에 촬영 해야 합니다. 첫째, PMNs 신선한 격리 하 고 자발적인 활성화와 degranulation 방지 하기 위해 절연의 2 h 이내 실험에 사용 될 해야 합니다. 격리 하는 동안 및 자극의 지점 PMNs의 모든 처리 활성화와 조기 MP 릴리스12방지 하기 위해 얼음에 수행 되어야 합니다...

최근, "미/microvesicles" 셀 cytosol 또는 원형질 막에서 발생 되 큰 과학적 관심의 신흥 데이터 직경에서 50-1000 nm에서까지 이러한 구조 생물학 정보를 전달 수 있습니다 제안 및 셀룰러 통신의 비 정식 방법으로 제공 합니다. 면역 세포 유래 MPs 및 특히 polymorphonuclear 호 중구 (PMNs)를 제작한 이들은 PMNs 호스트 방어1,2,3선 동적인 응답 및 상처 치유에 중요 한 역할을 주어 큰 관심의 4. 글, 지금까지 수많은 보고 보여주었다 PMN 의원5, 제안 하는 잠재적인 맥락, 질병-, 종 및 MPs의 기관 특정 역할의 프로-염증 성 및 안티-염증 기능.
이 통신에 설명 된 프로토콜 건강과 질병에서 MPs의 기능을 연구, 혁신, 비용 효율적이 고 융통성 있는 방법을 제공 합니다. 그들은 많은 모형 유기 체, 기관, 및 자극 조건에 적용 됩니다. 그들은 MPs의 여러 종류의 식별을 위해 허용 하 고 그들의 프로-염증 성 및 안티-염증 기능을 해결 하기 위해 나중에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 설명 여기에 상피 상처 치유 생체 외에서 vivoPMN MPs의 기능을 공부 하는 방법. 마우스 골 수 파생 PMNs는 앞에서 설명한 방법6에서 일부 수정 적응 했다의 격리에 대 한 제시 프로토콜.
또한,이 연구에서 설명 하는 프로토콜 탐지 및 PMN MPs에 두 개의 상호 보완적인 방법으로 찾을 수 있는 특정 표시의 특성화에 대 한 허용: 서쪽 오 점 그리고 cytometry 흐름. 그러나 우리는 표준 프로토콜5 를 사용 하 여 MPs의 immunoblotting 간단 하 고 신뢰할 수 있는,, 감도 교류 cytometry 악기, 그리고 향상 된 잡음 대 신호 비율의 최근 발전 지금 허용 MPs의 추가 분석을 위해이 방법을 사용 하 여 찾을. 이 연구에서 설명된 프로토콜 통합 최근 발전과 수정 원심 분리 속도 시간, 샘플 필터링 및 동결/스토리지 조건7 의 추가 포함 하 여 원래 연구 기사에서 추천 , 8, 그리고 "배경 잡음"을 줄일, PMN MPs의 검출 한계를 개선 하 고 MPs의 다른 크기를 구분 하는 방법.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-041-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (Heat inactivated)</td><td>Atlanta Biologics</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)</td><td>GIBCO</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP2482</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit</td></tr><tr><td>Sterile filtered Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Sterile filtered Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>Density 1.119 g/ml.&amp;nbsp; Solution of polysucrose and&amp;nbsp; sodium diatrizoate. Bring to room temperature</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium</td><td>Cellgro</td><td>210-40-CV</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol (200 proof)</td><td>Decon labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>HBBS</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Sigma</td><td>T8154&amp;nbsp;SIGMA</td><td>Diluted 1:2 for cell viability counting</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbot</td><td>50033</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human CD11b-APC conjugated</td><td>Biolegend</td><td>301350</td><td>Clone ICRD44 (Final concetration: 1 &amp;micro;g/mL)</td></tr><tr><td>BODIPY FL</td><td>Invitrogen</td><td>B10250</td><td>N-(2-aminoethyl) maleimide&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Annexin V Binding Buffer</td><td>Biolegend</td><td>422201</td><td></td></tr><tr><td>Calibration Beads for Flow Cytometry</td><td>BioCytex</td><td>7803</td><td></td></tr><tr><td>FITC Annexin V</td><td>Biolegend</td><td>640906</td><td></td></tr><tr><td>Polymorphprep</td><td>Axis-Shield PoC AS</td><td></td><td>Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml</td></tr><tr><td>C57BL/6 mice</td><td>Jackson Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml centrifuge tubes</td><td>Corning</td><td>430053</td><td></td></tr><tr><td>50 ml centrifuge tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>25 ml serological pipettes</td><td>Celltreat</td><td>229225B</td><td></td></tr><tr><td>10 ml serological pipettes</td><td>Celltreat</td><td>229210B</td><td></td></tr><tr><td>5 ml serological pipettes</td><td>Celltreat</td><td>229205B</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes&amp;nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>357575</td><td></td></tr><tr><td>25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles)</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;micro;m cell strainers</td><td>Celltreat</td><td>229485</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer tubes</td><td>BD</td><td>367251</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP)</td><td>BD</td><td>(SORP)</td><td></td></tr><tr><td>Swinging bucket centrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75007210</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman</td><td>(L8-80 M)</td><td></td></tr><tr><td>Micro-centrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;VV-17703-15 (Fresco 17)</td><td></td></tr><tr><td>Swinging bucket centrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;75004503 (Megafuge 40R)</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy forceps, 28 cm</td><td>Storz</td><td>27071zj</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>National Institute of Health</td><td>Open source&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of neutrophil-derived microparticles for functional studies

Polymorphonuclear neutrophil 파생 미 (PMN)-MPs)는 지질 bilayer, 직경에서 50-1000 nm에서 배열 하는 크기와 구형 microvesicles. MPs는 새로 진화, 셀 통신 및 신호 기계의 중요 한 부분 이다. 그들의 크기와 그들의 자료의 성격, 때문에 최근까지 MP 존재 간과 했다. 그러나, 향상 된 기술 및 분석 방법으로 건강과 질병에 그들의 기능 지금 나오고 있다. 여기에 제시 된 프로토콜 겨냥 된다 격리 및 PMN MPs cytometry immunoblotting 여. 또한, 몇 가지 구현 예는 주어진 다. MP 격리에 대 한 이러한 프로토콜 빠르고, 낮은-비용, 고 비싼 키트를 사용 하 여 필요 하지 않습니다. 또한, 그들은 MPs 미리 MP 릴리스 이전 소스 셀 라벨 뿐 아니라 다음 격리, cytometry에 의해 시각화 및 분석을 위한 막 특정 형광 성 염료를 사용 하 여 라벨에 대 한 허용. 그러나 이러한 메서드는, PMNs MPs 및 정교한 분석 계측에 대 한 필요성의 순도 포함 하는 몇 가지 제한이 있다. 고급 흐름 cytometer 안정적으로 MPs를 분석 하 고 잡음 또는 자동 형광 거짓 긍정적인 읽기 최소화 필요 합니다. 설명된 프로토콜 격리 하 고 MP 속 정의 사용할 수 있습니다 그리고 그들의 마커 및 다른 자극 조건 하에서 구성 변화를 특징. 크기가 exosomes 대 막 입자의 내용 인지, 그리고 그들은 조직의 항상성에서 다른 역할을 수행할 여부를 조사 하기 위해 악용 될 수 있습니다. 마지막으로, 다음 격리 및 MPs, 세포질 응답에 있는 그들의 기능 및 다양 한 질병 모델 (등, PMN 관련 된 염증 성 질환, 염증 성 장 질환 등 심각한 폐 상해)의 특성화를 탐험 수 있습니다.

인간 으로부터 격리 되었고 PMNs 마우스 MPs의 대표적인 흐름 cytometric 분석은 그림 1에 표시 됩니다. PMN MPs의 크기가 비교 하 여 그림 1A, B와 같이 알려진된 크기의 구슬에 인간의 MPs. 참고에 대 한 평가 될 수 있다,이 질 크기에에서 상당한 차이가 마우스 및 인간의 MPs 사이 관찰 되었다. 마찬가지로, cytometry 및 형광 라?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies at JoVE.com

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

새로운 프로토콜 분리 하 고 인간에서 파생 된 미의 특성 설명 및 마우스 호 중구. 이러한 프로토콜 활용 ultracentrifugation, cytometry, 기술과 immunoblotting microparticle 콘텐츠를 분석 하 고 세포질 기능에 다양 한 셀 형식에서 파생 된 미의 역할을 연구 하기 사용할 수 있습니다.

절연 및 특성화 Neutrophil 파생 된 미의 기능 연구

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

isolation-characterization-neutrophil-derived-microparticles-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.2K 조회수.  Northwestern University. 새로운 프로토콜 분리 하 고 인간에서 파생 된 미의 특성 설명 및 마우스 호 중구. 이러한 프로토콜 활용 ultracentrifugation, cytometry, 기술과 immunoblotting microparticle 콘텐츠를 분석 하 고 세포질 기능에 다양 한 셀 형식에서 파생 된 미의 역할을 연구 하기 사용할 수 있습니다.

비디오: Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response. Due to their key role in inflammation, neutrophil functions such as locomotion, cytokine production, phagocytosis, and tumor cell combat are extensively studied. To characterize the specific functions of neutrophils, a clean, fast, and reliable method of separating them from other blood cells is desirable for in vitro studies, especially since neutrophils are short-lived and should be used within 2-4 hours of collection. Here, we demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media that is a mixture of sodium metrizoate and Dextran 500. The procedure consists of layering whole blood over the density gradient medium, centrifugation, separation of neutrophil layer, and lysis of residual erythrocytes. Cells are then washed, counted, and resuspended in buffer to desired concentration. When performed correctly, this method has been shown to yield samples of >95% neutrophils with >95% viability.

Neutrophils are among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response, and their functions and mechanisms have been studied extensively in vitro. We demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media.

호중구 격리 프로토콜

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

연구

생물학

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

처리되지 않은 전체 혈액에서 호중구 주 화성을 측정하기위한 미세 유체 플랫폼

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

생체공학

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

분리, 정제 및 기능 연구 및 입양 전송 실험 쥐의 골수 호중구의 라벨링

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

면역학 및 감염병학

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading microorganisms. In addition, neutrophils play a central role in the immune surveillance of tumor cells. They have the ability to recognize tumor cells and induce tumor cell death either through a cell contact-dependent mechanism involving hydrogen peroxide or through antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Neutrophils with anti-tumor activity can be isolated from peripheral blood of cancer patients and of tumor-bearing mice. These neutrophils are termed tumor-entrained neutrophils (TEN) to distinguish them from neutrophils of healthy subjects or na&#239;ve mice that show no significant tumor cytotoxic activity. Compared with other white blood cells, neutrophils show different buoyancy making it feasible to obtain a &#62; 98% pure neutrophil population when subjected to a density gradient. However, in addition to the normal high-density neutrophil population (HDN), in cancer patients, in tumor-bearing mice, as well as under chronic inflammatory conditions, distinct low-density neutrophil populations (LDN) appear in the circulation. LDN co-purify with the mononuclear fraction and can be separated from mononuclear cells using either positive or negative selection strategies. Once the purity of the isolated neutrophils is determined by flow cytometry, they can be used for in vitro and in vivo functional assays. We describe techniques for monitoring the anti-tumor activity of neutrophils, their ability to migrate and to produce reactive oxygen species, as well as monitoring their phagocytic capacity ex vivo. We further describe techniques to label the neutrophils for in vivo tracking, and to determine their anti-metastatic capacity in vivo. All these techniques are essential for understanding how to obtain and characterize neutrophils with anti-tumor function.

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

항 종양 특성을 가진 분리 및 호중구의 특성

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst leukocytes and in their non-activated state are constitutively committed to apoptosis. When recruited to inflammatory sites to resolve inflammation, they produce an array of cytotoxic molecules with potent antimicrobial killing. Yet, when these powerful cytotoxic molecules are released in an uncontrolled manner they can damage surrounding tissues. In recent years however, neutrophil versatility is increasingly evidenced, by demonstrating plasticity and immunoregulatory functions. We have recently identified a new neutrophil-derived subpopulation, which develops spontaneously in standard culture conditions without the addition of cytokines/growth factors such as granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF)/interleukin (IL)-4. Their phagocytic abilities of neutrophil remnants largely contribute to increase their size immensely; therefore they were termed giant phagocytes (G&#981;). Unlike neutrophils, G&#981; are long lived in culture. They express the cluster of differentiation (CD) neutrophil markers CD66b/CD63/CD15/CD11b/myeloperoxidase (MPO)/neutrophil elastase (NE), and are devoid of the monocytic lineage markers CD14/CD16/CD163 and the dendritic CD1c/CD141 markers. They also take-up latex and zymosan, and respond by oxidative burst to stimulation with opsonized-zymosan and PMA. G&#981; also express the scavenger receptors CD68/CD36, and unlike neutrophils, internalize oxidized-low density lipoprotein (oxLDL). Moreover, unlike fresh neutrophils, or cultured monocytes, they respond to oxLDL uptake by increased reactive oxygen species (ROS) production. Additionally, these phagocytes contain microtubule-associated protein-1 light chain 3B (LC3B) coated vacuoles, indicating the activation of autophagy. Using specific inhibitors it is evident that both phagocytosis and autophagy are prerequisites for their development and likely NADPH oxidase dependent ROS. We describe here a method for the preparation of this new subpopulation of long-lived, neutrophil-derived phagocytic cells in culture, their identification and their currently known characteristics. This protocol is essential for obtaining and characterizing G&#981; in order to further investigate their significance and functions.

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

We describe here a method for obtaining and identifying a newly characterized subpopulation of neutrophil-derived giant phagocytes. These cells develop in culture from fresh human blood neutrophils, and are characterized by phagocytosis, autophagy, immensely large size, and extended lifespan. This method is essential to further investigate this unique neutrophil-derived subpopulation.

인간 호중구 유래 거 식세포의 소설 모집단의 개발 및 식별<em&gt; 체외</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource to evaluate a variety of pulmonary diseases, both for research and clinical purposes. However, due to the heterogeneous and viscous nature of patient mucus, there is currently no reliable dissociation method that does not damage the host immune cells in the patient airway secretion. In this research, we introduce a sample preparation method that uses inertial microfluidics for the patient&#39;s immune assessment. Regardless of the heterogeneous fluidic properties of the clinical samples, the proposed method recovers more than 95% of neutrophils from airway secretion samples that are diluted 1,000-fold with milliliters of clean saline. By recirculating the concentrated output stream to the initial sample reservoir, a high concentration, recovery, and purity of the immune cells are provided; recirculation is considered a trade-off to the single-run syringe-based operation of inertial microfluidics. The closed-loop operation of spiral microfluidics provides leukocytes without physical or chemical disturbance, as demonstrated by the phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-induced elastase release of sorted neutrophils.

In this research, we demonstrate a label-free neutrophil separation method from clinical airway secretions using closed-loop operation of spiral inertial microfluidics. The proposed method would expand the clinical in vitro assays for various respiratory diseases.

폐쇄 루프 관성 마이크로 사용 하 여 환자 파생 기도 분 비에서 레이블 없는 호 중구 농축

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource ...

다양한 신호전달 경로를 스크리닝하기 위한 호중구 기능 분석

A Set of Screening Techniques for a Quick Overview of the Neutrophil Function

Neutrophils are known as one of the first lines of defense in the innate immune response and can perform many particular cellular functions, such as chemotaxis, reverse migration, phagocytosis, degranulation of cytotoxic enzymes and metabolites, and release of DNA as neutrophil extracellular traps (NETs). Neutrophils not only have tightly regulated signaling themselves, but also participate in the regulation of other components of the immune system. As fresh neutrophils are terminally differentiated, short-lived, and highly variable among individuals, it is important to make the most of the collected samples. Researchers often need to perform screening assays to assess an overview of the many neutrophil functions that may be affected by specific conditions under evaluation. A set of tests following a single isolation process of normal density neutrophils was developed to address this need, seeking a balance between speed, comprehensiveness, cost, and accuracy. The results can be used to reason and guide in-depth follow-up studies. This procedure can be carried out in an average time of 4 h and includes the evaluation of cell viability, reactive oxygen species (ROS) production, real-time migration, and phagocytosis of yeast on glass slides, leaving enough cells for more detailed approaches like omics studies. Moreover, the procedure includes a way to easily observe a preliminary suggestion of NETs after fast panoptic staining observed by light microscopy, with a lack of specific markers, albeit enough to indicate if further efforts in that way would be worthwhile. The diversity of functions tested combines common points among tests, reducing the analysis time and expenses. The procedure was named NeutroFun Screen, and although having&#160;limitations, it balances the aforementioned factors. Furthermore, the aim of this work is not a definite test set, but rather a guideline that can easily be adjusted to each lab&#39;s resources and demands.

저자 스포트라이트: NeutroFun Screen Protocol을 사용한 호중구 기능 평가의 속도, 비용 및 정확성 균형 맞추기 

This protocol features a set of neutrophil functional assays to be used as a screening method to cover functions from different signaling pathways. The protocol includes an initial and simple evaluation of cell viability, purity, reactive oxygen species production, real-time migration, phagocytosis, and a preliminary suggestion of neutrophil extracellular traps.

호중구 기능에 대한 간략한 개요를 위한 일련의 스크리닝 기법

Neutrophils are known as one of the first lines of defense in the innate immune response and can perform many particular cellular functions, such as ...

절연 및 특성화 Neutrophil 파생 된 미의 기능 연구

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

호중구 격리 프로토콜

처리되지 않은 전체 혈액에서 호중구 주 화성을 측정하기위한 미세 유체 플랫폼

분리, 정제 및 기능 연구 및 입양 전송 실험 쥐의 골수 호중구의 라벨링

항 종양 특성을 가진 분리 및 호중구의 특성

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

인간 호중구 유래 거 식세포의 소설 모집단의 개발 및 식별

폐쇄 루프 관성 마이크로 사용 하 여 환자 파생 기도 분 비에서 레이블 없는 호 중구 농축

호중구 기능에 대한 간략한 개요를 위한 일련의 스크리닝 기법

호중구 기능에 대한 간략한 개요를 위한 일련의 스크리닝 기법

호중구 기능에 대한 간략한 개요를 위한 일련의 스크리닝 기법