Gostaríamos de agradecer Joshua Singer, Jonathan Schenk, bem como os revisores pensativos para comentários sobre o manuscrito. Também gostaríamos de agradecer a Ben White e Harold Zakon para discussões sobre a técnica. Jonathan Schenk forneceu os dados para a Figura 3A. Este trabalho foi financiado por um subsídio da Fundação Whitehall e um R21 NIH ao QG.

1. prepare a moscas e GAL4 identificar linhas de promotor
<ol><li>Selecione uma linha de promotor GAL4 e cruzá-la com moscas carregando tanto o transgene UAS-NaChBac e um optogenetic transgene para ativação. Nota: UAS-CsChrimson11 é selecionado devido a sua alta condutância e a facilidade com a qual ele ativa de potenciais de ação mediada por NaChBac. Tanto UAS-NaChBac e CsChrimson-UAS estão disponíveis no repositório de estoques de Bloomington.</li>
	<li>Prepare-se como uma solução em etanol (35mm) all-trans retinal e armazenar a solução em congelador a-20 ° C.</li>
	<li>Mix 28 µ l desta unidade populacional em cerca de 5 mL de batata rehidratada flake comida e adicione esta mistura na parte superior de um frasco de meio de Drosophila convencional.</li>
	<li>Levante o adultas moscas expressando csChrimson em alimentos contendo 0,2 mM todo-trans-retinal para 1 a 3 dias,11.</li>
</ol>2. prepare o estoque TTX
<ol><li>Crie uma solução stock de 1mm TTX em água destilada ou desionizada. Guarde esta solução em um frigorífico de laboratório durante vários meses. Verificar as instituições políticas a respeito do armazenamento de TTX como muitas instituições classificam TTX como uma substância perigosa ou controlada.</li>
</ol>3. prepare moscas para eletrofisiologia
<ol><li>Colete 1 – 3 dias velho adulto voa que são gerados na comida com all-trans-retinal. Nota: Consulte Murthy e Turner em 2013 para uma descrição detalhada do patch aperto Drosophila neurônios12,13.</li>
	<li>Coloque as moscas em um frasco de cintilação. Coloque o frasco em gelo por 1 min imobilizar as moscas.</li>
	<li>Use pinça grossa para inserir uma mosca em uma câmara de gravação sob medida. A câmara consiste de um 3 ½" círculo cortado a laser de acrílico 1/16". Corte um buraco ¾" é para o centro onde uma folha personalizada é fixada com cola epoxy de 2 partes. A folha contém um triangular em forma de esperança que a mosca é inserida.</li>
	<li>Aplica cera ou UV curável epóxi em torno do animal para fixá-lo firmemente dentro da câmara de gravação.</li>
	<li>Ilumine a preparação com um pescoço de cisne de fibra ótica para visualização sob um estereomicroscópio. Defina as fibras de pescoço de cisne para iluminação oblíqua, ajustando-os para que eles iluminam a voar directamente do lado.</li>
	<li>Ajuste o nível de luz a mais baixa possível que ainda permite a visualização clara de uma mosca. Esta intensidade de luz irá variar através de experiências individuais. Nota: Este protocolo pode ser adaptado usando um em situ cérebro explant método14.</li>
	<li>Recupere a solução salina de gravação externa. O soro contém em mM: NaCl 103, 3 KCl, 5 N-tris (hidroximetil) metil-2-aminoethane-sulfônico, 8 trealose, glicose 10, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4, 1.5 CaCl2e 4 de MgCl2 (ajustada para mΩ 270-275). A solução salina é alternassem com 95% O25% CO2 (carbogênio) e tem um pH ajustado a 7.315.</li>
	<li>Coloque 4 a 6 gotas de solução salina de gravação extracelular sobre a preparação de voar. Neste ponto, aumente o nível de luz para o microscópio de dissecação para melhor visibilidade.</li>
	<li>Afie um fio de tungstênio usando eletrólise. Para fazer o fio, preparar uma solução saturada de KNO3 e aplique aproximadamente 20 V de AC corrente enquanto mergulhando a ponta do fio na solução de 20 vezes para 100 ms cada, até que a ponta é afiada. Use o fio de tungstênio afiada para remover a cutícula na cabeça de mosca e, portanto, expondo o cérebro.</li>
	<li>Ainda mais expor o cérebro removendo a traqueia e os corpos de gordura que o rodeiam. Se acessando os lóbulos da antena, use um fio de tungstênio tortos ou ferramenta semelhante aconchegar-se suavemente antenas debaixo da folha câmara para aumentar a visibilidade de gravação. Use o fórceps afiado a rasgar o invólucro glia cobrindo a área de interesse, onde as gravações serão feitas suavemente.</li>
	<li>Transferi a câmara de gravação para o equipamento de eletrofisiologia. Imediatamente iniciar perfusão com solução salina de gravação externa borbulhava com carbogênio para preservar o cérebro. O reservatório de solução salina é colocado acima do palco do microscópio e gravidade-alimentado à preparação. Use uma linha de vácuo e um frasco de Erlenmeyer de 2L para recolher a resíduos salina.</li>
</ol>4. obter gravação de células inteiras
<ol><li>Puxe um extrator comercial pipeta pipetas de remendo. Consulte o manual de configurações alcançar uma pipeta apropriada com uma resistência de ponta perto de 7 mΩ.</li>
	<li>Adicione 4 µ l da solução de gravação interna para uma pipeta de remendo. O soro fisiológico interno consiste de aspartato de potássio 140, 10 HEPES, 4 MgATP, 0,5 Na3GTP, 1 EGTA e 1 KCl em mM.</li>
	<li>Configure o amplificador de braçadeira do remendo para gravação de células inteiras. Zero offsets do amplificador e definir o amplificador para fornecer pulsos de teste. Aqui, um amplificador de braçadeira de Patch de sistemas AM 2.400 é usado.</li>
	<li>Aplicar pressão positiva através da pipeta e abordagem da célula. Use um micromanipulador para direcionar a pipeta e entre em contato com a célula. Liberar a pressão positiva. Conjunto o potencial de exploração da membrana de -60 mV. A pipeta deve formar um gigaohm selo com a membrana da célula, como evidenciado por um sub-picoamp baixo segurando atual. Nota: Se usar GFP guiado a célula alvo, tente minimizar o uso de luz epifluorescente para impedir ativação ChR2 e potencial depressão sináptica. Também aguarde alguns minutos antes de aplicar o passo 5.</li>
	<li>Definir o amplificador para entregar o teste pulsos de -50 mV a -60 mV. Essa configuração é padrão nos amplificadores da remendo-braçadeira. Pulsos de teste irão revelar um grande transiente capacitiva que representa a corrente necessária para carregar a pipeta de remendo. Remova capacitiva transientes ajustando os botões de compensação de capacidade na AM 2400 ou amplificador semelhante.</li>
	<li>Aplica breves pulsos de pressão negativa para a ruptura da membrana celular e obter configuração de células inteiras. Nota: Uma configuração de celular é observada quando há um grande aumento da capacitiva transientes mostrando a capacitância do neurônio. Um pequeno aumento na exploração atual (linha de base) provavelmente será também observado. Definir o amplificador para o atual modo de grampo e ajustar o potencial da célula de -50 a -60 mV.</li>
</ol>5. testar a conectividade sináptica
<ol><li>Configure o sistema de aquisição (DAQ) dados para acionar um driver de LED para gerar pulsos de luz. Aqui, um sistema DAQ de instrumentos nacionais é usado com Matlab para entregar um sinal analógico para um driver de LED. A intensidade do LED é ajustada através do sinal analógico para o motorista. O LED é um comprimento de onda 620-630 nm LED.</li>
	<li>Posicione o alta potência LED vermelho diretamente debaixo de preparação. Ajuste a intensidade da luz para que 0.238 mW/mm2 atinge a mosca.</li>
	<li>Ative os neurônios pré-sináptica durante a gravação da célula pós-sináptica de interesse. Atingir a célula ativação optogenetically, pharmacogentically, ou através da estimulação do nervo. Aqui, breves pulsos de luz vermelha e csChrimson são aplicados. Nota: Conexões sinápticas podem ser monitoradas em braçadeira atual como EPSPs ou grampo de tensão como EPSCs. Uma conexão sináptica deve ser visível antes de aplicar a TTX em resposta a um pulso de luz de 40 ms. Se nenhuma conexão é observado, é improvável que os neurônios estão synaptically ligados ou mono - ou polysynaptically. A potencial de exploração pode ser ajustada para enfatizar conexões excitatórias ou inibitórias em conformidade.</li>
	<li>Se uma conexão é observado em solução salina normal, adicionar TTX no sistema de perfusão para obter uma concentração final de 1 µM. usar uma bomba de recirculação para capturar e reutilizar o soro fisiológico para conservar TTX. A bomba peristáltica irá desenhar a solução salina do banho e devolvê-lo para o reservatório de solução salino.</li>
	<li>Ajuste a velocidade da bomba para fornecer um forte vácuo constante que não permite esse nível salino no banho para subir e descer. Nota: A aplicação da TTX deve resultar na cessação da actividade no neurônio que está sendo monitorado em células inteiras de cravação. Isto confirma que suficiente TTX foi adicionado para o soro.</li>
	<li>Aplica breves pulsos de luz vermelha (40 ms para cada pulso) novamente. Neste ponto, qualquer conexão sináptica que permanece é provável monosynaptic. Adicione antagonistas farmacológicas para testar a natureza química das ligações sinápticas que permanecem em TTX, solução salina a recirculação. Nota: Quando a combinação de optogenetics e direcionamento fluorescente de neurônios, pode ser importante para não ativar persistentemente a população pré-sináptica dos neurônios ao tentar obter uma gravação. Isto pode conduzir à depressão sináptica e torna difícil ver conexões. Porque csChrimson tem uma faixa de excitação longo que se estende amplamente para a gama de proteína verde fluorescente, um fluoróforo vermelho pode ser usado para visualizar os neurônios e channel2rhodopsin (Ch2R) pode ser usado para excitar a populações de células. Fazer isso requer genética específica e um cubo de filtro personalizado. Para gerar moscas adequadas, fazer moscas que expressam o fluoróforo vermelho (RFP ou mCherry) sob os sistemas de expressão binário sistema LexA ou Q. Estas precisará ser cruzados com moscas expressando um promotor Gal4 e UAS-Ch2R e UAS-NaChBac genes efetores. O cubo do filtro ideal para epifluorescência terá uma escala estreita da excitação para excitar o fluoróforo vermelho, mas não excita a Ch2R... Além disso, o conjunto de filtro deve incluir um filtro de emissão de passe longo para coletar tanta luz emitida. Nós usamos um filtro personalizado definido de Chroma que incluía parte números et580/25 x e t600lpxr (do conjunto 49306), mas com um filtro de barreira/emissão de et610lp.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections.">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).</li><li>Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+functional+neuronal+connectivity+in+the+Drosophila+brain.">Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain.</a> J Neurophysiol. , 684-696 (2012).</li><li>Doyle, M. W., Andresen, M. 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Os autores não têm nada para divulgar.

Análise TERPS elogios atuais técnicas usadas para circuito rachando, permitindo a detecção de sinapses entre os neurônios identificados. Especificamente, a abordagem revela conexões monosynaptic por silenciar amplamente os potenciais de ação com TTX enquanto restaura a excitabilidade numa população de neurônios com o canal de sódio TTX diferenciação NaChBac selecione. Liberação sináptica é provocada pela estimulação optogenetic enquanto eventos pós-sinápticos são monitorados com gravações de cél...

Dos principais objetivos da neurociência é mapear as conexões entre os neurônios para entender como a informação flui através de circuitos. Inúmeros recursos e abordagens tornaram-se disponíveis para testar a conectividade funcional entre os neurônios em uma variedade de sistemas de modelo1,2. Para gerar os diagramas de fiação mais precisos usando eletrofisiologia, é importante resolver se observadas as conexões entre duas células são diretos e monosynaptic versus indireta e polysynaptic. Um padrão de ouro para fazer esta distinção nos neurônios de mamíferos é medir a latência entre action potentials único nas células pré-sináptica e o aparecimento de correntes pós-sináptico excitatórios (EPSCs) no segundo neurônio. Monosynaptic conexões devem ter latências curtas de alguns milissegundos e baixa variabilidade3. Essa abordagem pode ser complicada em neurônios invertebrados porque sinapses podem ocorrer em suas dendrites, longe de ser o local de gravação somática, causando atrasos na deteção devido tempo electrotonic distâncias entre conductances pós-sinápticos e a gravação eletrodo. Esses atrasos podem introduzir ambiguidade poli-contra contribuições monosynaptic. Além disso, pequenos eventos sinápticos podem deteriorar antes de chegar ao local de gravações somática e dirigindo mais forte atividade pré-sináptica, é prováveis que recrutar polysynaptic eventos.
Várias técnicas têm sido desenvolvidas para testar conexões monosynaptic em invertebrados. Uma abordagem utiliza as soluções de alta cátion divalente (Hi-Di) contendo excesso Mg ++ e Ca ++. Esta solução bloqueia conexões polysynaptic por redução de lançamento de probabilidade e limiar de ação potencial crescente para favorecer a deteção de entrada monosynaptic4,5. Determinar a proporção precisa de Mg Ca ++ ++ necessário, no entanto, não é trivial e contribuições polysynaptic podem persistir por estimulação mesmo modesto6. Uma abordagem alternativa, chamada reconstituição GFP entre parceiros sináptica (alcance) aproveita a proximidade entre as membranas pré e pós-sinápticas encontrado em sinapses para inferir uma conexão monosynaptic 7. Aqui, um componente da proteína verde fluorescente (GFP) é expresso em um neurônio, e o fragmento complementar da molécula é expresso em um parceiro pós-sináptica putativo. A presença de fluorescência indica que os dois neurônios estão em proximidade suficiente para permitir a reconstituição da molécula GFP e implica a existência de uma sinapse. ALCANCE pode relatar sinapses falsamente, no entanto, se duas células estreitamente tem Aposto membranas, como em um nervo ou Fascículo. Variantes de alcance eliminam tais falsos positivos por amarrar o fragmento pré-sináptica de GFP diretamente para synaptobrevin da, permitindo assim a reconstituição somente às sinapses ativo8. Enquanto compreensão e suas variantes têm sido fundamentais para determinar a conectividade funcional na drosófila CNS, algumas conexões podem não ser feitas visíveis pelo alcance se as distâncias entre parceiros pré e pós-sinápticas é relativamente grande. Isto é particularmente pertinente na avaliação da transmissão de volume associado a neuromodulação9 ou de inibição GABAérgica10.
Aqui, uma técnica complementar e romance é demonstrada para testar conexões diretas de monosynaptic no CNS da drosófila . Esse método, chamado tetrodotoxina engenharia resistência para sondar as sinapses (TERPS), trabalha pela expressão co da tetrodotoxina (TTX)-canal de sódio resistente, NaChBac e um ativador de optogenetic em uma célula pré-sináptica durante a gravação de putativo parceiros pós-sináptica9. Na presença de TTX, toda a atividade mediada por potencial de ação é suprimida em células diferentes dos expressando NaChBac. O canal NaChBac restaura seletivamente excitabilidade na célula pré-sináptica alvo, permitindo a transmissão sináptica luz-evocada. Este método permite forte ativação dos neurônios pré-sináptica, tal que as conexões podem ser resolvidas pós-sinapticamente pela gravação somática, reduzindo a probabilidade de recrutamento de circuitos polysynaptic. Importante, esta técnica permite o estudo da transmissão de volume e revela a propagação do transmissor liberado de um único neurônio ao longo de um circuito. Além disso, TERPS pode revelar a natureza química da conexão através de farmacologia convencional. TERPS é adequado para uso em qualquer modelo de sistema que permite a expressão transgênica da diferenciação de TTX canais de sódio.

<table><tbody><tr><td>UAS-csChrimson</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>55135</td><td>Used as a neural activator</td></tr><tr><td>UAS-NaChBac</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>9466</td><td>Resotores excitibility in cells in TTX</td></tr><tr><td>Tetrodotoxin</td><td>Tochris</td><td>1078</td><td>Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance</td></tr><tr><td>all trans-Retinal</td><td>Sigma-Aldrichall trans-Retinal</td><td>R2500</td><td>Require co-factor for channelrhodopsin</td></tr><tr><td>Weldable 321 Stainless Steel&amp;nbsp;Sheet,&amp;nbsp;0.002&quot;&amp;nbsp;Thick,&amp;nbsp;10&quot;&amp;nbsp;Wide</td><td>McMaster Carr</td><td>3254K7</td><td>Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file</td></tr><tr><td>Dissection Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td>Used for dissection of preparation</td></tr><tr><td>Waxer</td><td>Almore</td><td>Eectra Waxer 66000</td><td>Used during dissection to secure fly in foil</td></tr><tr><td>Paraffin Wax</td><td>Joann</td><td>4917217</td><td>Used with waxer</td></tr><tr><td>Number 5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>#5CO</td><td>Used for dissection and desheathing</td></tr><tr><td>Dissection Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15001-08</td><td>Used to remove parts of the cuticle during dissection</td></tr><tr><td>Tungsten wire</td><td>A-M Systems</td><td>797500</td><td>Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection</td></tr><tr><td>Reciculating Peristaltic Pump</td><td>Simply Pumps (Amazon)</td><td>PM200S</td><td>for recirculating TTX</td></tr><tr><td>Speed Controller for peristaltic pump</td><td>Zitrades (Amazon)</td><td>N/A</td><td>PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B</td></tr><tr><td>Versa-Mount&amp;nbsp;Precision Compressed Air Regulator</td><td>McMaster Carr</td><td>1804T1</td><td>For applying positive pressure during patching</td></tr><tr><td>Glass capilaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-3</td><td>For patch pipettes</td></tr><tr><td>Multipurpose Gauge</td><td>McMaster Carr</td><td>3846K431</td><td>Gauge for pressure regulator</td></tr><tr><td>Electrophysiology Camera</td><td>Dage MTI&amp;nbsp;</td><td>IR-1000</td><td>Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson</td></tr><tr><td>IR LED</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>M850F2</td><td>For oblique illumination</td></tr><tr><td>fiber optic for IR LED</td><td>Thorlabs</td><td>M89L01</td><td>Couples to IR LED</td></tr><tr><td>Objective lens&amp;nbsp;</td><td>Olympus 40X</td><td>LUMPlanFLN</td><td>This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons.</td></tr><tr><td>Amber LED</td><td>Thorlabs</td><td>M590L3d</td><td>For visualizing RFP and mCherry</td></tr><tr><td>Blue LED</td><td>Thorlabs</td><td>&lt;strong&gt;M470L3&lt;/strong&gt;&lt;sup&gt;d&lt;/sup&gt;</td><td>For visualizing GFP</td></tr><tr><td>GFP filter set</td><td>Chroma</td><td>&lt;strong&gt;49011&lt;/strong&gt;</td><td>For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin</td></tr><tr><td>Custom mCherry Filter Set</td><td>Chroma</td><td>&amp;nbsp;et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic</td><td>Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin</td></tr><tr><td>Dichroic to combine Amber and blue LED</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP550R</td><td>Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light.</td></tr><tr><td>Red LED</td><td>LEDSupply</td><td>Cree XPE 620 - 630 nm</td><td>Used to drive csChrimson</td></tr><tr><td>LED Driver</td><td>LEDSupply</td><td>3021-D-E-1000</td><td>Used to drive LEDs for optogenetic stimulation</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-225</td><td>Used to position pipette during recordings</td></tr><tr><td>Patchclamp Amplifier</td><td>A-M Systems</td><td>Model 2400</td><td>An equivalent amplifier is suitable</td></tr><tr><td>Bessel Filter</td><td>Warner Instruments&amp;nbsp;</td><td>LPF 202A</td><td>Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching.</td></tr><tr><td>Data Acquisition System&amp;nbsp;</td><td>National Instruments</td><td>NI PCIe-6321&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 781044-01</td><td>Used to record data from amplifier to computer</td></tr><tr><td>Connector Block - BNC Terminal BNC-2090A</td><td>National Instruments</td><td>779556-01</td><td>Used to connect amplifier to DAQ card.</td></tr><tr><td>Steel Foil&amp;nbsp;</td><td>McMaster Carr</td><td>3254K7</td><td>Steel foil for custom recording chamber</td></tr><tr><td>Magnets</td><td>K&amp;amp;J Magnetics</td><td>D42</td><td>To secure recording chamber to ring stand</td></tr><tr><td>1/16&quot; Cell Cast Acrylic Clear</td><td>Pololu</td><td></td><td>Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file</td></tr></tbody></table>

examining monosynaptic connections in drosophila using tetrodotoxin resistant sodium channels

Aqui, uma nova técnica denominada Tetrotoxin (TTX) Engenharia resistência para sondar as sinapses (TERPS) é aplicada para testar monosynaptic conexões entre os neurônios do alvo. O método baseia-se na expressão co de um ativador de transgênico com o canal de sódio tetrodotoxina-resistente, NaChBac, em um neurônio específico pré-sináptica. Conexões com parceiros pós-sináptica putativos são determinadas por gravações de células inteiras na presença de TTX, que bloqueia a atividade elétrica de neurônios que expressam não NaChBac. Esta abordagem pode ser modificada para funcionar com qualquer ativador ou imagem latente de cálcio como um repórter de conexões. TERPS adiciona o crescente conjunto de ferramentas disponíveis para determinar a conectividade em redes. No entanto, TERPS é o único que relata também confiantemente em massa ou volume transmissão e transmissão de repercussões.

TERPS é usado para distinguir entre mono e polysynaptic contribuições em conexões sinápticas entre os neurônios. Enquanto fraca estimulação de uma célula pode ser usada para testar conexões diretas, dirigindo a maior atividade pré-sináptica frequentemente recruta polysynaptic conexões (figura 1A). TERPS funciona co, expressando o diferenciação de TTX canal de sódio NaChBac e um ativador de optogenetic e testes de conexões na presença de TTX ...

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Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

Este artigo apresenta um método para testar as monosynaptic conexões entre neurônios empregando tetrodotoxina e o canal de sódio tetrodotoxina-resistente, NaChBac.

Examinando Monosynaptic conexões em drosófila usando os canais de sódio tetrodotoxina resistente

Here, a new technique termed Tetrotoxin (TTX) Engineered Resistance for Probing Synapses (TERPS) is applied to test for monosynaptic connections between ...

examining-monosynaptic-connections-drosophila-using-tetrodotoxin

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

9.9K visualizações.  University of Maryland. Este artigo apresenta um método para testar as monosynaptic conexões entre neurônios empregando tetrodotoxina e o canal de sódio tetrodotoxina-resistente, NaChBac.

Vídeo: Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. The larval neuromuscular system is a model synapse for the study of synaptic physiology and neurotransmission, and is a valuable research tool that has defined genetics and is accessible to experimental manipulation. Larvae can be dissected to expose the body wall musculature, central nervous system, and peripheral nerves. The muscles of Drosophila and their innervation pattern are well characterized and muscles are easy to access for intracellular recording. Individual muscles can be identified by their location and orientation within the 8 abdominal segments, each with 30 muscles arranged in a pattern that is repeated in segments A2 - A7. Dissected drosophila larvae are thin and individual muscles and bundles of motor neuron axons can be visualized by transillumination1. Transgenic constructs can be used to label target cells for visual identification or for manipulating gene products in specific tissues. In larvae, excitatory junction potentials (EJP&#8217;s) are generated in response to vesicular release of glutamate from the motoneurons at the synapse. In dissected larvae, the EJP can be recorded in the muscle with an intracellular electrode. Action potentials can be artificially evoked in motor neurons that have been cut posterior to the ventral ganglion, drawn into a glass pipette by gentle suction and stimulated with an electrode. These motor neurons have distinct firing thresholds when stimulated, and when they fire simultaneously, they generate a response in the muscle. Signals transmitted across the NMJ synapse can be recorded in the muscles that the motor neurons innervate. The EJP&#8217;s and minature excitatory junction potentials (mEJP&#8217;s) are seen as changes in membrane potential. Electrophysiological responses are recorded at room temperature in modified minimal hemolymph-like solution2 (HL3) that contains 5 mM Mg2+ and 1.5 mM Ca2+. Changes in the amplitude of evoked EJP&#8217;s can indicate differences in synaptic function and structure. Digitized recordings are analyzed for EJP amplitude, mEJP frequency and amplitude, and quantal content.

Here we describe electrophysiological methods for measuring synaptic transmission at the neuromuscular junction of Drosophila larva. Evoked release is initiated artificially by stimulating the motor neuron axons, and transmission through the NMJ can be measured by the postsynaptic response evoked in the muscle.

Métodos eletrofisiológicos de gravação Potenciais Synaptic do MNJ de larvas de Drosophila

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

Biologia

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available to evoke excitatory junctional potentials (EJPs) in this preparation involves the use of suction electrodes. In both research and teaching labs, students often have difficulty maneuvering and manipulating this type of stimulating electrode. In the present work, we show how to remotely stimulate synaptic potentials at the larval NMJ without the use of suction electrodes. By expressing channelrhodopsin2 (ChR2) 4,5,6 in Drosophila motor neurons using the GAL4-UAS system 7, and making minor changes to a basic electrophysiology rig, we were able to reliably evoke EJPs with pulses of blue light. This technique could be of particular use in neurophysiology teaching labs where student rig practice time and resources are limited.

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

This procedure uses a blue light-activated algal channel and cell-specific genetic expression tools to evoke synaptic potentials with light pulses at the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila larvae. This technique is an inexpensive and easy-to-use alternative to suction electrode stimulation for synaptic physiology studies in research and teaching laboratories.

Channelrhodopsin2 Estimulação Mediated de Potenciais Synaptic em Drosophila Junções Neuromusculares

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available ...

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

Visualizando o Live Drosophila Junção neuromuscular-Glial com corantes fluorescentes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

Colheita e Preparação Drosophila Os embriões para Gravação eletrofisiológicos e outros procedimentos

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

Gravação eletrofisiológicas na Drosophila Embrião

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Macropatch focal gravações das correntes sinápticas da junção Neuromuscular Larval da drosófila

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Neurociência

Visualização de redes de microtúbulos em junções neuromusculares e células musculares de Drosophila

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Autor em destaque: Compreendendo a rede de microtúbulos nas junções neuromusculares de Drosophila 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Usando a junção neuromuscular de larvas de Drosophila e células musculares para visualizar a rede de microtúbulos

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with ...

Ablação de neurônio único em Drosophila para estudar a adaptação do sistema nervoso

Laser Cell Ablation in Intact Drosophila Larvae Reveals Synaptic Competition

The protocol describes single-neuron ablation with a 2-photon laser system in the central nervous system (CNS) of intact Drosophila melanogaster larvae. Using this non-invasive method, the developing nervous system can be manipulated in a cell-specific manner. Disrupting the development of individual neurons in a network can be used to study how the nervous system can compensate for the loss of synaptic input. Individual neurons were specifically ablated in the giant fiber system of Drosophila, with a focus on two neurons: the presynaptic giant fiber (GF) and the postsynaptic tergotrochanteral motor neuron (TTMn). The GF synapses with the ipsilateral TTMn, which is crucial to the escape response. Ablating one of the GFs in the 3rd instar brain, just after the GF starts axonal growth, permanently removes the cell during the development of the CNS. The remaining GF reacts to the absent neighbor and forms an ectopic synaptic terminal to the contralateral TTMn. This atypical, bilaterally symmetric terminal innervates both TTMns, as demonstrated by dye coupling, and drives both motor neurons, as demonstrated by electrophysiological assays. In summary, the ablation of a single interneuron demonstrates synaptic competition between a bilateral pair of neurons that can compensate for the loss of one neuron and restore normal responses to the escape circuit.

Autor em destaque: Investigando os mecanismos de montagem de circuitos neurais e formação de sinapses em Drosophila

This protocol demonstrates the laser cell ablation of individual neurons in intact Drosophila larvae. The method enables the study of the effect of reducing competition between neurons in the developing nervous system.

Ablação de células a laser em larvas intactas de Drosophila revela competição sináptica

The protocol describes single-neuron ablation with a 2-photon laser system in the central nervous system (CNS) of intact Drosophila melanogaster larvae. ...

Examinando Monosynaptic conexões em drosófila usando os canais de sódio tetrodotoxina resistente

Resumo

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Métodos eletrofisiológicos de gravação Potenciais Synaptic do MNJ de larvas de Drosophila

Channelrhodopsin2 Estimulação Mediated de Potenciais Synaptic em Drosophila Junções Neuromusculares

Visualizando o Live Drosophila Junção neuromuscular-Glial com corantes fluorescentes

Colheita e Preparação Drosophila Os embriões para Gravação eletrofisiológicos e outros procedimentos

Gravação eletrofisiológicas na Drosophila Embrião

Macropatch focal gravações das correntes sinápticas da junção Neuromuscular Larval da drosófila

Usando a junção neuromuscular de larvas de Drosophila e células musculares para visualizar a rede de microtúbulos

Usando a junção neuromuscular de larvas de Drosophila e células musculares para visualizar a rede de microtúbulos

Usando a junção neuromuscular de larvas de Drosophila e células musculares para visualizar a rede de microtúbulos

Ablação de células a laser em larvas intactas de Drosophila revela competição sináptica