Os autores agradecer Tammo Reisewitz leitura crítica do manuscrito e Mako Hayashi e Sayuri Hagiwara para cultivo de cuidado e observação das cianobactérias, Yoshitaka Kimori para processamento de imagem, Chihong Song, Naoyuki Miyazaki e Miyoko Nagayoshi por ajudar com a segmentação das estruturas. Este trabalho foi financiado pelo programa de estudo colaborativo do Instituto Nacional de Ciências fisiológicas (NIPS) para YK

1. síncrona cultura de cianobactérias
<ol><li>Cultura de S. elongatus PCC 7942 BG 11 placa esterilizada (em uma 9cm plástico Petri estéril) contendo ágar 1,5% (p/v) e 0,3% (p/v) de tiosulfato de sódio8.</li>
	<li>Coloque as placas em uma câmara de crescimento a 23 ° C com uma intensidade de luz de 50 µE/m2/s e sujeitas a ciclos de escuro h da luz/12 h 12.</li>
	<li>Transferi as células em placas de ágar BG11 frescas uma vez por semana. Nota: As culturas em ágar aparecerá como bandas verdes de pilhas ativamente proliferating depois de uma semana sob essa condição de cultura.</li>
	<li>Leve verdes aglomerados de células com um laço de fio esterilizado flama e raia as células em uma placa de ágar BG11 fresca. Fazer isso em uma bancada limpa.</li>
</ol>2. monitorização por microscopia de fluorescência
<ol><li>Use células cultivadas na placa de ágar para 6 dias para observar a compactação do DNA. Colete células da placa no final do período de luz derramando 1 mL de solução 0,2 M de sacarose sobre as células. Repita derramando a solução para as células, para que a maioria das células é coletadas. Transferi a solução de células suspensas em um micro tubo para coloração de DNA.</li>
	<li>Adicione a DNA mancha solução corante (por exemplo, Hoechst 33342) a 500 µ l da solução de células suspensas em um micro tubo para uma concentração final de 1 µ g/mL. Então, mantenha o tubo no escuro por 10 min.</li>
	<li>Centrifugar por 1 min a 2.000 x g de sedimentos das células. Desprezar o sobrenadante e adicionar 10 µ l de solução de sacarose 0,2 M para obter uma suspensão de células densas.</li>
	<li>Transferir 1 µ l da solução contendo células coradas para um vidro de slide, colocar uma lamínula e observar com um microscópio de fluorescência, equipado com um filtro UV usando uma lente objetiva com uma ampliação de 100 X e óleo de imersão.</li>
	<li>Confirmar que a compactação do DNA é observada neste ponto da maioria das células e, em seguida, preparar a amostra para a próxima etapa de congelamento.</li>
</ol>3. amostra de congelamento por Cryo-HVET
<ol><li>Configure um dispositivo de mergulho-congelamento. Encha o reservatório com nitrogênio líquido e começar a cryo-câmara de resfriamento depois de ligar a câmara e o tanque com um tubo de Teflon.</li>
	<li>Preencha o etano líquido em uma panela de cobre pequeno dentro da câmara depois de arrefecer a câmara para temperatura do nitrogênio líquido. Use óculos durante a operação, porque etano líquido é explosivo.</li>
	<li>Brilho do carbono-lado de uma sala de concertos EM carbono revestido de descarga grade (grade holey) por 30 s a 50 mA usando um bombarder de íon do plasma.</li>
	<li>Aplicar 1 µ l do tracer BSA ouro (15 nm) para a sala de concertos grade como um marcador fiducial.</li>
	<li>Aplica uma alíquota de 2,5 µ l de células na fase de compactação do DNA à grade da sala de concertos. Borre fora a solução em excesso com um papel de filtro. Mergulhe a grade etano líquido usando um desentupidor no dispositivo de congelamento de mergulho imediatamente.</li>
	<li>Armazene as grades congeladas no armazenamento de nitrogênio líquido até que eles são examinados.</li>
</ol>4. Cryo-HVET
<ol><li>Configurar o HVEM com uma alta tensão de 1 MV.</li>
	<li>Monte a grade congelada em um suporte de cryo-amostra para HVEM pré-resfriado a-150 º C com nitrogênio líquido dentro cryo-estação de trabalho e carregá-lo para o HVEM. Tenha cuidado para evitar a contaminação por gelo.</li>
	<li>Selecione uma área de imagem em uma baixa ampliação de 1, 000 X. Ajuste a altura do eixo z eucentric.</li>
	<li>A fase de amostra a-60 ° de inclinação e retire a folga da rotação da inclina.</li>
	<li>Ajuste o foco perto do local de destino em uma ampliação de 10, 000 X. Definir um sob foco de 6 a 10 µm por desvio em relação a imagem focada. Para a imagem latente, definir a dose para 2 e–/Å-2 ou menos na amostra previamente.</li>
	<li>Medir a dose de elétrons pela densidade de corrente na tela de imagem em HVEM. Ter uma imagem em um filme de elétron ou pela câmera digital com a mesma ampliação como no processo de focalização.</li>
	<li>Recolha imagens de inclinação manualmente com o mesmo procedimento como (4,5) de-60 ° a + 60 ° em um incremento de ângulo de inclinação de 2 ° a 4 °. Nota: Em muitos modernos microscópios, a aquisição da série inclinação é automatizada pela combinação de uma câmera digital. Nesse caso, siga o manual de instruções. Para filmes negativos, desenvolver os filmes para min 12 a 20° C, em um tanque de desenvolvedor, usando um força total de desenvolvedor e correção em um fixador para 10 min. digitalizar os filmes com uma resolução de 4.000 dpi (0.635 nm/pixel na imagem) usando um scanner de mesa. No caso de uma câmera digital, submeta as imagens coletadas diretamente para a próxima etapa de processamento de imagem. Se necessário, reduza o tamanho da imagem em um filtro mediano usando duas a quatro binning (tamanho reduzindo fator) e software apropriado (por exemplo, ImageJ).</li>
</ol>5. tomográfica reconstrução
<ol><li>Fazer um arquivo de imagem de pilha de indivíduo incline imagens usando o comando "tif2mrc" ou "newstack" no IMOD software9.</li>
	<li>Iniciar o software eTomo GUI no IMOD e definir parâmetros de imagem: tamanho de pixel de diâmetro fiducial, rotação de imagem, etc. Em seguida, crie scripts.</li>
	<li>Executar programas individuais de acordo com o software listado nas tabelas de materiais, onde a série de inclinação é alinhada usando marcadores fiduciais (com um médio erro residual inferior a 0,5). Finalmente, reconstrua uma tomografia 3D usando o algoritmo SIRT em IMOD.</li>
	<li>Extrair uma região de interesse (ROI) da tomografia e denoise usando um filtro denoise: um filtro de difusão anisotrópica em uma morfologia matemática, um filtro bilateral na EMAN10ou IMOD filtro11, etc., com parâmetros adequados para realçar o contraste.</li>
</ol>6. segmentação da característica de interesse
Nota: O procedimento descrito abaixo é específico para o software utilizado (ver Tabela de materiais), mas outros pacotes de software podem ser usados em vez disso. Consulte seu guia do usuário.
<ol><li>Na janela do visualizador 3D, abra o arquivo de tomografia no software Amira e gerar um OrthoSlice.</li>
	<li>Na janela Editor de segmentação, crie um arquivo de segmentação, selecionando um novo campo"rótulo".</li>
	<li>Manualmente, traçar a fronteira da característica de interesse (FOI). Siga o FOI através de todas as fatias de tomografia. Para o segundo FOI, criar um novo "material" e repita a mesma operação.</li>
	<li>Gere uma superfície de renderização, selecionando o menu "SurfaceGen". Para visualizar o volume segmentado, selecione o menu "SurfaceView". Para mover, girar e ampliar o volume 3D, use as ferramentas na janela do visualizador 3D.</li>
	<li>Para segmentação automática, use a ferramenta de varinha mágica. Clique em um objeto e ajuste os controles deslizantes no Display e mascaramento para cobrir o intervalo de valores para que o objeto é totalmente selecionado por suas características.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Smith, R. M., Williams, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+in+gene+transcription+imparted+by+chromosome+compaction+in+the+cyanobacterium+Synechococcus+elongatus.">Circadian rhythms in gene transcription imparted by chromosome compaction in the cyanobacterium Synechococcus elongatus.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 103 (22), 8564-8569 (2006).</li><li>Kondo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cyanobacterial+circadian+clock+based+on+the+kai+oscillator.">A cyanobacterial circadian clock based on the kai oscillator.</a> CSHS Quant. 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Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Nós apresentamos uma sequência de protocolos para a visualização de transiente compactação do DNA em cianobactérias. O conceito básico é semelhante da luz correlativo e microscopia eletrônica de varredura (CLEM)12. Além disso, nesse método, cianobactérias ao vivo foram monitoradas por microscopia de fluorescência, rapidamente congeladas nas grades EM e visualizadas diretamente com tomografia computadorizada de cryo-elétron de alta tensão. Como uma primeira aplicação, a estrutura detalhada do DNA compactado células bacterianas com êxito foi visualizado em 3D. Atualmente, este procedimento é específico para este assunto, mas será aplicado mais extensivamente, com metodologia modificada em alguns casos. Aqui, as vantagens, as limitações e as possibilidades futuras deste método são discutidas.
Uma das vantagens deste método é a visualização em 3D da célula inteira. 1 MV HVEM visualizado com êxito a dinâmica estrutura das organelas subcelulares no DNA compactada de células. No entanto, a estrutura fina dentro de células normais não poderiam ser distinguida devido a imagem de baixo contraste. Aumentando inelástica e a dispersão de vários espécimes grosso desfoca a imagem13. Zero-perda e mais-provável-perda de imagem filtrando por um filtro de energia pode melhorar o contraste da imagem, reduzindo a dispersão inelástica14,15, mas não vai funcionar para amostras mais espessas do que iMFP. Os picos de perda nula e a maior perda de provável diminuem drasticamente com espessura do espécime. É particularmente difícil obter uma relação sinal / ruído suficiente para os espécimes elétron sensível incorporado no gelo. Murata et al . demonstraram que transmissão de digitalização de 1MV dá de microscopia (haste) maior contraste de imagem do que uma imagem de campo brilhante em plástico incorporado células de levedura com espessura de 5 µm, onde o contraste da imagem é principalmente dada pelo contraste de amplitude13 . No entanto, espera-se que o efeito de danos de arrastamento sobre elétrons acelerados superiores cria outra limitação para a dose de irradiação para danos sensíveis cryo-espécimes16. O pedido de Volta e Zernike fase placas17,18 de HVEM pode ser capaz de reduzir os danos de arrastamento, reduzindo a dose total no futuro. Outra limitação usando HVEM para espécimes grossos vem do fato de que as instalações do usuário que fornecem HVEM são escassas em todo o mundo.
Utilizando um método alternativo para observar espécimes grossos, tomografia computadorizada de crio-haste em 300 kV demonstrou imagens de alto contraste em espécimes congelados-hidratado com espessura superior a várias centenas de nanômetros19. Para recuperar o contraste de fase em crio-haste, microscopia eletrônica de pthychographic também foi introduzida, na qual a placa de fase na lente condensadora transpõe uma difração de fase modulada para detector 2D pixelado20. As imagens são recuperadas pelo cálculo de múltiplas difrações. Para direto e rápido 3D cryo-imagens de grande nativo congelada amostras, cryo-FIB-SEM também podem ser usado21, onde serial seccionamento com um feixe de íon focalizado e bloquear a imagem do rosto é aplicada para a imagem totalmente hidratado amostras congeladas. Embora estas tecnologias expandem o intervalo de visualização de espécimes biológicos, é difícil encontrar o local de destino das bactérias, rotulado por exemplo, as bactérias, porque o alvo está completamente sob o gelo e não pode ser identificado antes de aparar.
Compactação do DNA produz uma estrutura distinta em cianobactérias. DNA compactado células distinguem-se facilmente mesmo sem ser manchada devido a um viés de grande densidade no interior das células que não está presente em células normais. No entanto, a fim de Visualizar mais eventos locais dentro da célula, é necessário transferir o ROI fluorescente etiquetado para o microscópio de elétron. Para correlativo luz e microscopia eletrônica de varredura (CLEM), imagens de microscópio de luz e microscópio eletrônico são geralmente correlacionadas usando contas de látex fluorescentes ou pontos quânticos em localizador grades12. As partículas de rotulagem devem ser de densidade de elétrons alta além de fluorescência. Eles podem com precisão e confiabilidade correlacionar as posições entre as duas imagens. Além disso, confirmando a área rotulada com microscopia cryo-luz, completa sobreposição de ROI pode ser conseguida entre os dois microscópios. Quando caracterizam eventos estruturais mais detalhados na compactação do DNA, estas partículas e microscópio crio-luz será uma ferramenta indispensável para uma correlação mais robusta e precisa no futuro.
Este artigo mostra como caracterizar a estrutura transitória de compactação do DNA em cianobactérias por uma combinação de cultura síncrona, microscopia de fluorescência e tomografia computadorizada de cryo-elétron de alta tensão. Este protocolo centra-se na observação de DNA compactada. Combinando este método com outras novas tecnologias mencionadas acima, será possível investigar o processo de compactação do DNA em um detalhe mais adicional, e devidamente modificados métodos são amplamente aplicáveis a outros eventos dinâmicos e estruturais em bactérias.

Compactação do DNA é um acontecimento dramático citoplasmático que foi identificado em algumas cianobactérias. Quando Synechococcus elongatus era culta, abaixo dos 12 h cada ciclo claro/escuro, DNA aparecido condensada no final do período de luz, que era claramente diferente da sua aparência na época outra pontos1. Tem sido sugerido que este processo é controlado por um relógio circadiano baseado no Kai proteínas2. Seki et al relataram que o ADN manchado com Hoechst 33342 foi compactado em S. elongatus células no final do período de luz e mostrou uma ondulada em forma de haste sob um microscópio de fluorescência. O DNA compactado então separados em dois no centro da haste que a célula dividida e finalmente retornou para uma distribuição uniforme normal em cada célula filha3. No entanto, sua natureza transitória e tamanho grande para microscopia eletrônica impediu a análise estrutural. Murata et al combinados vários métodos, incluindo a cultura síncrona, microscopia de fluorescência, congelação rápida e alta tensão elétron cryo-tomografia computadorizada (cryo-HVET) e conseguiu identificar a estrutura de transiente compactação do DNA, incluindo a cinética de polifosfato corpos (PPBs)4. O manuscrito fornece uma explicação visual de um material tão difícil em detalhe, combinando os procedimentos experimentais.
S. elongatus tem uma forma de cápsula, um comprimento de 2 a 5 µm, uma largura de sobre 0.5 µm e a perfeita compactação do DNA aparece em células vivas apenas para um tempo muito curto. Portanto, as mudanças estruturais que ocorrem na compactação de DNA cianobactérias eram desconhecidas em detalhe. Para investigar essas estruturas por microscopia eletrônica, é necessário superar os dois principais problemas técnicos. Uma é a observação de um espécime tão grossa de toda bactéria em condições nativas quase, e o outro é a fixação rápida de uma estrutura dinâmica. Quanto ao primeiro problema, o percurso livre médio (iMFP) inelástico de elétrons varia de acordo com a tensão de aceleração do microscópio eletrônico5. Em um microscópio eletrônico de transmissão (TEM) de 300 kV, é menos de 350 nm. Por exemplo, quando uma associação de gelo-incorporado (espécime espessura ≈ 600 nm) é observada em 200kV TEM (≈ iMFP 250 nm), as estruturas no interior da célula são difíceis de observar. Por contraste, 1 MV TEM (iMFP ≈ 500 nm) pode dar e imagem da estrutura citoplasmática em toda a célula (Figura 1). Neste protocolo, como uma parte da solução, um microscópio de alta voltagem (HVEM) em uma tensão de aceleração de 1 MV foi empregado. No entanto, as instalações que implementam HVEM limitam-se em todo o mundo. Possíveis soluções alternativas também são discutidas na seção de discussão. O segundo problema foi resolvido pela microscopia cryo-elétron (cryo-EM). Esta é uma poderosa ferramenta para a visualização de estruturas dinâmicas em condições nativas, onde a amostra é rapidamente congelada em etano líquido usando um dispositivo de congelação rápido, e o momento congelado é diretamente observado com um mínimo de modificações6quase. Combinando com tomografia computadorizada, um instantâneo de estruturas tridimensionais (3D) pode ser reconstruído da inclinação série7. Neste experimento, compactação do DNA foi reproduzida em s. elongatus usando síncrona cultura abaixo dos 12 h cada claro/escuro do ciclo, e o momento do congelamento da amostra foi determinado pelo monitoramento sob um microscópio de fluorescência.
As abordagens descritas aqui são amplamente aplicáveis ao estudo das estruturas dinâmicas em células bacterianas, por exemplo, a divisão celular, segregação do cromossomo e infecção do fago e têm um potencial para abrir novos caminhos na investigação microbiológica.

<table><tbody><tr><td>Hoechst 33342 solution</td><td>Dojindo</td><td>346-07951</td><td>1mg/mL in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Agar Powder (for plant culture)</td><td>Wako</td><td>016-11875</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Wako</td><td>027-02192</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>Manganese chloride tetrahydrate</td><td>Wako</td><td>139-00722</td><td>99%</td></tr><tr><td>Zinc sulfate heptahydrate</td><td>Wako</td><td>264-00405</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>Sodium molybdate</td><td>Wako</td><td>196-02472</td><td>99%</td></tr><tr><td>Copper sulfate pentahydrate</td><td>Wako</td><td>039-04412</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>Cobalt nitrate hexahydrate</td><td>Wako</td><td>031-03752</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>Sodium nitrate</td><td>Wako</td><td>191-02542</td><td>99%</td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Wako</td><td>131-00405</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>Calcium chloride dehydrate</td><td>Wako</td><td>031-00435</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>Citric acid</td><td>Wako</td><td>036-05522</td><td>98%</td></tr><tr><td>EDTA-2Na</td><td>Dojindo</td><td>343-01861</td><td>99.5%</td></tr><tr><td>Sodium carbonate</td><td>Wako</td><td>197-01581</td><td>99.8%</td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic</td><td>Wako</td><td>164-04295</td><td>99%</td></tr><tr><td>TES (Good&amp;rsquo;s buffer)</td><td>Dojindo</td><td>344-02653</td><td>99%</td></tr><tr><td>Ferric ammonium citrate</td><td>Wako</td><td>092-00802</td><td>1st Grade</td></tr><tr><td>Sodium thiosulfate pentahydrate</td><td>Wako</td><td>197-03585</td><td>99%</td></tr><tr><td>BSA gold tracer 15nm</td><td>Aurion</td><td>215.133</td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil EM grid</td><td>Quantifoil MicroTools</td><td>R3.5/1 Copper grid</td><td></td></tr><tr><td>Electron films</td><td>Kodak</td><td>SO-163</td><td></td></tr><tr><td>Developer</td><td>Kodak</td><td>D19</td><td></td></tr><tr><td>Fixer</td><td>Kodak</td><td>Rapid fixer</td><td>Solution</td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Whatman</td><td>Grade 1</td><td></td></tr><tr><td>Growth chamber</td><td>NKsystem</td><td>LH-100SP</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE 50i</td><td></td></tr><tr><td>High voltage TEM</td><td>HItachi</td><td>H1250M</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-specimen holder for HVEM</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>plunge-freezing device</td><td>Leica</td><td>EM CPC</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Ion bombarder</td><td>Vacuum device</td><td>PIB-10</td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen storage</td><td>Taylor-Wharton</td><td>25LDB</td><td></td></tr><tr><td>Developing tank</td><td>Dosaka EM</td><td>TB-3-75</td><td></td></tr><tr><td>flatbed scanner</td><td>Nikon</td><td>Coolscan 9000ED</td><td></td></tr><tr><td>Segmentation software</td><td>FEI</td><td>Amira</td><td>https://www.fei.com/software/amira</td></tr><tr><td>Tomographic Reconstruction software</td><td>eTOMO</td><td></td><td>http://bio3d.colorado.edu/imod</td></tr></tbody></table>

visualization of dna compaction in cyanobacteria by high-voltage cryo-electron tomography

Este protocolo descreve como visualizar a transiente compactação do DNA em cianobactérias. Compactação do DNA é um evento citoplasmático dramático recentemente encontrado para ocorrer em algumas cianobactérias antes da divisão celular. No entanto, devido o tamanho de células grandes e o caráter transitório, é difícil investigar a estrutura em detalhes. Para superar as dificuldades, primeiro, compactação do DNA é reproducibly produzida na associação Synechococcus elongatus PCC 7942 pela cultura síncrona usando 12 h cada ciclo claro/escuro. Em segundo lugar, compactação do DNA é monitorizada por microscopia de fluorescência e capturada por congelação rápida. Em terceiro lugar, a estrutura detalhada do DNA compactado células é visualizado em três dimensões (3D) pela tomografia computadorizada de cryo-elétron de alta tensão. Este conjunto de métodos é amplamente aplicável para investigar estruturas transientes em bactérias, por exemplo, a divisão celular, segregação do cromossomo, infecção do fago , etc., que são monitorados por microscopia de fluorescência e visualizado diretamente pela tomography do Cryo-elétron em pontos de tempo apropriado.

Em uma cultura síncrona precisa menos de 12h cada luz/escuro ciclo, DNA rotulado com Hoechst mostra uma distribuição uniforme normal na condição de escuro (Figura 2a). No entanto, ele progressivamente compacta dentro da célula durante o período de luz e aparece como uma estrutura ondulada de haste-como (Figura 2b) no final do período de luz. Finalmente, a haste divide no centro (setas na Figura 2C) e duas partes são distribuídos para as células filhas (Figura 2d). Após a divisão celular, o DNA compactado desaparece imediatamente, e o DNA retorna para uma distribuição uniforme normal.
Quando uma alíquota de células que contêm as células em fase final de compactação do DNA foram imediatamente transferidos para um sala de concertos grid e rápida congelado em etano líquido, e a grade congelada foi observada por 1 MV cryo-HVEM, as estruturas internas das cianobactérias incluindo DNA, camadas de membrana tilacoides, paredes celulares e PPBs, aparecem como um instantâneo no momento do congelamento (Figura 3a). Muitas células mostraram distinta compactação do DNA nas células (setas brancas na Figura 3a) e podem ser facilmente distinguidas de células normais (pontas de seta brancas na Figura 3b). Alguns exibiram uma constrição no centro das células como esperado antes da divisão celular (seta amarela na Figura 3a).
Em tomograms 3D, principais organelas da célula poderiam ser segmentadas; parede celular, camadas de membrana tilacoides, DNA e PPBs poderia ser distinto (Figura 4). Em particular, o DNA compactado foi separado por uma diferença distinta no citoplasma onde o DNA foi cercado por material de baixa densidade e as camadas de membrana tilacoides foram distorcidas ao longo da haste ondulado de DNA compactada. Comportamento dinâmico dos PPBs observou-se recentemente: no DNA compactado células, muitas pequenas PPBs foram vistos a aderir ao DNA, Considerando que eles são grandes e menos em células normais. Além disso, a maioria dos PPBs apareceu como pares, e DNA aparentava estar em um processo de separação dos PPBs. Isto sugere que PPBs se são divididos em dois pela duplicação de DNA e função como fornecedores de fosfato para a síntese de DNA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig1.jpg"> Figura 1. Imagens de Cryo-EM de cianobactérias normais incorporado no gelo, S. elongatus PCC 7942 com diferentes voltagens de aceleração. a) 200kV e b) 1000kV. Barra de escala = 500 nm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57197/57197fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig2.jpg"> Figura 2: Microscopia de fluorescência das células de S. elongatus associação. Após cultura síncrona ciclos de cada luz/escuro de menos de 12 horas, as células foram coradas com Hoechst 33342. (a) células após 2 h do início do estado escuro mostram uniforme DNA rotulagem. O DNA em muitas células condensado gradualmente durante o período de luz. Em última análise, formou-se uma haste ondulado grosso (b) típico de compactação do DNA. Após esta etapa, as estruturas de DNA compactadas rapidamente divididas em seus centros (setas) durante a divisão celular (c) e os dois fragmentos separaram em células-filhas (d). As células-filhas retornado a rotulagem uniforme do DNA no período escuro. Barra de escala = 2 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57197/57197fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig3.jpg"> Figura 3: imagem de Cryo-HVEM de cianobactérias incorporado no Gelo amorfo (a) mostra uma imagem raw na inclinação de 0 °. Imagens foram tomadas no final do período de luz. Algumas células mostram corpos ondulados de DNA de forma cilíndrica semelhante aos cromossomas condensadas eucarióticas (setas brancas). Em células normais, cianobactérias exibem uma estrutura de DNA discernível no citoplasma (setas brancas). Alguns apresentam uma constrição no centro das células como esperado antes da divisão celular (seta amarela). (b) xy, xz e yz-fatias de uma tomografia 3D. Linhas amarelas pontilhadas mostrar interseções de fatias. Barra de escala = 2 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57197/57197fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57197/57197fig4.jpg"> Figura 4: ultraestrutura de células contendo compactado DNA. Os componentes principais são segmentados: parede celular (amarelo brilhante), membranas tilacoides (vermelhas) e DNA (azul). (a) mostra uma z-fatia de uma tomografia 3D. (b) todos os segmentos. A constrição indicando a separação de célula aparece no centro da célula (seta). PPBs são modelados como esferas de amarelas ou laranja; cada esfera laranja representa a contrapartida da esfera amarela mais próxima. Barra de escala = 500 nm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57197/57197fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Este protocolo descreve como visualizar a transiente compactação do DNA em cianobactérias. Cultivo síncrono, monitoramento por microscopia de fluorescência, congelação rápida e alta tomography do cryo-elétron de tensão são usados. É apresentado um protocolo para essas metodologias e desenvolvimentos e aplicações futuras são discutidos.

Visualização de compactação do DNA em cianobactérias por tomografia computadorizada de alta tensão Cryo-elétron

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

9.0K visualizações.  National Institute for Physiological Sciences. Este protocolo descreve como visualizar a transiente compactação do DNA em cianobactérias. Cultivo síncrono, monitoramento por microscopia de fluorescência, congelação rápida e alta tomography do cryo-elétron de tensão são usados. É apresentado um protocolo para essas metodologias e desenvolvimentos e aplicações futuras são discutidos.

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Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the structure of neurites is critical to understanding how these processes move materials and signals that support synaptic communication. Electron microscopy (EM) has been traditionally used to assess the ultrastructural features within neurites; however, the exposure to organic solvent during dehydration and resin embedding can distort structures. An important unmet goal is the formulation of procedures that allow for structural evaluations not impacted by such artifacts.
Here, we have established a detailed and reproducible protocol for growing and flash-freezing whole neurites of different primary neurons on electron microscopy grids followed by their examination with cryo-electron tomography (cryo-ET). This technique allows for 3-D visualization of frozen, hydrated neurites at nanometer resolution, facilitating assessment of their morphological differences. Our protocol yields an unprecedented view of dorsal root ganglion (DRG) neurites, and a visualization of hippocampal neurites in their near-native state. As such, these methods create a foundation for future studies on neurites of both normal neurons and those impacted by neurological disorders.

To preserve neuronal processes for ultrastructural analysis, we describe a protocol for plating of primary neurons on electron microscopy grids followed by flash freezing, yielding samples suspended in a layer of vitreous ice. These samples can be examined with a cryo-electron microscope to visualize structures at the nanometer scale.

Preparação de primário neurônios para visualizar Neuritos num Estado Frozen-hidratado Usando Cryo-Electron Tomografia

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Neurociência

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Usando Tomoauto: Um Protocolo de métodos de alta capacidade automatizada Cryo-Electron Tomografia

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Bioengenharia

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in situ. Owing to the strong interaction of an electron with the matter, high-resolution cryo-ET studies are limited to specimens with a thickness of less than 200 nm, which restricts the applicability of cryo-ET only to the peripheral regions of a cell. A complex workflow that comprises the preparation of thin cellular cross-sections by cryo-focused ion beam micromachining (cryo-FIBM) was introduced during the last decade to enable the acquisition of cryo-ET data from the interior of larger cells. We present a protocol for the preparation of cellular lamellae from a sample vitrified by plunge freezing utilizing Saccharomyces cerevisiae as a prototypical example of a eukaryotic cell with wide utilization in cellular and molecular biology research. We describe protocols for vitrification of S. cerevisiae into isolated patches of a few cells or a continuous monolayer of the cells on a TEM grid and provide a protocol for lamella preparation by cryo-FIB for these two samples.

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

We present a protocol for lamella preparation of plunge frozen biological specimens by cryo-focused ion beam micromachining for high-resolution structural studies of macromolecules in situ with cryo-electron tomography. The presented protocol provides guidelines for the preparation of high-quality lamellae with high reproducibility for structural characterization of macromolecules inside the&#160;Saccharomyces cerevisiae.

Preparação e micromaquinção Crio-FIB de Saccharomyces cerevisiae para Tomografia Crio-Elétron

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Bioquímica

Electron Cryotomography of Bacterial Cells

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for instance how they generate and maintain specific cell shapes, establish polarity, segregate their genomes, and divide. In order to understand these phenomena, imaging technologies are needed that bridge the resolution gap between fluorescence light microscopy and higher-resolution methods such as X-ray crystallography and NMR spectroscopy.
Electron cryotomography (ECT) is an emerging technology that does just this, allowing the ultrastructure of cells to be visualized in a near-native state, in three dimensions (3D), with "macromolecular" resolution (~4nm).1, 2 In ECT, cells are imaged in a vitreous, "frozen-hydrated" state in a cryo transmission electron microscope (cryoTEM) at low temperature (&lt; -180&deg;C). For slender cells (up to ~500 nm in thickness3), intact cells are plunge-frozen within media across EM grids in cryogens such as ethane or ethane/propane mixtures. Thicker cells and biofilms can also be imaged in a vitreous state by first "high-pressure freezing" and then, "cryo-sectioning" them. A series of two-dimensional projection images are then collected through the sample as it is incrementally tilted along one or two axes. A three-dimensional reconstruction, or "tomogram" can then be calculated from the images. While ECT requires expensive instrumentation, in recent years, it has been used in a few labs to reveal the structures of various external appendages, the structures of different cell envelopes, the positions and structures of cytoskeletal filaments, and the locations and architectures of large macromolecular assemblies such as flagellar motors, internal compartments and chemoreceptor arrays.1, 2
In this video article we illustrate how to image cells with ECT, including the processes of sample preparation, data collection, tomogram reconstruction, and interpretation of the results through segmentation and in some cases correlation with light microscopy.

We illustrate here how to use electron cryotomography (ECT) to study the ultrastructure of bacterial cells in near-native states, to "macromolecular" (~4 nm) resolution.

Electron Cryotomography de células bacterianas

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for ...

Biologia

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and mediates the delivery of protein and DNA substrates to target cells, a process generally requiring direct cell-to-cell contact. We have recently solved the structure of the Dot/Icm apparatus by cryo-electron tomography (cryo-ET) and showed that it forms a cell envelope-spanning channel that connects to a cytoplasmic complex. Applying two complementary approaches that preserve the native structure of the specimen, fluorescent microscopy in living cells and cryo-ET, allows in situ visualization of proteins and assimilation of the stoichiometry and timing of production of each machine component relative to other Dot/Icm subunits. To investigate the requirements for polar positioning and to characterize dynamic features associated with T4SS machine biogenesis, we have fused a gene encoding superfolder green fluorescent protein to Dot/Icm ATPase genes at their native positions on the chromosome. The following method integrates quantitative fluorescence microscopy of living cells and cryo-ET to quantify polar localization, dynamics, and structure of these proteins in intact bacterial cells. Applying these approaches for studying the Legionella pneumophila T4SS is useful for characterizing the function of the Dot/Icm system and can be adapted to study a wide variety of bacterial pathogens that utilize the T4SS or other types of bacterial secretion complexes.

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Imaging of bacterial cells is an emerging systems biology approach focused on defining static and dynamic processes that dictate the function of large macromolecular machines. Here, integration of quantitative live cell imaging and cryo-electron tomography is used to study Legionella pneumophila type IV secretion system architecture and functions.

Aplicando imagens de células vivas e tomografia crio-elétron para resolver características espaciales do Sistema de Secreção Legionella pneumophila Dot/ICM

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

Imunologia e Infecção

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

Visualização da ATP sintase Dimers na mitocôndria por Electron Cryo-tomografia

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Simplified Volumetric Models as an Effective Strategy for Segmenting Actin Networks in Cryo-Electron Tomograms

Efficient methods for the extraction of features of interest remain one of the biggest challenges for the interpretation of cryo-electron tomograms. Various automated approaches have been proposed, many of which work well for high-contrast datasets where the features of interest can be easily detected and are clearly separated from one another. Our inner ear stereocilia cryo-electron tomographic datasets are characterized by a dense array of hexagonally packed actin filaments that are frequently cross-connected. These features make automated segmentation very challenging, further aggravated by the high-noise environment of cryo-electron tomograms and the high complexity of the densely packed features. Using prior knowledge about the actin bundle organization, we have placed layers of a highly simplified ball-and-stick actin model to first obtain a global fit to the density map, followed by regional and local adjustments of the model. We show that volumetric model building not only allows us to deal with the high complexity, but also provides precise measurements and statistics about the actin bundle. Volumetric models also serve as anchoring points for local segmentation, such as in the case of the actin-actin cross connectors. Volumetric model building, particularly when further augmented by computer-based automated fitting approaches, can be a powerful alternative when conventional automated segmentation approaches are not successful.

Here, we present a protocol to place simplified volumetric models into noisy, complex, tomographic 3D volumes. This allows the fast segmentation of actin filament densities, detection of systematic filament bending and of gaps in hair bundle filaments, as well as convenient quantification of volumetric model properties, such as distances.

Efficient methods for the extraction of features of interest remain one of the biggest challenges for the interpretation of cryo-electron tomograms. ...

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these techniques, cryo soft X-ray tomography (SXT) allows imaging whole cryo-preserved cells in the water window X-ray energy range (284-543 eV), in which carbon structures have intrinsically higher absorption than water, allowing the 3D reconstruction of the linear absorption coefficient of the material contained in each voxel. Quantitative structural information at the level of whole cells up to 10 &#181;m thick is then achievable this way, with high throughput and spatial resolution down to 25-30 nm half-pitch. Cryo-SXT has proven itself relevant to current biomedical research, providing 3D information on cellular infection processes (virus, bacteria, or parasites), morphological changes due to diseases (such as recessive genetic diseases) and helping us understand drug action at the cellular level, or locating specific structures in the 3D cellular environment. In addition, by taking advantage of the tunable wavelength at synchrotron facilities, spectro-microscopy or its 3D counterpart, spectro-tomography, can also be used to image and quantify specific elements in the cell, such as calcium in biomineralization processes. Cryo-SXT provides complementary information to other biological imaging techniques such as electron microscopy, X-ray fluorescence or visible light fluorescence, and is generally used as a partner method for 2D or 3D correlative imaging at cryogenic conditions in order to link function, location, and morphology.

Here, a protocol describing the sample preparation and data collection steps required in cryo soft X-ray tomography (SXT) to image the ultrastructure of whole cryo-preserved cells at a resolution of 25 nm half pitch, is presented.

Uma descrição cartográfica 3D da célula por crioma tomografia de raios-X suave

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...

Cryo-Electron Tomography Remote Data Collection and Subtomogram Averaging

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved automated acquisition strategies, preparative techniques that expand the possibilities of what the electron microscope can image at high-resolution using cryo-ET and new subtomogram averaging software. Additionally, data acquisition has become increasingly streamlined, making it more accessible to many users. The SARS-CoV-2 pandemic has further accelerated remote cryo-electron microscopy (cryo-EM) data collection, especially for single-particle cryo-EM, in many facilities globally, providing uninterrupted user access to state-of-the-art instruments during the pandemic. With the recent advances in Tomo5 (software for 3D electron tomography), remote cryo-ET data collection has become robust and easy to handle from anywhere in the world. This article aims to provide a detailed walk-through, starting from the data collection setup in the tomography software for the process of a (remote) cryo-ET data collection session with detailed troubleshooting. The (remote) data collection protocol is further complemented with the workflow for structure determination at near-atomic resolution by subtomogram averaging with emClarity, using apoferritin as an example.

The present protocol describes high-resolution cryo-electron tomography remote data acquisition using Tomo5 and subsequent data processing and subtomogram averaging using emClarity. Apoferritin is used as an example to illustrate detailed step-by-step processes to achieve a cryo-ET structure at 2.86 &#197; resolution.

Coleta remota de dados de tomografia crio-elétron e média de subtomograma

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has been gaining momentum in recent years, especially since the introduction of direct electron detectors, improved ...

Visualization of Organelles In Situ by Cryo-STEM Tomography

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) relies on the imaging of biological or organic specimens embedded in their native aqueous medium; water is solidified into a glass (i.e., vitrified) without crystallization. The cryo-EM method is widely used to determine the structure of biological macromolecules recently at a near-atomic resolution. The approach has been extended to the study of organelles and cells using tomography, but the conventional mode of wide-field transmission EM imaging suffers a severe limitation in the specimen thickness. This has led to a practice of milling thin lamellae using a focused ion beam; the high resolution is obtained by subtomogram averaging from the reconstructions, but three-dimensional relations outside the remaining layer are lost. The thickness limitation can be circumvented by scanned probe imaging, similar to the scanning EM or the confocal laser scanning microscope. While scanning transmission electron microscopy (STEM) in materials science provides atomic resolution in single images, the sensitivity of cryogenic biological specimens to electron irradiation requires special considerations. This protocol presents a setup for cryo-tomography using STEM. The basic topical configuration of the microscope is described for both two- and three-condenser systems, while automation is provided by the non-commercial SerialEM software. Enhancements for batch acquisition and correlative alignment to previously-acquired fluorescence maps are also described. As an example, we show the reconstruction of a mitochondrion, pointing out the inner and outer membrane and calcium phosphate granules, as well as surrounding microtubules, actin filaments, and ribosomes. Cryo-STEM tomography excels in revealing the theater of organelles in the cytoplasm and, in some cases, even the nuclear periphery of adherent cells in culture.

Visualization of Organelles In Situ by Cryo-STEM Tomography

Cryo-STEM tomography provides a means to visualize organelles of intact cells without embedding, sectioning, or other invasive preparations. The 3D resolution obtained is currently in the range of a few nanometers, with a field of view of several micrometers and an accessible thickness in the order of 1 &#181;m.