Este protocolo é útil para caracterizar as funções de montagem de peles de secreção bacteriana e pode levar a uma compreensão fundamental dos mecanismos moleculares necessários para interações patógenas hospedeiras. Essa técnica integra abordagens complementares que preservam a estrutura nativa da amostra e permitem e veem a visualização de complexos proteicos em células bacterianas intactas. Aumenta nossa compreensão das relações de função estrutural dos sistemas de secreção bacteriana.
Este método pode ser adaptado para estudar outros tipos de sistemas de secreção ou outros complexos celulares em uma ampla variedade de espécies bacterianas. Comece fazendo almofadas de agarose para imagens de células vivas. Prepare cerca de 30 mL de solução de agarose de derretimento 1% baixa na água e micro-ondas em um frasco de vidro por cerca de 90 segundos girando-o ocasionalmente até que a agarose seja completamente dissolvida.
Coloque dois slides de vidro de 22 por 22 por 0,15mm na borda de um deslizamento de vidro de 25 por 75 por 1,1 mm um em cima do outro. Em seguida, empilhe mais dois slides menores na outra borda. Pipeta cerca de 1 mL da agarose derretida no slide central entre os dois slides de vidro superior e colocar outro grande slide em cima da agarose derretida certificando-se de evitar a formação de bolhas de ar.
Esfrie os slides a quatro graus celsius por 15 minutos e use um bisturi ou lâmina de barbear para cortar suavemente a almofada em pequenos quadrados. Fixar uma moldura adesiva de dois lados em um deslizamento de vidro de 25 por 75 por 1,1 mm e coloque várias almofadas no slide. Dissolva um pedaço pesado de Legionella Pneumophila em 1 mL de água dupla destilada.
Em seguida, vórtice e pipeta dois a três microliters da diluição sobre as almofadas. Coloque suavemente um deslizamento de cobertura de 58 por 24 por 0,15 mm sobre o quadro adesivo. Selecione células para imagens usando iluminação de campo brilhante.
Em seguida, na janela de captura do software do microscópio, ajuste o ND para 180 e o binning para dois por dois. Use o canal de 488 nanômetros para expor a amostra por 500 a 1000 milissegundos e validar a especificidade da fluorescência por imagem não marcada Legionella Pneumophila com os mesmos parâmetros. Para quantificar a polaridade, ajuste o contraste da imagem para que as bactérias sejam claramente visíveis.
Em seguida, amplie a região de interesse e use a ferramenta da região para colocar um retângulo de 0,25 por 1,3 micrômetro começando no polo e estendendo-se para o citoplasma certificando-se de que o retângulo permanece dentro das bordas bacterianas. Marque pelo menos 200 bactérias e crie máscaras usando a região para mascarar o botão no menu de análise. Clique nas estatísticas da máscara e escolha o objeto sob o escopo da máscara.
Em seguida, marque intensidade média e variância sob características e intensidade. Exporte os dados como um arquivo de texto e use o aplicativo de planilha para calcular os escores de polaridade de cada bactéria como a razão entre a variância e a intensidade média. Para aplicações de alto rendimento, use microscopia de contraste facial para adquirir imagens de dois canais.
Certifique-se de escolher campos de visão onde as bactérias estão totalmente separadas. Em seguida, ajuste o contraste do canal facial da imagem para um nível onde as bactérias são claramente visíveis. Abra a imagem do canal duplo e inicie a janela de máscaras do segmento de criação.
Ajuste o limiar apropriado e remova os objetos pequenos clicando no botão definir objetos e ajustando o tamanho mínimo para 100 pixels. Sob a máscara de refinar, selecione remover bordas de objetos e máscaras separadas de bactérias adjacentes umas às outras. Para quantificar a dinâmica das proteínas de fusão, abra a janela de captura de imagem e marque o lapso de tempo.
Digite dois na caixa de pontos de tempo. Adquira duas imagens bem sucedidas de Legionella Pneumophila expressando a proteína fluorescente de interesse. Ajuste o contraste da imagem até que as células estejam claramente visíveis.
Em seguida, use a ferramenta região para colocar um quadrado de 0,25 por 0,25 micrômetro no meio de pelo menos 400 células. Em seguida, use a região para mascarar o botão no menu de análise para criar uma máscara dos quadrados de interesse. Crie uma nova máscara vazia e use a ferramenta pixel para marcar toda a área celular de pelo menos 25 células aleatórias.
Crie outra máscara e use a ferramenta de pincel grande para marcar áreas entre as células. Finalmente, selecione as estatísticas da máscara e certifique-se de que o objeto seja selecionado sob o escopo da máscara para a máscara um. Sob características e intensidade, escolha intensidade média.
Exporte os dados e repita o processo para a máscara 2. Para a máscara 3, selecione toda a máscara e exporte a intensidade média. Para preparar a amostra de criotomografia eletrônica, cresça um trecho pesado de Legionella Pneumophila em placas de Agrastreptomisum CYE por 48 horas a 37 graus Celsius.
Resuspend as células na água para um OD 600 de cerca de 0,7. Em seguida, adicione cinco microliters de partículas de ouro coloidais a 20 microliters da suspensão celular. Descarreta uma grade de carbono furada e pipeta cinco microliters da mistura celular sobre ele.
Deixe-o ficar por um minuto. Borrue a grade com papel filtro e congele-a em etano líquido usando um aparelho de êmbolo movido à gravidade. Após inserir a superpatora GFP no cromossomo Legionella Pneumophila, a microscopia fluorescente de células vivas foi realizada para comparar o sinal fluorescente com o da cepa negativa da superpato parental GFP.
Além disso, a microscopia de campo brilhante foi utilizada para examinar a proporção de células com um sinal fluorescente específico. Apenas uma fração das células que produziram a superpatos DotB GFP exibiu localização polar da proteína de fusão. Ao caracterizar a distribuição do sinal fluorescente DotB, verificou-se que a intensidade da superpatos DotB GFP nos polos era cerca de duas vezes maior do que no citosol.
Para investigar se a localização polar da superpatos DotB GFP dependia de um sistema de secreção tipo quatro totalmente montado, as pontuações de polaridade da superpatos DotB GFP foram determinadas para células individuais em um tipo selvagem, e em um tipo quatro de sistema de secreção mutante. De fato, o posicionamento polar da superpatos DotB GFP desapareceu quando o sistema Dot/ICM foi excluído. Padrões dinâmicos indicaram que o DotB ATPase estava presente em uma população citosolica dinâmica e foi recrutado para o sistema de secreção do tipo 4 do Dot/ICM localizado em uma reação de montagem em estágio final.
Crio-ET de alta produtividade foi usado para visualizar o aparelho intacto do sistema de secreção tipo quatro em uma cepa Legionella Pneumophila expressando a superpatoria DotB GFP. A reconstrução da célula revelou várias máquinas Dot/ICM embutidas no envelope da célula. Também foi determinado o posicionamento geral do DotB e da superpatos GFP em relação à máquina intacta do sistema de secreção tipo quatro.
Renderizações tridimensionais da superfície indicaram que a superpatosa GFP está posicionada abaixo do hexamer DotB, que se monta como um disco na base do complexo de ATPase citoplasmado. Ao tentar essa técnica, certifique-se de avaliar a estabilidade das proteínas de fusão e a funcionalidade do sistema de secreção de etiquetas antes de prosseguir para a aquisição de imagem. Modelagem e encaixe podem ser formas eficazes de analisar os padrões dinâmicos e densidades estruturais, bem como para avaliação de mudanças conformais ou localização de subunidades na estrutura.
Essa abordagem pode ajudar a entender como diferentes componentes do sistema secreto tipo quatro funcionam, como eles interagem dentro do complexo maior e quais funções diferentes subconjuntos funcionam.
