A pesquisa realizada pelos autores foi apoiada em parte por subsídios da União Europeia sétimo programa-quadro (FP7/2007-2013) sob Grant acordo n. º 229239 e da Fundação AO, exploratória pesquisa colaborativa pesquisa programa aguda Cartilagem ferimento/lesão/defeito (CRP ACI) no âmbito do projecto Bioactive e andaimes biomimético para regeneração de cartilagem (BIOCART).

1. auto-montagem peptídeo andaime (SAPS) preparação
<ol><li>Preparar uma solução de 0,5% de peptídeo RAD16-I em sacarose 20% (p/v), num tubo de centrífuga de micro. Proceda à sonicação a solução de peptídeo por 20 min em um banho ultra-sônico na potência máxima e à temperatura ambiente (RT) para garantir a mistura homogênea. Nota: O volume da solução a ser preparada dependerá do número de encapsulamentos desejado. RAD16-eu peptídeos não sofrem degradação sob essas condições sonication.</li>
	<li>Dilua a solução de peptídeo preparada no passo 1.1 com o volume necessário de sacarose 10% (p/v) para obter a concentração final desejada. Nota: Um factor importante a ter em consideração é o ajuste da concentração inicial do peptide desde que a rigidez da matriz final dependerá este parâmetro. O RAD16-eu peptídeo solução deve ser 2x mais concentrado do que a concentração final desejada da construção de 3D. Normalmente, o RAD16 final-são concentrações de peptídeo usadas entre 0,15-0,5% (p/v).</li>
	<li>Coloca o tubo de centrífuga de micro contendo a solução de peptídeo em um banho ultra-sônico em RT por 20 min para garantir a mistura homogênea. Nota: A solução de peptídeo, se não usado imediatamente, pode ser armazenada por vários meses a 4 ° C.</li>
</ol>2. preparação de suspensão de célula
<ol><li>Centrifugar a suspensão de célula (obtida após o tratamento de tripsina) 60 x g e RT por 5 min.</li>
	<li>Remover o sobrenadante com uma pipeta Pasteur, conectada a uma linha de vácuo e suspender o centrifugado em 3-5 mL de sacarose 10% (p/v), utilizando uma micropipeta. Prossiga para contar células usando um contador de células manual ou automático. Nota: A solução de sacarose a 10% (p/v) é um meio isotônico e não-iônicos que permite a manutenção da célula e evita a gelificação do peptide durante o processo de mistura.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão de eritrócitos em 60 x g e RT 5 min. Retire o sobrenadante e suspender o centrifugado novamente no volume necessário de sacarose 10% (p/v) para obter o dobro da concentração celular final desejado (recomendável aproximadamente 4 x 106 células / mL).</li>
	<li>Coloque um número desejado de inserções de cultura de tecido em cada poço de uma placa de 6 (uma inserção por encapsulamento).</li>
	<li>Proceda à sonicação a solução de peptídeo preparada na etapa 1 na potência máxima e RT por 5 min.</li>
	<li>Pipetar e coloque 40 µ l da suspensão celular (obtida no ponto 2.3) para cada encapsulamento desejado e mais cerca de 10 a 15% do volume extra em um tubo de centrífuga de micro padrão.</li>
</ol>3. 3D celular encapsulamento em sucos
<ol><li>Misturar um volume igual do RAD16-solução de sacarose 10% (p/v) (40 µ l por encapsulamento) com um volume igual da suspensão de eritrócitos (40 µ l por encapsulamento) preparada na etapa 2 para obter uma suspensão de células da concentração de peptídeo desejada (em 10% de sacarose). Misture pipetando lentamente subindo e descendo cerca de 10 vezes. Evite a formação de bolhas durante a mistura. Nota: Este passo é fundamental e deve ser realizado com muito cuidado, desde que as células estão sob condições hostis devido o peptídeo de baixo pH (aproximadamente 3.5 – 4.0).</li>
	<li>Utilizando uma micropipeta, cuidadosamente carrega 80 µ l da suspensão em cada inserção.</li>
	<li>Adicione 0,5 mL de meio de cultura para o fundo do poço para molhar a inserção da membrana, permitindo mídia de difusão promover o peptídeo auto-montagem e formação de hidrogel. Deixe o peptídeo gel para aproximadamente 20 min no gabinete fluxo. Nota: A manipulação das amostras durante o tempo de presa pode acabar em gel de quebra.</li>
	<li>Muito lentamente, adicionar 40 µ l de meio para a inserção e deixá-lo deslizar para baixo a parede interna para o gel. Nota: Normalmente, o carregamento desse volume deve demorar entre 20 a 30 s.</li>
	<li>Coloque a placa na incubadora (37 ° C, 5% de CO2, ambiente umidificado) por 20 min. Este passo e sucessivas adições médias favorecerá a lixiviação da sacarose e equilibrio de células com meio de cultura.</li>
	<li>Adicione 60 µ l de meio para a parede interna da inserção, permitindo que fluem para baixo da parede. Aspire o meio do poço, que é rico em sacarose, e adicionar 0,5 mL de meio fresco.</li>
	<li>Adicionar 60 µ l de meio devagar para a inserção e coloque a placa na incubadora (37 ° C, 5% de CO2, ambiente umidificado) por 10 min.</li>
	<li>Aspire o meio do poço e adicionar 2,5 mL de meio fresco dentro do poço. Adicione 200 µ l de meio para a inserção. Coloque a placa na incubadora (37 ° C, 5% de CO2, ambiente umidificado) para manter as células sob condições adequadas.</li>
	<li>Mude o meio todos os dias. Remova o antigo médio do fundo do poço. Adicione 2,5 mL de meio fresco para o bem e 200 µ l para a inserção. Nota: Se a diferenciação celular continua, a mídia induzindo específica será adicionada para as culturas, originando o compromisso do tipo de célula desejado (veja abaixo, a diferenciação de células).</li>
</ol>4. célula viabilidade em 3D-SAPS
<ol> <li>Nota: O ensaio da viabilidade celular é conhecido como Live/mortos — ensaio de viabilidade/citotoxicidade também.</li>
	<li>Em um tubo de 15 mL, preparar o volume necessário de solução fresca de 2 µM calceína AM e 2 µM de etídio homodímero-1 (EthD-1) em PBS por num Vortex para manter s. 10, no escuro. Nota: O volume a ser usado para cada amostra dependerá do tamanho bem de acordo com o seguinte: 2 mL para cada poço de uma placa de 6-multiwell; 1 mL para cada bem de uma placa de 12-multiwell e 0,5 mL para cada poço da placa 24-multiwell.</li>
	<li>Utilizando uma micropipeta, enxágue as amostras 3D-SAPS 3 vezes com 2 mL de PBS e em seguida, cubra-o com a solução preparada no passo 4.1. -Incube RT por 40 min no escuro.</li>
	<li>Utilizando uma micropipeta, enxágue as construções com 2 mL de PBS 5 vezes.</li>
	<li>Visualize as amostras sob um microscópio de fluorescência usando 10 X ou 20 X de ampliação.</li>
</ol>5. diferenciação celular
<ol><li>Células de cultura (37 ° C, 5% de CO2, ambiente umidificado) em condrócitos Basal Medium (CBM) com crescimento de suplementos. Nota: A preparação do meio é descrita nas instruções dos fabricantes (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Induzir a diferenciação celular, no dia 2 com chondrogenic médio contendo recombinante humana transformando o fator de crescimento-b1 [TGFb1] (10 ng/mL), ácido L-ascórbico 2-fosfato [AA2P] (25 µ g/mL) e dexametasona (100 nM).</li>
	<li>Manter a cultura por 4 semanas na incubadora com um ambiente umidificado a 37 ° C e 5% de CO2. Alterar chondrogenic médio todos os dias.</li>
</ol>6. toluidina azul coloração (TB)
<ol><li>Lave as culturas 3D-SAPS duas vezes, adicionando e removendo 2 mL de PBS com uma micropipeta. Corrigi-los, adicionando 2 mL de 2% (p/v) p-formaldeído em PBS por 2 h no RT</li>
	<li>Lave duas vezes com 2 mL de 0.1% Triton X-100 em PBS (PBST).</li>
	<li>Incube com 2 mL de 0.05% TB na água por 20 min no RT</li>
	<li>Lave várias vezes (pelo menos 3 vezes) com 2 mL de PBS até a solução de PBS removida é clara.</li>
	<li>Analise as amostras por inspeção visual, sob um microscópio estereoscópico11,13,14. Nota: TB forma complexos com aniônicos glicoconjugados na matriz extracelular, como (PG) de proteoglicanos e glicosaminoglicanos (GAG), que principalmente são secretadas por células condrócitos. Amostras positivas são manchadas de azuis.</li>
</ol>7. Western Blot
Nota: O procedimento utilizado no presente protocolo foi descrito anteriormente na referência11.
<ol><li>Lyse 3D-construções em RIPA tampão contendo inibidor da protease cocktail pipetando.</li>
	<li>Prepare o gel do acrilamido de acordo com exigências de gel de volume (do equipamento funcionando gel específico) e executar os lisados celulares para 90 min em 150 V16. Nota: O gel do acrilamido é usualmente preparado em uma concentração de 7,5 a 10% (p/v), dependendo do peso molecular da proteína.</li>
	<li>Transferir as proteínas contidas no gel para uma membrana (PVDF) de difluoreto de polivinilideno aplicando 40 V para h 2 a RT</li>
	<li>Incube a membrana PVDF no RT para 2h em tampão de bloqueio (4% (p/v) de leite em pó desnatado em PBST) em um recipiente separado com volume suficiente para cobrir a membrana.</li>
	<li>Incube membrana no RT para 1 h com anticorpos primários em uma concentração final de 1 mg/mL em PBST. Consulte tabela de materiais.</li>
	<li>Acrescente os anticorpos secundários em uma concentração de 1 mg/mL. Consulte a tabela de materiais.</li>
	<li>Prepare a membrana para detecção de hP com um substrato quimioluminescente16. Consulte tabela de materiais.</li>
	<li>Tire fotos quimioluminescente16.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aggeli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsive+gels+formed+by+the+spontaneous+self-assembly+of+peptide+into+polymeric+&#946;-sheet+tapes.">Responsive gels formed by the spontaneous self-assembly of peptide into polymeric &#946;-sheet tapes.</a> Nature. 386, 259-262 (1997).</li><li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+we+build+artificial+stem+cell+compartments?.">Can we build artificial stem cell compartments?.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 3, 164-169 (2003).</li><li>Kisiday, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+peptide+hydrogel+fosters+chondrocyte+extracellular+matrix+production+and+cell+division:+implications+for+cartilage+tissue+repair.">Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 9996-10001 (2002).</li><li>Narmoneva, D. A., Vukmirovic, R., Davis, M. E., Kamm, R. D., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+promote+cardiac+myocyte+survival+and+spatial+reorganization:+implications+for+cardiac+regeneration.">Endothelial cells promote cardiac myocyte survival and spatial reorganization: implications for cardiac regeneration.</a> Circulation. 110, 962-968 (2004).</li><li>Genov&#233;, E., Shen, C., Zhang, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+functionalized+self-assembling+peptide+scaffolds+on+human+aortic+endothelial+cell+function.">The effect of functionalized self-assembling peptide scaffolds on human aortic endothelial cell function.</a> Biomaterials. 26, 3341-3351 (2005).</li><li>Garreta, E., Genov&#233;, E., Borr&#243;s, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+and+mouse+embryonic+fibroblasts+in+a+three-dimensional+self-assembling+peptide+scaffold.">Osteogenic differentiation of mouse embryonic stem cells and mouse embryonic fibroblasts in a three-dimensional self-assembling peptide scaffold.</a> Tissue Engineering. 12, 2215-2228 (2006).</li><li>Sieminski, A. L., Semino, C. E., Gong, H., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+sequence+of+ionic+self-assembling+peptide+gels+affects+endothelial+cell+adhesion+and+capillary+morphogenesis.">Primary sequence of ionic self-assembling peptide gels affects endothelial cell adhesion and capillary morphogenesis.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87 (2), 494-504 (2008).</li><li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+peptides:+from+bio-inspired+materials+to+bone+regeneration.">Self-assembling peptides: from bio-inspired materials to bone regeneration.</a> Journal of Dental Research. 87 (2008), 606-616 (2008).</li><li>Hern&#225;ndez Vera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+fluid+flow+intensity+modulates+endothelial+sprouting+in+restricted+Src-activated+cell+clusters+during+capillary+morphogenesis.">Interstitial fluid flow intensity modulates endothelial sprouting in restricted Src-activated cell clusters during capillary morphogenesis.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (1), 175-185 (2009).</li><li>Castells-Sala, C., Mart&#237;nez-Ramos, C., Vall&#233;s-Lluch, A., Monle&#243;n Pradas, M., Semino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+bioimplants+made+up+of+elastomeric+scaffolds+with+peptide+gel+filling+seeded+with+human+subcutaneous+adipose+tissue-derived+progenitor+cells.">In vitro development of bioimplants made up of elastomeric scaffolds with peptide gel filling seeded with human subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (11), 3419-3430 (2015).</li><li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-based+self-assembling+peptide+scaffold+reestablish+chondrogenic+phenotype+of+expanded+de-differentiated+human+chondrocytes.">Heparin-based self-assembling peptide scaffold reestablish chondrogenic phenotype of expanded de-differentiated human chondrocytes.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (7), 1694-1706 (2016).</li><li>Bussmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+potential+of+human+dermal+fibroblasts+in+a+contractile,+soft,+self-assembling,+peptide+hydrogel.">Chondrogenic potential of human dermal fibroblasts in a contractile, soft, self-assembling, peptide hydrogel.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10 (2), E54-E62 (2016).</li><li>Recha-Sancho, L., Moutos, F. T., Abell&#224;, J., Guilak, F., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiated+Human+Articular+Chondrocytes+Redifferentiate+to+a+Cartilage-Like+Tissue+Phenotype+in+a+Poly+(&#949;-Caprolactone)/Self-Assembling+Peptide+Composite+Scaffold.">Dedifferentiated Human Articular Chondrocytes Redifferentiate to a Cartilage-Like Tissue Phenotype in a Poly (&#949;-Caprolactone)/Self-Assembling Peptide Composite Scaffold.</a> Materials. 9 (6), 472 (2016).</li><li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+Sulfate+and+Decorin+based+self-assembling+scaffolds+for+cartilage+tissue+engineering.">Chondroitin Sulfate and Decorin based self-assembling scaffolds for cartilage tissue engineering.</a> PlosOne. 11 (6), e0157603 (2016).</li><li>Aloy-Revert&#233;, C., Moreno-Amador, J. L., Nacher, M., Montanya, E., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RGD-Functionalized+Sandwich+Cultures+to+Promote+Redifferentiation+of+Human+Pancreatic+Beta+Cells+After+In+Vitro+Expansion.">Use of RGD-Functionalized Sandwich Cultures to Promote Redifferentiation of Human Pancreatic Beta Cells After In Vitro Expansion.</a> Tissue Engineering Part A. , (2017).</li><li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+blotting+and+detection.">Protein blotting and detection.</a> Methods in Molecular Biology. 536, (2009).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Anteriormente, o nosso grupo e outros descreveram o uso de plataformas tridimensionais (3D) cultura com célula diversos sistemas3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15. No presente trabalho, descrevemos um método fácil e confiável de se obter cultura 3D sistemas que são aplicáveis a qualquer tipo de células de mamíferos incluindo qualquer tipo de célula funcional, embrionário ou adulto células-tronco, ou eventualmente, disfuncionais células isolaram de biópsias ou tumores e assim por diante. Além disso, independentemente, se as células estaminais são de origem embrionária ou adulta têm uma melhor capacidade de compromisso linhagem no ambiente 3D do que na cultura 2D clássica pratos10,11,12, 13,14,15. Portanto, a cultura de pilha neste sistema conduziria à diferenciação em estruturas de tecido-como funcionais que podem ser utilizadas em aplicações diferentes, de Biomedicina reparativa ou regenerativa para plataformas toxicológicas e farmacológicas.
Mostramos um claro ganho em função da célula porque o microambiente celular é semelhante dos tecidos naturais em termos de estrutura matricial e parâmetros biomecânicos, biofísicos e biológicos. No entanto, como o sistema se torna mais complexo, o número de parâmetros que precisam ser regulamentados também aumenta, que inclui a necessidade de uma plataforma de apoio externa (por exemplo, um sistema de perfusão ativo para evitar problemas de associada a fenómenos de transferência de massa ). Tridimensionalmente culturas de células de melhor desempenho em termos de regulação de atividades essenciais, tais como a migração, proliferação e diferenciação. Eles podem formar redes complexas, permitindo a interferência celular reforçada, que é, de longe, uma consequência essencial do crescimento e diferenciação em 3D. O facto de sucos poderia criar condições em vitro semelhante a essas proteínas de matriz extracelular representa uma vantagem desde um estudo racional do efeito produzida por cada componente adicionado para o cadafalso (fator de crescimento, polissacarídeo ou sinalização peptídeo) poderia ser facilmente realizado.
As claras vantagens do uso de sucos em comparação com outros andaimes naturais, tais como colágeno tipo I e o Matrigel, são os seguintes: 1) SAPS é um biomaterial sintético com variação mínima do lote de produção de lotes; 2) sucos tem a capacidade de ser acrescida com motivos de peptídeo específico; e 3) presentes sucos de baixa biodegradabilidade em vitro, que permita a manutenção da construção 3D com as mesmas propriedades biofísicas, biomecânicas e estruturais ao longo do tempo. No entanto, a limitação do uso de sucos contra outros andaimes é encontrado durante a etapa de encapsulamento, onde as células estão em um ambiente hostil devido ao baixo pH. Portanto, este é um passo crítico na metodologia descrita. Além disso, é importante definir a concentração de sucos para cada tipo de célula específica antes de iniciar qualquer experimento. Isto é, de facto, essencial quando as células são cultivadas sobre ou para dentro esses biomateriais, desde que cada tipo de célula específica apresentará condições de crescimento biomecânica ideal.
Finalmente, acreditamos que o projeto e a fabricação deste tipo de andaime biomaterial aumentaria o desenvolvimento de modelos de tecido 3D mais fisiológica e de confiança para ajudar a indústria farmacêutica para desenvolver melhor as abordagens terapêuticas para medicina regenerativa, câncer ou qualquer tratamento médico.

Por muitas décadas, cultura de células de mamíferos foi realizada sob condições experimentais usando sistemas clássica bidimensional (2D) cultura devido a problemas de práticos e econômicos, independentemente dos aspectos não-fisiológica. Embora este sistema de cultura ajuda a estudar e entender mais os mecanismos moleculares e celulares, hoje sabemos que novos paradigmas de cultura de células são necessárias para estudar sistemas celulares mais complexos. Portanto, sistemas tridimensionais (3D) cultura são necessários para recriar um microambiente que é base, biomecanicamente e biologicamente mais semelhante dos tecidos naturais. Nos últimos anos, sistemas de cultura 3D, em geral, tornaram-se mais prevalentes entre pesquisadores e indústria desde que eles representam um novo modelo de estudo ou de triagem em que as células podem crescer no espaço, criar célula a célula ou interacções célula-a-matriz, migrar e eventualmente se diferencie em linhagens de células específicas.
O objetivo geral desta metodologia é recriar um em vitro microambiente celular que está mais perto do microambiente no vivo . Em particular, o andaime de peptídeo de auto-montagem sintético (SAPS) é um tipo de biomaterial com propriedades únicas; forma uma rede de poros nanômetros de tamanho feito de interações fracas entre peptídeos com propriedades mecânicas e estruturais semelhantes as de matrizes extracelulares naturais. Em outras palavras, a racionalidade por trás o uso deste material é que ele cria um verdadeiramente 3D-ambiente que é ideal para a obtenção de tecidos de pseudo-3D ou unidades do órgão. No entanto, mais importante ainda, o contexto 3D permite que a estrutura 3D ganhar novas funções biológicas que normalmente não estão presentes em plataformas 2D de cultura, tais como propriedades relacionadas à arquitetura do tecido, fenômenos de transferência de massa, a padronização de células e, eventualmente, morfogênese de tecido, que são fatores-chave em futuras pesquisas e desenvolvimento de tecidos funcionais e órgãos1,2. Além disso, uma vantagem de sucos sobre os seus homólogos naturais (colágeno, Matrigel) é que eles são muito estáveis à temperatura ambiente e não necessitam de condições especiais para a pós-produção, distribuição ou armazenamento3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. sucos é fácil de manusear, quando desejado; Géis 3D podem ser obtidos simplesmente pelo aumento da força iônica ou ajustando o pH a neutralidade1,2. Finalmente, a metodologia descrita aqui tem sido extensivamente usado em vitro para promover a manutenção, crescimento e diferenciação de vários tipos de células, incluindo condrócitos, hepatócitos, células endoteliais, osteoblastos, células neuronais também como as células-tronco embrionárias e somática3,4,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. no presente trabalho, descrevemos a utilização de um sistema 3D-cultura para diferenciar condrócitos articulares expandidos humanos (HAC) em tecido de cartilagem-como, como descrito anteriormente,11.
Aqui, um método para células de cultura em um sistema 3D usando sucos é descrito. Neste biomaterial sintético, células primeiro são misturadas com uma solução de peptídeo, que posteriormente é induzida a auto-montagem, criando uma rede de dimensões nanométricas ao redor das células e, portanto, criar um ambiente verdadeiramente 3D (Figura 1). É importante considerar que o comportamento celular é afetado pelos valores de rigidez de matriz (ou seja, proliferação, migração e diferenciação). Portanto, um controle metodológico comum é células de cultura em cima do andaime de peptídeo com os mesmos valores de rigidez (cultura em duas dimensões).

<table><tbody><tr><td>Human articular chondrocytes (Ach)</td><td>Lonza</td><td>CC-2550</td><td></td></tr><tr><td>RAD16-I peptide solution (PuraMatrix)</td><td>Corning</td><td>354250</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose (tissue culture grade)</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture inserts (0.4 &amp;micro;m pore, 12 mm diameter)</td><td>Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Chondrocyte Basal Medium (CBM)</td><td>Lonza</td><td>CC-3217</td><td></td></tr><tr><td>SingleQuots of Growth Supplements</td><td>Lonza</td><td>CC-4409</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma</td><td>D8893</td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P)</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Human transforming growth factor-&amp;beta;1 (TGF-&amp;beta;1)</td><td>Millipore</td><td>GF111</td><td></td></tr><tr><td>RIPA buffer</td><td>Sigma</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td><td>Invitrogen</td><td>LC 2005</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Actin</td><td>SCBT</td><td>sc-1615</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Collagen I</td><td>Abcam</td><td>ab138492</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Collagen II</td><td>Abcam</td><td>ab3092</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Collagen X</td><td>Abcam</td><td>ab182563</td><td></td></tr><tr><td>Antigoat IgG-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab97100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab97023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab97051</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing mammalian cells in three-dimensional peptide scaffolds

Uma técnica útil para o cultivo de células em um auto-montagem andaime nanofibras tridimensional (3D) é descrita. Este sistema de cultura recria um ambiente que imita pròxima as características estruturais do tecido não-polarizado. Além disso, a estrutura particular de nanofibras intrínseca do cadafalso torna transparente à luz visual, que permite a fácil visualização da amostra sob microscopia. Esta vantagem foi largamente usada para estudar a migração celular, organização, proliferação e diferenciação e, portanto, qualquer desenvolvimento de sua função celular específica pela coloração com corantes específicos ou sondas. Além disso, neste trabalho, descrevemos o bom desempenho deste sistema facilmente estudar o redifferentiation de condrócitos articulares humanos expandidos no tecido cartilaginoso. As células foram encapsuladas em auto montagem de andaimes de peptídeo e cultivadas sob condições específicas para promover a condrogênese. Culturas tridimensionais mostraram boa viabilidade durante as 4 semanas do experimento. Como esperado, amostras cultivadas com indutores de chondrogenic (comparados aos controles não-induzida) manchado fortemente positivas para o azul de toluidina (que manchas de glicosaminoglicanos (GAGs) altamente presentes na matriz extracelular da cartilagem) e expressa marcadores moleculares específicos, incluindo o colágeno tipo I, II e X, de acordo com a análise de Western Blot. Este protocolo é fácil de executar e pode ser usado em laboratórios de pesquisa, indústrias e para fins educacionais em cursos de laboratório.

No presente trabalho, um protocolo simples e rápido para células de cultura em 3D usando sucos é descrito para obter dados qualitativos e quantitativos confiáveis. RPUS cria um microambiente 3D com propriedades únicas que permitem que as células cultivadas sob condições desejadas para proceder à manutenção da célula, proliferação e/ou diferenciação3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. no nosso grupo, vários estudos têm sido realizados utilizando as células progenitoras do tecido adiposo humano derivado (hAPC), condrócitos articulares humanos expandidos (HAC) e fibroblastos dérmicos normais humanos (hNDF) para a cultura, expandir em diferenciá-los em tecido de cartilagem, como10,11,12. Aqui, descrevemos a cultura 3D e re-diferenciação de hACh expandido em tecido de cartilagem-como, como descrito anteriormente,11. Daí, podemos encapsular células em 3D-SAPS e cultura-los no meio de indução de chondrogenic, conforme descrito na Figura 1 (e no protocolo). Após 24 h, as amostras foram avaliadas para viabilidade com o ensaio de citotoxicidade de viabilidade/Live/mortos. Os resultados indicam que uma pequena porcentagem de células foram morta (vermelho), após 5 dias de encapsulamento e quase sem células mortas foram observadas após 4 semanas da cultura (Figura 2). Em seguida, nós lhes manchado para deposição de glicosaminoglicano (GAG) na matriz extracelular usando a azul método de coloração de toluidina. Como esperado, o grupo de indução respondeu corretamente ao tratamento, mostrando a forte coloração (Figura 2).
Finalmente, marcadores moleculares de marcadores condrogênese e hipertrofia, incluindo colágeno tipo I, II e X, foram analisadas por western blot (Figura 3). Colágeno tipo que eu (COL1) foi observada em sistemas de 2D e 3D, mas a banda inferior de kDa ~ 130 (representando a proteínas transformadas de COL1 madura para ser montado na matriz extracelular) observou-se apenas em 3D. Este resultado indica claramente que as células em fase de diferenciação em três dimensões avançar de forma mais fisiológica. Notavelmente, colágeno tipo II (COL2) foi detectado - como uma única banda do esperado peso molecular presente na matriz extracelular - somente em construções 3D cultivadas sob condições de chondrogenic. Finalmente, colágeno tipo X (COL10) foi detectado em construções de 2D e 3D, cultivadas sob condições de chondrogenic, indicando algum grau de hipertrofia após 4 semanas da cultura.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig1v2.jpg"> Figura 1: representação esquemática de encapsulamento de células em 3D-SAPS. Representação esquemática de encapsulamento a hACh é descrita para obter células aleatoriamente dispersadas dentro do 3D-SAPS. 1. auto montagem preparação de andaime (SAPS) peptídeo; 2. célula preparação de suspensão; e 3. 3D-célula encapsulamento em sucos. Observe que o diagrama esquemático mostra apenas passos 3.1 a 3.4.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig2.jpg"> Figura 2: celular diferenciação de desempenho e chondrogenic em culturas de 3D-SAPS. Coloracao de viabilidade celular realizada em 5 dias e 4 semanas de cultura detectado sob um microscópio fluorescente (células vivas nas células e inoperante em vermelho). Escala de barras = 200 µm. compromisso geral condrogênese avaliado pelo azul de toluidina coloração (sulfatados glicosaminoglicanos em azul) de construções 3D-SAPS cultivadas em meios de controle e chondrogenic. Escala de barras = 500 µm. Esta figura foi modificada de L. Recha-Sancho et al . 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig3.jpg"> Figura 3: colágeno, expressão de hACh submetidos a condrogênese II e X. hACh cultivada em um monolayer-2D e em 3D-SAPS depois de 4 semanas em chondrogenic mídia e controles foram avaliados para a expressão do colágeno tipo I (COL1), colágeno tipo II (COL2) e colágeno tipo X (COL10). Expressão da actina foi usado como um controle interno. Esta figura foi modificada de L. Recha-Sancho et al . 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Cultivo de células de mamíferos em andaimes tridimensionais do Peptide

Aqui, apresentamos um protocolo para obter sistemas 3D-cultura na auto montagem de andaimes de peptídeo para promover a diferenciação de condrócitos articulares humanas condrossarcoma em tecido de cartilagem, como.

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K visualizações.  Ramon Llull University. Aqui, apresentamos um protocolo para obter sistemas 3D-cultura na auto montagem de andaimes de peptídeo para promover a diferenciação de condrócitos articulares humanas condrossarcoma em tecido de cartilagem, como.

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A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

Uma simples gota de suspensão Protocolo Cultura de Células para a geração de esferóides 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Bioengenharia

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

Cultivo de células progenitoras neurais em um hidrogel Peptide 3-dimensional de auto-montagem

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Andaimes auto-relato para cultura de células 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a complex three-dimensional (3D) microenvironment involving layers of cancerous and non-cancerous cells surrounded by an extracellular matrix (ECM). The ECM provides physical and biological support and contributes to disease progression, patient prognosis, and therapeutic response.
This paper describes a protocol for assembling a 3D scaffold-based system to mimic the neuroblastoma microenvironment using neuroblastoma cell lines and collagen-based scaffolds. The scaffolds are supplemented with either nanohydroxyapatite (nHA) or glycosaminoglycans (GAGs), naturally found at high concentrations in the bone and bone marrow, the most common metastatic sites of neuroblastoma. The 3D porous structure of these scaffolds allows neuroblastoma cell attachment, proliferation and migration, and the formation of cell clusters. In this 3D matrix, the cell response to therapeutics is more reflective of the in vivo situation.
The scaffold-based culture system can maintain higher cell densities than conventional two-dimensional (2D) cell culture. Therefore, optimization protocols for initial seeding cell numbers are dependent on the desired experimental timeframes. The model is monitored by assessing cell growth via DNA quantification, cell viability via metabolic assays, and cell distribution within the scaffolds via histological staining.
This model&#39;s applications include the assessment of gene and protein expression profiles as well as cytotoxicity testing using conventional drugs and miRNAs. The 3D culture system allows for the precise manipulation of cell and ECM components, creating an environment more physiologically similar to native tumor tissue. Therefore, this 3D in vitro model will advance the understanding of the disease pathogenesis and improve the correlation between results obtained in vitro, in vivo in&#160;animal models, and human subjects.

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

This paper lists the steps required to seed neuroblastoma cell lines on previously described three-dimensional collagen-based scaffolds, maintain cell growth for a predetermined timeframe, and retrieve scaffolds for several cell growth and cell behavior analyses and downstream applications, adaptable to satisfy a range of experimental aims.

Modelo Biomimético Tridimensional In Vitro de Neuroblastoma Utilizando Arcabouços à Base de Colágeno

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...

Pesquisa do câncer

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Engenharia tridimensionais tecidos epiteliais incorporado dentro Matriz Extracelular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Tridimensional Cultura alginato-talão de células humanas adenoma pituitário

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Medicina

Controlling Particle Fraction in Microporous Annealed Particle Scaffolds for 3D Cell Culture

Microgels are the building blocks of microporous annealed particle (MAP) scaffolds, which serve as a platform for both in vitro cell culture and in vivo tissue repair. In these granular scaffolds, the innate porosity generated by the void space between microgels enables cell infiltration and migration. Controlling the void fraction and particle fraction is critical for MAP scaffold design, as porosity is a bioactive cue for cells. Spherical microgels can be generated on a microfluidic device for controlled size and shape and subsequently freeze-dried using methods that prevent fracturing of the polymer network. Upon rehydration, the lyophilized microgels lead to controlled particle fractions in MAP scaffolds. The implementation of these methods for microgel lyophilization has led to reproducible studies showing the effect of particle fraction on macromolecule diffusion and cell spreading. The following protocol will cover the fabrication, lyophilization, and rehydration of microgels for controlling particle fraction in MAP scaffolds, as well as annealing the microgels through bio-orthogonal crosslinking for 3D cell culture in vitro.

Minimizing the variability in the particle fraction within granular scaffolds facilitates reproducible experimentation. This work describes methods for generating granular scaffolds with controlled particle fractions for in vitro tissue engineering applications.

Controlando a Fração de Partículas em Andaimes de Partículas Microporosas Recozidos para Cultura de Células 3D

Microgels are the building blocks of microporous annealed particle (MAP) scaffolds, which serve as a platform for both in vitro cell culture and in vivo ...

<meta charset="utf8"></head><body>Sistema avançado de co-cultura 3D de duas camadas para células epiteliais e de fibroblastos

Establishing a Three-Dimensional Coculture Module of Epithelial Cells Using Nanofibrous Membranes

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods can enhance cell culture efficiency. This study introduces an advanced two-layered culture system intended to cultivate epithelial cells as tissue-like layers with the culture of fibroblasts within a 3D environment. Polyvinyl alcohol (PVA) and poly(&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibrous membranes (NMs) were fabricated via electrospinning and utilized as a physiologically relevant extracellular matrix for the culture of epithelial cells and fibroblasts, respectively. In the upper insert wells, lung epithelial cells were cultivated on the PVA NM, and in the lower chambers, fibroblasts were cultured on the PCL NM. This configuration eliminates direct cell-cell contact and facilitates the examination of paracrine signaling mediated by soluble factors. Confocal microscopy was employed to analyze the distribution, growth pattern, and expression of intracellular proteins, including zona occludens in epithelial cells. Z-stacking techniques enabled detailed 3D reconstructions, providing precise insights into the integrity of tight junctions and spatial organization within the epithelial layer. Scanning electron microscopy (SEM) assessed the morphological characteristics of cell types on the nanofibrous membranes. SEM imaging revealed intricate cell surface structures and interactions with the nanofibers, offering a comprehensive perspective on cellular architecture and cell interaction with nanofibrous structure. The Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay is a simple method for measuring epithelial cell and fibroblast growth rates over time. It provides the proliferative behaviors and potential synergistic effects of coculturing these cells. These findings highlight the effectiveness of a simple insert co-culture system for simultaneous culture of fibroblasts and epithelial cells, which is crucial in various physiological and pharmacological contexts, including epithelial tissue regeneration, tumor microenvironment with endothelial, immune, and other stroma cells, toxicity assay, and drug activity test.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Avançando em sistemas de cocultura 3D com membranas nanofibrosas PVA-PCL

Here, we demonstrate how epithelial cells cultured with fibroblasts in the nanofibrous membrane-based two-layer system can stably adhere to and grow on the membrane.

Estabelecimento de um módulo de cocultura tridimensional de células epiteliais usando membranas nanofibrosas

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods ...

Cultivo de células de mamíferos em andaimes tridimensionais do Peptide

Resumo

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Uma simples gota de suspensão Protocolo Cultura de Células para a geração de esferóides 3D

Cultivo de células progenitoras neurais em um hidrogel Peptide 3-dimensional de auto-montagem

Andaimes auto-relato para cultura de células 3-Dimensional

Modelo Biomimético Tridimensional In Vitro de Neuroblastoma Utilizando Arcabouços à Base de Colágeno

Engenharia tridimensionais tecidos epiteliais incorporado dentro Matriz Extracelular

Tridimensional Cultura alginato-talão de células humanas adenoma pituitário

Controlando a Fração de Partículas em Andaimes de Partículas Microporosas Recozidos para Cultura de Células 3D

Estabelecimento de um módulo de cocultura tridimensional de células epiteliais usando membranas nanofibrosas

Estabelecimento de um módulo de cocultura tridimensional de células epiteliais usando membranas nanofibrosas

Estabelecimento de um módulo de cocultura tridimensional de células epiteliais usando membranas nanofibrosas