Name: bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens: techniques for identification and quantification
Uploaded: 2018-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
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Agradecemos a Rachael B. Chanin e Alejandro Llanos-cocho para assistência técnica. Agradecemos a Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski e Bobby Cherayil para as estirpes utilizadas neste estudo. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de alergia e K22AI104755 de Grant de doenças infecciosas (serologia). O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.

1. preparação dos reagentes
<ol><li>Médio de sais biliares: para preparar o caldo tryptic soja (TSB) contendo 0,4% (peso/volume) de sais biliares, resuspenda 200 mg de sais biliares em 50ml TSB autoclavado. Filtro de esterilizar usando um filtro de 0,22 µm. Fazer meio fresco semanalmente. Notas: Os sais biliares rotineiramente utilizados é uma mistura 1:1 de colato de sódio e sódio Deoxycholate do isolado de vesículas de ovinos e bovinas. Como demonstrado anteriormente4, a presença de glicose foi necessária para a formação de biofilme induzida por sais biliares. TSB tem adicionado glicose em relação ao caldo de Luria-Bertani (LB); e, por conseguinte, foi suficiente para induzir a formação de biofilme em Shigella e outros patógenos entéricos analisados. Dependendo as bactérias a serem analisados, podem ser necessária a concentrações diferentes de glicose ou açúcar diferentes exigências.</li>
	<li>0,5 violeta de cristal % p/v em água: dissolver 2,5 g de cristal violeta em 500 mL de água destilada. Filtro de esterilizar usando um filtro de 0,22 µm.</li>
	<li>Concanavalina A (ConA) conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC): reconstituir o estoque em 1X PBS. Diluir o estoque de 10 mg de concentrado com 400 μL de 1X PBS a uma concentração final de 25 µ g/mL e proteger da luz.</li>
	<li>PBS + glicose: Dissolver glicose 0,2 g em 10 mL 1X PBS (glicose 2% w/v final). Filtro de esterilizar usando um filtro de 0,22 µm. Certifique-se fresco no dia do uso.</li>
	<li>PBS + sais biliares: Dissolver 40 mg em 10 mL 1X PBS (0,4% w/v de sais biliares finais). Filtro de esterilizar usando um filtro de 0,22 µm. Certifique-se fresco no dia do uso.</li>
	<li>PBS + glicose e sais biliares: dissolver 40 mg de sais biliares e glicose 0,2 g em 10 mL 1X PBS (0,4% w/v de sais biliares e 2% p/v glucose final). Filtro de esterilizar usando um filtro de 0,22 µm. Certifique-se fresco no dia do uso.</li>
	<li>Prepare-se placas de ágar LB.</li>
	<li>Correção de formaldeído/glutaraldeído: 810 adicione formaldeído de µ l (solução-mãe de 37%, 3% de concentração final) e 125 µ l o glutaraldeído (solução estoque de 25%, 0,25% de concentração final) para 14 mL 1X PBS. Misture bem e armazenar a 4 ° C. A correção deve ser fria para o uso adequado. Atenção: A correção é tóxica e requer a eliminação de resíduos perigosos.</li>
	<li>Solução para montagem antidesgaste: usar antidesgaste para montagem solução contendo 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) mancha para inibir fotobranqueamento de amostras de microscopia de imunofluorescência, enquanto o ADN das bactérias de coloração fluorescente.</li>
</ol>2. preparação de bactérias
<ol><li>Cresce durante a noite culturas das cepas bacterianas para ser testado por inocular 3 mL de TSB com uma colônia única, bem isolada em um tubo estéril de cultura. Incube a 37 ° C com agitação a 225 rpm para incubação overnight (16-24 h). Nota: Cepas devem ser restreaked dos estoques de congelador cada 2 a 4 semanas e mantida em placas não mais de 2 semanas de idade.</li>
</ol>3. fase sólida aderência ensaio
Nota: Este teste quantifica bactérias aderentes, usando um método de placa de 96 poços. As bactérias são crescidas estaticamente em placas de fundo plano. Lavar roupa é realizada para remover as bactérias não-aderentes e aderentes bactérias são coradas com violeta de cristal. A mancha de violeta cristal vincula peptidoglicano na parede celular bacteriana e pode ser solubilizada usando etanol. O número de bactérias aderentes é determinado com base na retenção de violeta cristal.
<ol><li>Configure dois tubos de 1,5 mL. Etiqueta com TSB ou TSB + sais biliares (BS).</li>
	<li>Adicione 1 mL de TSB ou TSB + BS para os respectivos tubos.</li>
	<li>Inocular tubos com 20 µ l de cultura durante a noite (em um 01:50 diluição).</li>
	<li>Em uma placa de 96 poços estéril, clara, fundo chato, cultura de tecidos tratados, adicione 130 µ l/poço de mídia não inoculado controle três poços para servir como o controle em branco. Configure três poços de controle para cada tipo de mídia (TSB e TSB + BS) para ser testado.</li>
	<li>Adicionar 130 µ l/poço de cultura inoculado em três poços e repita até que todas as condições experimentais são banhadas em triplicado.</li>
	<li>Incube durante 4-24 h a 37 ° C estaticamente.</li>
	<li>Usando um leitor de placas, registo o OD600. Definir os poços de controle como 'em branco'. Confirme que o meio de controle é claro sem evidência de turbidez. Se for detectada qualquer turbidez, descarte o experimento. Os valores de600 OD podem ser usados para normalizar os dados se existem diferenças significativas na taxa de crescimento entre estirpes de bactérias.</li>
	<li>Remova o meio de cultura usando uma linha de vácuo, inclinar suavemente a placa e lentamente por aspiração do meio na borda inferior do poço. Não se esqueça de coletar todos os meio de cultura sem interromper a população bacteriana aderente localizada na superfície de plástico. Se a matriz EPS foi produzido durante o tempo de incubação, a matriz será ser visualizada como um precipitado branco. Não perturbe a matriz EPS.</li>
	<li>Delicadamente lave os poços uma vez com 200 µ l de PBS estéril. Remova a lavagem PBS usando a linha de vácuo.</li>
	<li>Inverta a placa para secar. Permita um mínimo de 20 min para secar. Nota: Uma vez que o biofilme deve ser secado completamente antes de coloração, o protocolo pode ser pausado neste passo por algumas horas ou até mesmo durante a noite. O tempo de secagem adicionado não irá alterar o procedimento de coloração enquanto Secagem incompleta afetarão a quantificação dos resultados e reprodutibilidade.</li>
	<li>Adicione 150 µ l de violeta de cristal de 0,5% para cada experimental e controle bem.</li>
	<li>Incube durante 5 min à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Lave os poços uma vez com 400 µ l de água destilada. O volume adicionado ajuda a remover a mancha violeta de cristal residual dos lados dos poços. Remova a lavagem com a linha de vácuo.</li>
	<li>Lave os poços cinco vezes com 200 µ l de água destilada. Remova a lavagem com a linha de vácuo. Nota: A lavagem completa é importante para a quantificação. Quando os poços em branco são clara da água destilada e não contêm qualquer mancha residual violeta de cristal, prossiga para a próxima etapa.</li>
	<li>Inverta a placa para seco, protegido da luz. Certifique-se de secagem completa da placa conforme mencionado acima.</li>
	<li>Destain os poços com 200 µ l de etanol a 95%. Incube a placa no agitador por 30 min. Para evitar a evaporação, particularmente em umas mais altas temperaturas, execute esta etapa a 4 ° C.</li>
	<li>Usando um leitor de placas, registo o OD540. Nota: O comprimento de onda de absorbância máxima de violeta cristal está perto de 590 nm. A literatura relata uma faixa de OD540 - OD5954,13,14,15,16 de absorvância de cristal violeta; assim, escolha um comprimento de onda disponível com base no leitor.</li>
</ol>4. deteção de Matrix EPS
Nota: Estes ensaios complementares quantificar e visualizar o EPS. Em ambos, EPS é detectada usando uma lectina vincular polissacarídeos. A proteína fluorescente conjugado permite a quantificação (passo 4.1) ou visualização (etapa 4.2).
<ol><li>Detecção semi-quantitativa de EPS<ol>
<li>Configure dois tubos de 1,5 mL. Etiqueta com TSB ou TSB + BS.</li>
		<li>Adicione 1 mL de TSB ou TSB + BS para os respectivos tubos.</li>
		<li>Inocular tubos com 20 µ l de cultura durante a noite (um 01:50 diluição).</li>
		<li>Em uma placa de 96 poços estéril, preta, fundo chato, cultura de tecidos tratados, adicione 130 µ l/poço de mídia não inoculado controle três poços para servir como o controle em branco. Configure três poços de controle para cada tipo de meio a ser testado. Adicionar 130 µ l/poço de cultura inoculado nos poços e repita até que todas as condições experimentais são banhadas em triplicado.</li>
		<li>Incube durante 4-24 h a 37 ° C estaticamente.</li>
		<li>Transfira o meio de cultura para uma placa de 96 poços claros com uma pipeta, idealmente uma pipeta multicanal. Seja cauteloso para coletar todo o meio de cultura sem interromper a população aderente e/ou o EPS localizado na superfície de plástico. Posta de lado.</li>
		<li>Fixe a placa preta para 15 min RT usando 200 µ l/poço do formaldeído/glutaraldeído em 1X PBS.</li>
		<li>Enquanto a população aderente é fixação, avalie a fração sobrenadante da etapa 4.1.6. Usando um leitor de placas, registo o OD600. Definir os poços de controle como 'em branco'. Confirme que o meio de controle é claro sem evidência de turbidez. Se for detectada qualquer turbidez, descarte o experimento.<ol>
<li>Alternativamente, o ensaio inteiro pode ser executado em um prato fundo preto transparente. Nessas circunstâncias, os valores de600 OD podem ser gravados e o meio de cultura pode ser posteriormente descartado antes de prosseguir para a etapa 4.1.7. Os valores de600 OD podem ser usados para normalizar os dados no caso, existem diferenças significativas na taxa de crescimento entre estirpes de bactérias.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Remover a correção e eliminação de resíduos perigosos.</li>
		<li>Delicadamente lave os poços duas vezes com 200 µ l/poço de PBS estéril. Remova a lavagem PBS usando a linha de vácuo por inclinar suavemente a placa e aspirando lentamente a lavagem na borda inferior do poço.</li>
		<li>Adicionar 150 µ l/poço de 25 µ g/mL ConA-FITC e incube por 15 min no RT</li>
		<li>Delicadamente, lave duas vezes com 200 µ l de PBS.</li>
		<li>Adicione 150 µ l de PBS a cada poço. Gravar a fluorescência em 488 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Visualização de microscopia confocal da produção de EPS e cálculo da espessura do biofilme<ol>
<li>Configure dois tubos de 1,5 mL. Etiqueta com TSB ou TSB + BS.</li>
		<li>Adicione 1 mL de TSB ou TSB + BS para os respectivos tubos.</li>
		<li>Inocular tubos com 20 µ l de cultura durante a noite (em um 01:50 diluição).</li>
		<li>Configure uma placa de 24 estéril com 12 mm estéril ronda as lamelas de vidro. Adicione 400 µ l/poço de mídia não inoculado controle três poços para servir como o controle em branco. Configure três poços de controle para cada tipo de meio a ser testado.</li>
		<li>Adicionar 400 µ l de cultura inoculada poços em duplicado e repita até que todas as condições experimentais são banhadas.</li>
		<li>Incube durante 4-24 h a 37 ° C estaticamente.</li>
		<li>Confirme visualmente crescimento na condição TSB, crescimento e precipitado EPS (branco) no TSB + condição de BS e não há crescimento e/ou precipitado branco em poços de controle estéril. Remova os sobrenadantes.</li>
		<li>Correção para 15 min em RT usando 200 µ l/poço de solução de formaldeído/glutaraldeído em 1X PBS.</li>
		<li>Remova a correção e descarte de resíduos perigosos.</li>
		<li>Delicadamente lave os poços duas vezes com 200 µ l/poço de PBS estéril. Remova a lavagem PBS usando a linha de vácuo.</li>
		<li>Adicionar 150 µ l/poço de 25 µ g/mL ConA-FITC e incube por 15 min no RT</li>
		<li>Delicadamente, lave duas vezes com 200 µ l/poço de PBS.</li>
		<li>Montar com solução de antidesgaste para montagem com DAPI. Nota: A solução é uma solução de montagem de ready-made, com base em glicerol contendo DAPI para preservar a etiqueta fluorescente enquanto simultaneamente a coloração do DNA em células bacterianas para visualização como um corante de contraste. Siga as direções e recomendações do kit para tempos de incubação antes da imagem latente de amostras. O DAPI mancham o procedimento pode ser realizado antes da aplicação de solução de antidesgaste para montagem que não contenha DAPI.</li>
		<li>Avalie pela microscopia confocal. Em um microscópio confocal, defina o laser para 495 nm/519 nm excitação/emissão para visualização FITC. Como um segundo laser 360 nm/460 nm excitação/emissão de Visualizar DAPI. Localize o biofilme, centrando-se no canal DAPI. Usar canais da DAPI e FITC para determinar a espessura total e definir a parte superior e inferior da imagem latente as fronteiras. Grave imagens de toda a sua espessura Z-pilha capturando imagens cada 0,25 µm após definir perímetros para a parte superior e inferior da pilha-z. Para obter mais informações sobre microscopia confocal, consulte publicações pelo Paddock et al 17 , 18 , 19 , 20
</li>
		<li>Reconstrua as imagens 3D no ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) para visualizar a formação de biofilme completo e calcular a espessura do biofilme. A espessura média obtida para S. flexneri sais biliares induzidos biofilmes foi 14 µm4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. ensaio de dispersão
Nota: Neste ensaio, a desmontagem do biofilme através de dispersão bacteriana é detectada. Aqui, biofilmes maduros são estabelecidos e posteriormente (normalmente no dia seguinte), os meios de comunicação são substituídos com PBS ou completadas PBS. O componente sobrenadante é então avaliado para quantificar o número de bactérias que podem ter dissociada do biofilme.
<ol><li>Configure dois tubos de 1,5 mL. Etiqueta com TSB ou TSB + BS.</li>
	<li>Adicione 1 mL de TSB ou TSB + BS para os respectivos tubos.</li>
	<li>Inocular tubos com 20 µ l de cultura durante a noite (em um 01:50 diluição).</li>
	<li>Em uma placa de 96 poços estéril, clara, fundo chato, cultura de tecidos tratados, adicione 130 µ l/poço de mídia não inoculado controle três poços para servir como o controle em branco. Configure três poços de controle para cada tipo de mídia a ser testado.</li>
	<li>Adicionar 130 µ l/poço de cultura inoculado três poços e repita até que todas as condições experimentais são banhadas em triplicado.</li>
	<li>Incube a placa para 4-24 h a 37 ° C estaticamente.</li>
	<li>Antes de continuar, aquecer a PBS, PBS glicose, PBS + sais biliares e PBS + sais biliares + glicose a 37 ° C. Prepare estas diariamente frescos de reagentes.</li>
	<li>Usando um leitor de placas, registo o OD600. Definir os poços de controle como 'em branco'. Confirme que o meio é claro sem evidência de turbidez. Se for detectada qualquer turbidez, descarte o experimento. Os valores de600 OD podem ser usados para normalizar os dados se existem diferenças significativas na taxa de crescimento entre estirpes de bactérias.</li>
	<li>Remova o meio de cultura usando uma linha de vácuo. Não se esqueça de coletar todos os meio de cultura sem interromper a população aderente localizada na superfície de plástico.</li>
	<li>Delicadamente lave os poços duas vezes com 200 µ l/poço de PBS estéril. Remova a lavagem PBS usando a linha de vácuo.</li>
	<li>Substituir a lavagem com 130 µ l/poço das seguintes três poços cada: PBS, PBS glicose, PBS + sais biliares e PBS + sais biliares + glicose. Estes reagentes devem ser pré-aquecido a 37 ° C.</li>
	<li>Incubar a placa por 30 min a 37 ° C.</li>
	<li>Retire cuidadosamente a placa de incubadora a 37 ° C. Transferi os sobrenadantes para uma placa de 96 poços fresca, estéril.</li>
	<li>Usando um bloco de 96 poços placa ou diluição, preparar o 10-fold (01:10) diluições em série do líquido sobrenadante em PBS estéril. Nota: A série de diluição deve variar de não diluída a 10-6 , dependendo da estirpe bacteriana a ser testado. Experiências piloto podem ser realizadas para determinar o intervalo ideal de diluição.</li>
	<li>Detectar a placa de 5 µ l de cada diluição em ágar LB usando uma pipeta multicanal. Incube a 37 ° C durante a noite. Contagem das colónias no próximo dia e conta para o factor de diluição, ao determinar a recuperação unidades formadoras (CFU). Para calcular a dispersão por cento em relação a 1 x controle de PBS (fixado em 100%), divida a recuperação CFU de cada condição de tratamento da recuperação CFU das amostras de controlo de PBS 1x. Nota: As placas de mídia de rotina para a estirpe bacteriana de interesse também podem ser usadas. Por exemplo, Shigella pode ser revestido em placas de vermelho Congo. Certifique-se que as placas estão secas por técnicas adequadas de ponto-chapeamento.</li>
</ol>

Os autores têm sem divulgações.

Análise da formação de biofilme é um desafio devido a natureza dinâmica dos biofilmes e a variabilidade entre as cepas, materiais, laboratórios e ensaios. Aqui, apresentam-se várias estratégias para determinar a formação de biofilme em patógenos entéricos, após exposição de sais biliares, com uma visão experimental fornecida para promover a reprodutibilidade. Existem considerações adicionais para garantir a reprodutibilidade. Primeiro e acima de tudo, recomendamos executar independente de pelo menos tr?...

Formação de biofilme é uma estratégia de sobrevivência bacteriana importante induzida durante condições ambientais adversas. Exposição aos compostos bactericidas como antibióticos ou alterações nos nutrientes ou disponibilidade de oxigênio induz um estado estressado em bactérias que podem ser aliviados através da formação de biofilme. Um biofilme é caracterizado pela fixação bacteriana de uma superfície ou outras bactérias e é acompanhado pela secreção de uma matriz EPS, composto principalmente de polissacarídeos1,2,3. Formação de biofilme é um processo dinâmico, no qual uma cascata de eventos culmina na formação de uma comunidade bacteriana aderente maduro1,2,3. As bactérias produzem adesinas para facilitar a fixação cedo enquanto deslocamento adesina perfis de expressão de gene para fortalecer o acessório durante a maturação do biofilme. Simultaneamente, a produção de EPS ocorre ao brasão da comunidade bacteriana em uma matriz para proteger as células contra o estressor inicial. Contido dentro do biofilme de bactérias são de crescimento lento; e como tal, a maioria dos antibióticos processa ineficaz. Além disso, o crescimento lento economiza energia até que as condições mudam para favorecer o crescimento bacteriano1,2,3. Depois de tem passado as duras condições, bactérias dispersarem o biofilme e retomar um lifestyle planctônicos1,2,3. Tradicionalmente, os biofilmes são observados em superfícies e representam um desafio clínico persistente devido a reservatórios de infecção presentes em cateteres e dispositivos de em-moradia a1,2,3.
Formação de biofilme foi recentemente descrita por vários patógenos entéricos; bactérias que infectam o intestino delgado ou cólon4. Para espécies de Shigella , , a infecção ocorre no cólon humano após um trânsito através da maioria do tracto gastrointestinal. Durante a passagem através do intestino, Shigella é exposto a bílis; um detergente degradante de lipídios secretado no intestino para facilitar a digestão de lipídios enquanto simultaneamente mata a maioria das bactérias5. Patógenos entéricos têm uma capacidade única de resistir os efeitos bactericidos da bile6. Nossa análise recente utilizado na vivo-como combinações de glicose e de sais biliares para demonstrar a formação de biofilme robusto em S. flexneri , bem como outras espécies de Shigella, patogênica Escherichia colie Salmonela4. Anteriormente, a Salmonella enterica sorovar Typhi mostrou-se para formar um biofilme induzida por bile devido à colonização exclusivo da vesícula biliar durante a infecção crônica7,8,9, 10. Além disso, pesquisas anteriores com Vibrio11e Campylobacter12 demonstraram a formação de biofilme em resposta a bile. Portanto, as análises estendido as observações de formação de biofilme induzida por bile para outros patógenos e ajudam a estabelecer a demonstração de uma resposta de patógeno entérico conservada a bile. Ao contrário de biofilmes crônicas em que transcrição do gene bacteriano é limitada e senescência celular pode ocorrer1,2,3, propomos que o biofilme induzida por bile entérico é mais transitório na natureza. Este transiente, virulenta biofilme é caracteriza por uma rápida desmontagem (como visto no ensaio de dispersão) e reforçada a expressao de genes de virulência observado no biofilme população4,6. 
Como formação de biofilme é um processo dinâmico, multifacetado e o uso de sais biliares, como um fator primário só foi recentemente descrito por patógenos entéricos mais, as ferramentas e técnicas utilizadas são únicas e criativas aplicações dos métodos tradicionais. Assim, aqui apresentados são três estratégias complementares para quantificar várias características importantes da formação de biofilme induzida por sais biliares, incluindo a aderência bacteriana, produção da matriz EPS e a dispersão de bactérias viáveis desde o biofilme. Estas técnicas têm sido utilizadas principalmente para pesquisa com Shigella; e, por conseguinte, a avaliação de outros patógenos entéricos pode exigir otimização. No entanto, dados positivos de todos os três ensaios apoiar a identificação de biofilmes e estabelecer protocolos podem ser reproduzidos para a formação de biofilme induzida por sais biliares.

<table><tbody><tr><td>Tryptic Soy Broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22092-500G</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma</td><td>C6158-50</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin-A FITC</td><td>Sigma</td><td>C7642-10mg</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Bile Salts</td><td>Sigma</td><td>B8756-100G</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Sigma</td><td>L7533-1KG</td><td></td></tr><tr><td>14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile</td><td>Fisher</td><td>14-959-11B</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield hard-set antifade with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635-500</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>Flat-bottomed 96-well plates (clear)</td><td>TPP</td><td>92696</td><td></td></tr><tr><td>Flat-bottomed 96-well plates (black)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655076</td><td></td></tr><tr><td>Flat-bottomed 24-well plates (clear)</td><td>TPP</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips 12mm, round</td><td>Fisher</td><td>08-774-383</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate reader</td><td>Spectramax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flourescent plate reader</td><td>Biotek Synergy 2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal or Fluorescent Microscope</td><td>Nikon A1 confocal microscope</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;deg;C Shaking Incubator</td><td>New Brunswick Scientific Excella E25</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;deg;C Plate Incubator</td><td>Thermolyne Series 5000</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens: techniques for identification and quantification

Formação de biofilme é um processo dinâmico, vários estágios que ocorre em bactérias sob condições ambientais adversas ou momentos de estresse. Para patógenos entéricos, uma resposta de estresse significativo é induzida durante o trânsito gastrointestinal e após a exposição de bile, um componente normal da digestão humana. Para ultrapassar os efeitos bactericidos da bile, muitos patógenos entéricos formam um biofilme hipótese para permitir a sobrevivência, quando em trânsito através do intestino. Aqui nós apresentamos metodologias para definir a formação de biofilme por meio de ensaios de fase sólida aderência bem como deteção de matriz de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) e visualização. Além disso, a avaliação da dispersão de biofilme é apresentada para imitar a análise de eventos, desencadeando a liberação de bactérias durante o processo de infecção. Coloração violeta cristal é usado para detectar bactérias aderentes em um ensaio de aderência de placa de 96 poços de alta produtividade. Avaliação de produção de EPS é determinada por dois ensaios, nomeadamente microscopia coloração da matriz EPS e análise semi-quantitativa com uma lectina de ligação de polissacarídeo conjugado fluorescente. Finalmente, dispersão de biofilme é medido através de contagens de colônia e chapeamento. Dados positivos de vários ensaios apoiar a caracterização de biofilmes e podem ser utilizados para identificar a formação de biofilme induzida por sais biliares em outras cepas bacterianas.

Na Figura 1, a formação de biofilme é induzida na maior parte do crescimento de seguir testadas seis patógenos entéricos em meios contendo sais biliares. Um aumento significativo de bactérias aderentes após exposição de sais biliares é observada em quase todas as cepas testadas. A exceção é enteroaggregative e. coli (CEEA); no entanto, observe a observação induzida do Δaaf mutante4. Os result...

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Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Este protocolo permite que o leitor a analisar a formação de biofilme induzida por sais biliares em patógenos entéricos, usando uma abordagem multifacetada para capturar a natureza dinâmica dos biofilmes bacterianos avaliando aderência, formação de matriz extracelular de substâncias poliméricas, e dispersão.

Formação de biofilmes induzida por sais biliares em patógenos entéricos: técnicas para identificação e quantificação

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

bile-salt-induced-biofilm-formation-enteric-pathogens-techniques-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.3K visualizações.  Massachusetts General Hospital. Este protocolo permite que o leitor a analisar a formação de biofilme induzida por sais biliares em patógenos entéricos, usando uma abordagem multifacetada para capturar a natureza dinâmica dos biofilmes bacterianos avaliando aderência, formação de matriz extracelular de substâncias poliméricas, e dispersão.

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An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and composition 1, 2. In general, biofilms develop from initial microbial attachment on a surface followed by formation of cell clusters (or microcolonies) and further development and stabilization of the microcolonies, which occur in a complex extracellular matrix. The majority of biofilm matrices harbor exopolysaccharides (EPS), and dental biofilms are no exception; especially those associated with caries disease, which are mostly mediated by mutans streptococci 3. The EPS are synthesized by microorganisms (S. mutans, a key contributor) by means of extracellular enzymes, such as glucosyltransferases using sucrose primarily as substrate 3.
Studies of biofilms formed on tooth surfaces are particularly challenging owing to their constant exposure to environmental challenges associated with complex diet-host-microbial interactions occurring in the oral cavity. Better understanding of the dynamic changes of the structural organization and composition of the matrix, physiology and transcriptome/proteome profile of biofilm-cells in response to these complex interactions would further advance the current knowledge of how oral biofilms modulate pathogenicity. Therefore, we have developed an analytical tool-box to facilitate biofilm analysis at structural, biochemical and molecular levels by combining commonly available and novel techniques with custom-made software for data analysis. Standard analytical (colorimetric assays, RT-qPCR and microarrays) and novel fluorescence techniques (for simultaneous labeling of bacteria and EPS) were integrated with specific software for data analysis to address the complex nature of oral biofilm research.
The tool-box is comprised of 4 distinct but interconnected steps (Figure 1): 1) Bioassays, 2) Raw Data Input, 3) Data Processing, and 4) Data Analysis. We used our in vitro biofilm model and specific experimental conditions to demonstrate the usefulness and flexibility of the tool-box. The biofilm model is simple, reproducible and multiple replicates of a single experiment can be done simultaneously 4, 5. Moreover, it allows temporal evaluation, inclusion of various microbial species 5 and assessment of the effects of distinct experimental conditions (e.g. treatments 6; comparison of knockout mutants vs. parental strain 5; carbohydrates availability 7). Here, we describe two specific components of the tool-box, including (i) new software for microarray data mining/organization (MDV) and fluorescence imaging analysis (DUOSTAT), and (ii) in situ EPS-labeling. We also provide an experimental case showing how the tool-box can assist with biofilms analysis, data organization, integration and interpretation.

Biofilms formed on tooth surfaces are highly complex and exposed to constant innate and exogenous environmental challenges, which modulate their architecture, physiology and transcriptome. We developed a toolbox to examine the composition, structural organization and gene expression of oral biofilms, which can be adapted to other areas of biofilm research.

Uma ferramenta analítica-box para avaliação bioquímica, estrutural e Transcriptoma abrangente de Biofilmes Oral Mediada por estreptococos do grupo mutans

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Imunologia e Infecção

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

Análise de uma única célula de Bacillus subtilis Os biofilmes utilizando microscopia de fluorescência e citometria de fluxo

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified concurrent distribution of more than two components within biofilms because: 1)&#160;selection of fluorescent dyes having minimal spectral overlap is complicated, and 2)&#160;quantification of multiple fluorochromes poses a multifactorial problem. Objectives: Report a methodology to quantify and compare concurrent 3-dimensional distributions of three cellular/extracellular components of biofilms grown on relevant substrates. Methods: The method consists of distinct, interconnected steps involving biofilm growth, staining, CLSM imaging, biofilm structural analysis and visualization, and statistical analysis of structural parameters. Biofilms of Streptococcus mutans (strain UA159) were grown for 48 hr on sterile specimens of Point 4 and TPH3 resin composites. Specimens were subsequently immersed for 60 sec in either Biot&#232;ne PBF (BIO) or Listerine Total Care (LTO) mouthwashes, or water (control group; n=5/group). Biofilms were stained with fluorochromes for extracellular polymeric substances, proteins and nucleic acids before imaging with CLSM. Biofilm structural parameters calculated using ISA3D image analysis software were biovolume and mean biofilm thickness. Mixed models statistical analyses compared structural parameters between mouthwash and control groups (SAS software; &#945;=0.05). Volocity software permitted visualization of 3D distributions of overlaid biofilm components (fluorochromes). Results: Mouthwash BIO produced biofilm structures that differed significantly from the control (p&#60;0.05) on both resin composites, whereas LTO did not produce differences (p&#62;0.05) on either product. Conclusions: This methodology efficiently and successfully quantified and compared concurrent 3D distributions of three major components within S. mutans biofilms on relevant substrates, thus overcoming two challenges to simultaneous assessment of biofilm components. This method can also be used to determine the efficacy of antibacterial/antifouling agents against multiple biofilm components, as shown using mouthwashes. Furthermore, this method has broad application because it facilitates comparison of 3D structures/architecture of biofilms in a variety of disciplines.

A protocol for the concurrent quantification and comparison of three cellular and extracellular components within biofilms is presented. The methodology involves the use of confocal laser scanning microscopy, biofilm structural analysis and visualization software, and statistical analysis software.

Quantificação simultânea de celulares e extracelulares Componentes de biofilmes

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Metodologias para o estudo<em&gt; B. subtilis</em&gt; Os biofilmes como um modelo para a caracterização de pequena molécula biofilme Inibidores

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Um novo método para a análise qualitativa Multi-escala de Bacteriana biofilmes em filamentosa fúngica Colonies Usando Confocal e Microscopia Eletrônica

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Protocolos para análise da infecção por Shigella em células epiteliais do cólon

Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, and is a leading cause of diarrheal deaths worldwide. Infection induces watery or bloody diarrhea as a result of the pathogen transiting the gastrointestinal tract and infecting the epithelial cells lining the colon. With staggering increases in antibiotic resistance and the current lack of approved vaccines, standardized research protocols are critical to studying this formidable pathogen. Here, methodologies are presented to examine the molecular pathogenesis of Shigella using in vitro analyses of bacterial adherence, invasion, and intracellular replication in colonic epithelial cells. Prior to infection analyses, the virulence phenotype of Shigella colonies was verified by the uptake of the Congo red dye on agar plates. Supplemented laboratory media can also be considered during bacterial culturing to mimic in vivo conditions. Bacterial cells are then used in a standardized protocol to infect colonic epithelial cells in tissue culture plates at an established multiplicity of infection with adaptations to analyze each stage of infection. For adherence assays, Shigella cells are incubated with reduced media levels to promote bacterial contact with epithelial cells. For both invasion and intracellular replication assays, gentamicin is applied for various time intervals to eliminate extracellular bacteria and enable assessment of invasion and/or the quantification of intracellular replication rates. All infection protocols enumerate adherent, invaded, and/or intracellular bacteria by serially diluting infected epithelial cell lysates and plating bacterial colony forming units relative to infecting titers on Congo red agar plates. Together, these protocols enable independent characterization and comparisons for each stage of Shigella infection of epithelial cells to study this pathogen successfully.

Autor em destaque: Avanços na compreensão e combate às infecções por Shigella

The present protocol describes infection assays to interrogate Shigella adherence, invasion, and intracellular replication using in vitro epithelial cell lines.

Análise de Infecção de Células Epiteliais com Shigella

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, ...

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their nature would be beneficial in facilitating their characterization. Currently, most studies focus only on one specific characterization method; however, the isolation and identification of microorganisms from the host is a continuous process and usually requires several combinatorial characterization methods. Herein, we describe methods of identifying the microbial biofilm-forming ability, the microbial respiration state, and their chemotaxis behavior. The methods are used to identify five microbes, three of which were isolated from the bone tissue of Sprague-Dawley (SD) rats (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus, and Enterococcus faecalis) and two from the American Type Culture Collection (ATCC)-Staphylococcus aureus ATCC 25923&#160;and Enterococcus faecalis V583. The microbes isolated from the SD rat bone tissue include the gram-positive microbes. These microbes have adapted to thrive under stressful and nutrient-limiting environments within the bone matrix. This article aims to provide the readers with the specific know-how of determining the nature and behavior of the isolated microbes within a laboratory setting.

Here, we present a practical method for the isolation and identification of microorganisms within the host. In this way, the physicochemical properties of microorganisms and possible ways of living in the host are clearly described.

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their ...

Biologia

Avaliação da formação de biofilme de Acinetobacter e caracterização de biofilmes

Quantification, Viability Assessment, and Visualization Strategies for Acinetobacter Biofilms

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, biofilm quantification and visualization are important methods to assess the potential of Acinetobacter strains to cause nosocomial infections. The biofilms forming on the surface of the microplate can be quantified in terms of volume and cell numbers. Biofilm volumes can be quantified by staining using crystal violet, washing, destaining using ethanol, then measuring the solubilized dye using a microplate reader. To quantify the number of cells embedded in the biofilms, the biofilms are scrapped off using cell scrapers, harvested in the saline, vigorously agitated in the presence of glass beads, and spread on Acinetobacter agar. Then, the plates are incubated at 30 &#176;C for 24-42 h. After incubation, the red colonies are enumerated to estimate the number of cells in biofilms. This viable count method can also be useful for counting Acinetobacter cells in mixed-species biofilms. Acinetobacter biofilms can be visualized using fluorescent dyes. A commercially available microplate designed for microscopic analysis is employed to form biofilms. Then, the bottom-surface attached biofilms are stained with SYTO9 and propidium iodide dyes, washed, then visualized with confocal laser scanning microscopy.

Autor em destaque: um protocolo abrangente para quantificação, avaliação e visualização de biofilme de Acinetobacter 

This protocol describes the preparation of the inoculum, the biofilm quantification on microtiter plates using crystal violet dye, the viable count in biofilms, and the visualization of biofilms of Acinetobacter.

Quantificação, Avaliação de Viabilidade e Estratégias de Visualização para Biofilmes de Acinetobacter

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, ...

Formação de biofilmes induzida por sais biliares em patógenos entéricos: técnicas para identificação e quantificação

Resumo

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Uma ferramenta analítica-box para avaliação bioquímica, estrutural e Transcriptoma abrangente de Biofilmes Oral Mediada por estreptococos do grupo mutans

Análise de uma única célula de Bacillus subtilis Os biofilmes utilizando microscopia de fluorescência e citometria de fluxo

Quantificação simultânea de celulares e extracelulares Componentes de biofilmes

Metodologias para o estudo

Um novo método para a análise qualitativa Multi-escala de Bacteriana biofilmes em filamentosa fúngica Colonies Usando Confocal e Microscopia Eletrônica

Análise de Infecção de Células Epiteliais com Shigella

Análise de Infecção de Células Epiteliais com Shigella

Análise de Infecção de Células Epiteliais com Shigella

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

Quantificação, Avaliação de Viabilidade e Estratégias de Visualização para Biofilmes de Acinetobacter