Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa Principal de Pesquisa (E0210702-03) do Korea Food Research Institute (KFRI), financiado pelo Ministério da Ciência e TIC.

1. Preparação do inóculo bacteriano
<ol><li>Retire o frasco para injetáveis de glicerol armazenado a -80 °C.</li>
	<li>Retire a estirpe bacteriana (2-10 μL) do frasco para injetáveis utilizando uma ponta de pipeta estéril. NOTA: Cepas de Acinetobacter , A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) e A. ursingii (24-1) são utilizadas neste protocolo.</li>
	<li>Inocular uma placa de ágar sangue comercialmente disponível (ágar de soja tríptico suplementado com 5% de sangue de carneiro, ver Tabela de Materiais) com as bactérias. NOTA: Outros meios, como ágar nutriente ou ágar MacConkey, também podem ser usados.</li>
	<li>Estrie a superfície do ágar usando uma alça estéril com chamas intermitentes para afiná-la.</li>
	<li>Coloque a placa de ágar de cabeça para baixo em uma incubadora e incube a 30 °C durante a noite por 20-24 h.</li>
	<li>Escolha uma única colônia da cultura bacteriana com uma agulha estéril e inocular 5 mL de caldo de infusão cerebral cerebral estéril (BHI, ver Tabela de Materiais) com a cultura.</li>
	<li>Incubar o caldo inoculado numa incubadora de agitação a 30 °C durante a noite durante 20-24 h a cerca de 150 rpm.</li>
	<li>Transferir 1 mL da cultura noturna para um tubo de microcentrífuga estéril e centrifugar a cultura noturna a 6.000 × g por 10 min à temperatura ambiente (TR).</li>
	<li>Retire o sobrenadante com uma pipeta.</li>
	<li>Usando um vórtice, ressuspenda o pellet em 1 mL de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS).</li>
	<li>Centrifugar a 6.000 × g por 10 min em RT e remover o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender o pellet em BHI estéril dez vezes diluído usando vórtice para uma densidade óptica de cerca de 0,1 a 600 nm. NOTA: A densidade óptica de cerca de 0,1 é equivalente a aproximadamente 107 UFC/mL.</li>
</ol>2. Quantificação do biofilme utilizando cristal violeta
<ol><li>Adicionar 200 μL de inóculo a cada poço de uma placa estéril de poliestireno de 96 poços (ver Tabela de Materiais) e adicionar 200 μL de água deionizada a cada um dos poços mais externos para evitar que os poços internos sequem15.</li>
	<li>Adicionar 200 μL de BHI diluído dez vezes a cada poço da mesma placa como controle negativo.</li>
	<li>Incubar a placa a 25 °C durante 24 horas.</li>
	<li>Retire o sobrenadante com uma pipeta. NOTA: A pipeta multicanal é geralmente mais conveniente para várias amostras.</li>
	<li>Adicione cuidadosamente 300 μL de PBS a cada poço e remova o sobrenadante com uma pipeta. NOTA: A pipeta multicanal é geralmente mais conveniente para várias amostras.</li>
	<li>Repita a etapa 2.5 mais duas vezes.</li>
	<li>Adicionar 200 μL de solução de cristal violeta (1%) (ver Tabela de Materiais) a cada poço e incubar em RT durante 30 minutos.</li>
	<li>Repita as etapas 2.4-2.6.</li>
	<li>Adicione 200 μL de etanol absoluto a cada poço e incube por 15 min em RT. Misture bem pipetando para cima e para baixo várias vezes.</li>
	<li>Transfira a eluição de 100 μL de cada poço para uma nova placa de 96 poços.</li>
	<li>Medir a absorbância a 595 nm utilizando um leitor de microplacas (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Quando a absorbância exceder 2,0, fazer uma diluição adequada da amostra para a absorvância inferior a 2,0 em etanol absoluto e medi-la como na etapa 2.11. Em seguida, calcule a absorbância da amostra (valor final) multiplicando o valor observado pelo fator de diluição.</li>
	<li>Calcular a verdadeira absorbância das amostras subtraindo o valor médio do controlo negativo do valor de cada poço das amostras de ensaio na mesma placa de poço.</li>
</ol>3. Contagem de viabilidade do biofilme
<ol><li>Adicionar 1 mL de inóculo (passo 1) a cada poço de uma placa estéril de poliestireno de 12 poços15. Incubar a placa a 25 °C durante 24 horas. Retire o sobrenadante com uma pipeta.</li>
	<li>Adicione cuidadosamente 1,5 mL de PBS estéril a cada poço e remova o sobrenadante com uma pipeta. Adicionar 1 mL de PBS estéril a cada poço.</li>
	<li>Raspe as superfícies do fundo e da parede do poço usando raspadores de células adaptados.</li>
	<li>Transferir a suspensão celular colhida para um tubo plástico estéril (10-1) contendo 9 mL de solução salina (NaCl a 0,85%) e 10-20 esferas de vidro (ver Tabela de Materiais). NOTA: Para coletar qualquer resíduo residual de biofilme deixado na superfície inferior do poço, ele pode ser ressuspendido e transferido por pipeta usando soro fisiológico do tubo 10-1 .</li>
	<li>Vórtice o tubo 10-1 por 60 s em uma velocidade máxima.</li>
	<li>Fazer uma diluição seriada de 10 vezes transferindo 1 mL para o próximo tubo estéril (10-2) contendo 9 mL de solução salina (NaCl a 0,85%) até 10-7.</li>
	<li>Espalhe 100 μL de cada diluição em ágar Acinetobacter (ver Tabela de Materiais) e incube as placas de ágar a 30 °C durante 24-42 horas.</li>
	<li>Conte manualmente o número das colônias vermelhas típicas em cada placa no intervalo entre 10 e 250.</li>
	<li>Calcule o número de células viáveis no biofilme de cada poço utilizando a equação abaixo: Células viáveis = Número de colônias × Fatores de diluição × 10</li>
</ol>4. Visualização do biofilme por microscopia confocal de varredura a laser (CLSM)
<ol><li>Adicionar 200 μL de inóculo a cada poço de uma placa estéril de 96 poços destinada à análise microscópica.</li>
	<li>Incubar a placa a 25 °C durante 24 horas.</li>
	<li>Retire o sobrenadante com uma pipeta.</li>
	<li>Adicione cuidadosamente 300 μL de água deionizada esterilizada por filtro a cada poço e remova o sobrenadante com uma pipeta.</li>
	<li>Repita a etapa 4.4.</li>
	<li>Preparar a mistura de SYTO 9 e iodeto de propídio (ver Tabela de Materiais) diluída em água deionizada esterilizada por filtro até uma concentração final de 10 μM e 60 μM, respectivamente.</li>
	<li>Adicione a mistura a cada poço a 200 μL e incube a placa por 20-30 min em TR no escuro.</li>
	<li>Repita as etapas 4.3-4.4</li>
	<li>Visualize os biofilmes acoplados à superfície inferior usando CLSM com comprimento de onda de excitação de 488 nm e 561 nm e a faixa de comprimento de onda de emissão de 499-535 nm e 568-712 nm, respectivamente.</li>
</ol>

Avaliação da formação de biofilme de Acinetobacter e caracterização de biofilmes

<ol>
	<li>Wong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+pathophysiological+overview+of+Acinetobacter+infections:+a+century+of+challenges.">Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges.</a> Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).</li><li>Carvalheira, A., Silva, J., Teixeira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+spp.+in+food+and+drinking+water+-+A+review.">Acinetobacter spp. in food and drinking water - A review.</a> Food Microbiology. 95, 103675 (2021).</li><li>Towner, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter:+an+old+friend,+but+a+new+enemy.">Acinetobacter: an old friend, but a new enemy.</a> Journal of Hospital Infection. 73 (4), 355-363 (2009).</li><li>Weber, D. J., Rutala, W. A., Miller, M. B., Huslage, K., Sickbert-Bennett, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hospital+surfaces+in+the+transmission+of+emerging+health+care-associated+pathogens:+Norovirus,+Clostridium+difficile,+and+Acinetobacter+species.">Role of hospital surfaces in the transmission of emerging health care-associated pathogens: Norovirus, Clostridium difficile, and Acinetobacter species.</a> American Journal of Infection Control. 38 (5), S25-S33 (2010).</li><li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm+matrix:+multitasking+in+a+shared+space.">The biofilm matrix: multitasking in a shared space.</a> Nature Reviews Microbiology. 21 (2), 70-86 (2023).</li><li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+emergent+form+of+bacterial+life.">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).</li><li>Yin, W., Wang, Y., Liu, L., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+the+microbial+&amp;#34;protective+clothing&amp;#34;+in+extreme+environments.">Biofilms: the microbial &amp;#34;protective clothing&amp;#34; in extreme environments.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), 3423 (2019).</li><li>Gedefie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii+biofilm+formation+and+its+role+in+disease+pathogenesis:+a+review.">Acinetobacter baumannii biofilm formation and its role in disease pathogenesis: a review.</a> Infection and drug resistance. 14, 3711-3719 (2021).</li><li>Whiteway, C., Breine, A., Philippe, C., Van der Henst, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii.">Acinetobacter baumannii.</a> Trends in Microbiology. 30 (2), 199-200 (2022).</li><li>Longo, F., Vuotto, C., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+in+Acinetobacter+baumannii.">Biofilm formation in Acinetobacter baumannii.</a> New Microbiologica. 37 (2), 119-127 (2014).</li><li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+review+on+biofilm+methods.">Critical review on biofilm methods.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).</li><li>Jia, J., Xue, X., Guan, Y., Fan, X., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+characteristics+and+transcriptomic+profiling+of+Acinetobacter+johnsonii+defines+signatures+for+planktonic+and+biofilm+cells.">Biofilm characteristics and transcriptomic profiling of Acinetobacter johnsonii defines signatures for planktonic and biofilm cells.</a> Environmental Research. 213, 113714 (2022).</li><li>Yang, C., Su, P., Moi, S., Chuang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+in+Acinetobacter+baumannii:+genotype-phenotype+correlation.">Biofilm formation in Acinetobacter baumannii: genotype-phenotype correlation.</a> Molecules. 24 (10), 1849 (2019).</li><li>Alamri, A. M., Alsultan, A. A., Ansari, M. A., Alnimr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm-formation+in+clonally+unrelated+multidrug-resistant+Acinetobacter+baumannii+isolates.">Biofilm-formation in clonally unrelated multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolates.</a> Pathogens. 9 (8), 630 (2020).</li><li>Lim, E. S., Nam, S. J., Koo, O. K., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+role+of+Acinetobacter+and+Bacillus+for+Escherichia+coli+O157:H7+in+biofilms+against+sodium+hypochlorite+and+extracellular+matrix-degrading+enzymes.">Protective role of Acinetobacter and Bacillus for Escherichia coli O157:H7 in biofilms against sodium hypochlorite and extracellular matrix-degrading enzymes.</a> Food Microbiology. 109, 104125 (2023).</li><li>Stepanovi&#263;, S., &#262;irkovi&#263;, I., Ranin, L., Svabi&#263;-Vlahovi&#263;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+by+Salmonella+spp.+and+Listeria+monocytogenes+on+plastic+surface.">Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface.</a> Letters in Applied Microbiology. 38 (5), 428-432 (2004).</li><li>Boone, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+virulence+phenotypes+and+antibiotic+resistance+in+clinical+strains+of+Acinetobacter+baumannii+isolated+in+Nashville,+Tennessee.">Analysis of virulence phenotypes and antibiotic resistance in clinical strains of Acinetobacter baumannii isolated in Nashville, Tennessee.</a> BMC Microbiology. 21 (1), 21 (2021).</li><li>Otter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-attached+cells,+biofilms+and+biocide+susceptibility:+implications+for+hospital+cleaning+and+disinfection.">Surface-attached cells, biofilms and biocide susceptibility: implications for hospital cleaning and disinfection.</a> Journal of Hospital Infection. 89 (1), 16-27 (2015).</li><li>Ravishankar, S., Juneja, V. K., Yousef, A. E., Juneja, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+or+resistance+responses+of+microorganisms+to+stresses+in+the+food+processing+environment.">Adaptation or resistance responses of microorganisms to stresses in the food processing environment.</a> Microbial Stress Adaptation and Food Safety. , (2003).</li><li>Dewanti, R., Wong, A. C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+culture+conditions+on+biofilm+formation+by+Escherichia+coli+O157:H7.">Influence of culture conditions on biofilm formation by Escherichia coli O157:H7.</a> International Journal of Food Microbiology. 26 (2), 147-164 (1995).</li><li>McConnell, M. J., Actis, L., Pach&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii:+human+infections,+factors+contributing+to+pathogenesis+and+animal+models.">Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models.</a> FEMS Microbiology Reviews. 37 (2), 130-155 (2013).</li><li>McQueary, C. N., Actis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii+biofilms:+variations+among+strains+and+correlations+with+other+cell+properties.">Acinetobacter baumannii biofilms: variations among strains and correlations with other cell properties.</a> The Journal of Microbiology. 49 (2), 243-250 (2011).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Usando o protocolo descrito, a formação de biofilme de isolados de Acinetobacter com graus variados foi medida, visualizada e as células viáveis nos biofilmes foram estimadas (Figura 1, Figura 2 e Figura 3).
Neste protocolo, foram utilizadas duas diferentes temperaturas, 30 °C para o crescimento e 25 °C para a formação do biofilme de Acinetobacter. 30 °C foi utilizado porque mui...

Sabe-se que a Acinetobacter causa infecções nosocomiais é cada vez mais relatada1. Está disseminada em hospitais, serviços de saúde e ambientes associados à alimentação 2,3,4. Pode sobreviver por um longo período em ambientes que incluem superfícies hospitalares, como grades de cama, mesas de cabeceira, superfície de ventiladores e pias4. Essa persistência nas superfícies ambientais pode ser um dos fatores significativos que contribuem para as infecções nosocomiais de Acinetobacter4.
O biofilme é uma forma de vida microbiana e é uma matriz microbiana composta por células microbianas vivas e substâncias poliméricas extracelulares (EPS) provenientes das células5. As células microbianas estão embutidas na matriz e são frequentemente altamente resistentes a estresses ambientais como calor, sais, secura, antibióticos, desinfetantes e forças de cisalhamento 6,7.
Acinetobacter pode formar biofilmes em superfícies, sugerindo que pode contribuir para maior sobrevida em superfícies ambientais, incluindo superfícies hospitalares, e maior resistência ao tratamento com antibióticos 8,9. Além disso, a formação de biofilme de Acinetobacter poderia estar altamente associada a desfechos clínicos humanos8. Portanto, a formabilidade do biofilme de cepas de Acinetobacter pode ser um dos indicadores na predição de sobrevivência ambiental e infecções humanas 8,10.
Os biofilmes aderidos à superfície podem ser quantificados e visualizados para avaliar a formabilidade do biofilme. Para quantificar os biofilmes aderidos à superfície, os biofilmes são normalmente corados por corantes corantes de biofilme, como o violeta de cristal, e os corantes são eluídos em solução e medidos quanto à densidade óptica11. A visualização de biofilmes é outra boa abordagem para avaliar a conformabilidade do biofilme11. O método de visualização por microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) empregando especificidade usando corantes fluorescentes poderia ser mais útil para caracterizar a morfologia do biofilme em comparação com outras técnicas, como aMEV12,13.
As células viáveis em biofilmes podem ser contadas para estimar o número de células viáveis em biofilmes11. As células viáveis embutidas em biofilmes são destacadas, diluídas, espalhadas em placas de ágar, incubadas e enumeradas. Como o maior número de células provavelmente atenderá à dose infecciosa, ele pode fornecer informações mais detalhadas sobre os biofilmes, como os potenciais de infecção associados ao número de células13,14.
Este artigo apresenta protocolos passo a passo para (1) quantificar biofilmes aderidos à superfície, (2) contar células viáveis nos biofilmes e (3) visualizar os biofilmes usando CLSM de Acinetobacter. Os protocolos apresentados descrevem os métodos para avaliar a conformabilidade do biofilme de isolados de Acinetobacter e caracterizar seus biofilmes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plate</td>
			<td>SPL</td>
			<td>30096</td>
			<td>Polystyrene 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHI (Brain Heart Infusion) broth</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>1.10493.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Agar Base Plate</td>
			<td>KisanBio</td>
			<td>MB-B1005-P50</td>
			<td>Growth media for Acinetobacter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHROMagar Acinetobacter</td>
			<td>CHROMagar</td>
			<td>AC092</td>
			<td>Selective plate for Acinetobacter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V5265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L10316</td>
			<td>SYTO9 and propidium iodide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M200 PRO NanoQuant</td>
			<td>Biofilm measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Glass Plating Beads</td>
			<td>RBC</td>
			<td>RG001</td>
			<td>Glass beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-Plate 96 Well Black</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>89621</td>
			<td>Microplate intended for CLSM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification, viability assessment, and visualization strategies for acinetobacter biofilms

Acinetobacter causa infecções hospitalares e sua formação de biofilme pode contribuir para a sobrevivência em superfícies secas, como ambientes hospitalares. Assim, a quantificação e visualização do biofilme são métodos importantes para avaliar o potencial de cepas de Acinetobacter em causar infecções nosocomiais. Os biofilmes que se formam na superfície da microplaca podem ser quantificados em termos de volume e número de células. Os volumes de biofilme podem ser quantificados pela coloração usando violeta de cristal, lavagem, coloração usando etanol e, em seguida, medindo o corante solubilizado usando um leitor de microplacas. Para quantificar o número de células embutidas nos biofilmes, os biofilmes são descartados com raspadores celulares, colhidos em solução salina, agitados vigorosamente na presença de esferas de vidro e espalhados em ágar Acinetobacter. Em seguida, as placas são incubadas a 30 °C por 24-42 h. Após a incubação, as colônias vermelhas são enumeradas para estimar o número de células em biofilmes. Este método de contagem viável também pode ser útil para a contagem de células de Acinetobacter em biofilmes de espécies mistas. Biofilmes de Acinetobacter podem ser visualizados usando corantes fluorescentes. Uma microplaca comercialmente disponível projetada para análise microscópica é empregada para formar biofilmes. Em seguida, os biofilmes aderidos à superfície inferior são corados com SYTO9 e iodeto de propídio, lavados e, em seguida, visualizados com microscopia confocal de varredura a laser.

Acinetobacter is known to cause nosocomial infections, and its human infection, especially in healthcare facilities, is increasingly reported1. It is widespread in hospitals, healthcare facilities, and food-associated environments2,3,4. It can survive for a long period in environments including hospital surfaces such as bed rails, bedside tables, the surface of ventilators, and sinks4. Such persistence on environmental surfaces may be one of the significant factors contributing to the nosocomial infections of Acinetobacter4.
Biofilm is a form of microbial life and is a microbial matrix composed of live microbial cells and extracellular polymeric substances (EPS) from the cells5. The microbial cells are embedded in the matrix and are often highly resistant to environmental stresses such as heat, salts, dryness, antibiotics, disinfectants, and shear forces6,7.
Acinetobacter can form biofilms on surfaces, suggesting that it may contribute to extended survival on environmental surfaces, including hospital surfaces, and enhanced resistance to antibiotic treatment8,9. In addition, the biofilm formation of Acinetobacter could be highly associated with human clinical outcomes8. Therefore, the biofilm formability of Acinetobacter strains could be one of the indicators in predicting environmental survival and human infections8,10.
The surface-attached biofilms can be quantified and visualized to assess biofilm formability. To quantify surface-attached biofilms, the biofilms are normally stained by biofilm-staining dyes such as crystal violet, and the dyes are eluted in solution and measured for optical density11. Visualization of biofilms is another good approach to assess biofilm formability11. Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) visualization method employing specificity using fluorescent dyes could be more useful to characterize biofilm morphology compared to other techniques such as SEM12,13.
The viable cells in biofilms can be counted to estimate the number of viable cells in biofilms11. The viable cells embedded in biofilms are detached, diluted, spread on agar plates, incubated, and enumerated. Because the higher number of cells is likely to meet the infectious dose, it can provide more detailed information on biofilms, such as infection potentials associated with the number of cells13,14.
This article presents step-by-step protocols to (1) quantify surface-attached biofilms, (2) count viable cells in the biofilms, and (3) visualize the biofilms using CLSM of Acinetobacter. The presented protocols describe the methods to assess the biofilm formability of Acinetobacter isolates and characterize their biofilms.

Autor em destaque: um protocolo abrangente para quantificação, avaliação e visualização de biofilme de Acinetobacter 

Quantificação, Avaliação de Viabilidade e Estratégias de Visualização para Biofilmes de Acinetobacter

Biofilms are composed of live microbial cells and are difficult to remove from the surfaces. Acinetobacter strains commonly found in our environment, causing nosocomial infections, are also known to form biofilms on surfaces. So, we aim to develop methods to both quantify and visualize Acinetobacter biofilms.Our protocol provides a simple and easy method to quantify and visualize the biofilms of Acinetobacter. The viable number of cells inside the biofilms is quantified by using the viable count method. Our research findings reveal that the naturally-existing Acinetobacter vector strains have quite varying potentials for biofilm formation.Also, there will exist distinct morphological differences within the various biofilms. This paved the way for research focusing on the causes of such a large variation among Acinetobacter strains.

Seguindo o protocolo, os biofilmes dos isolados de Acinetobacter , originalmente isolados de superfícies de cozinha, foram formados em uma placa de poliestireno de 96 poços, corada com violeta de cristal, e os corantes foram solubilizados em etanol e medidos quanto à massa de biofilme (Figura 1). O número de biofilmes variou muito dependendo das cepas, variando de 0,04 a 1,69 DO (Figura 1). Com base nos critérios estabelecidos por Stepanović et <s...

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Este protocolo descreve a preparação do inóculo, a quantificação do biofilme em placas de microtitulação usando corante violeta cristal, a contagem viável em biofilmes e a visualização de biofilmes de Acinetobacter.

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, ...

Os biofilmes são compostos por células microbianas vivas e são difíceis de remover das superfícies. Cepas de Acinetobacter comumente encontradas em nosso meio, causando infecções nosocomiais, também são conhecidas por formar biofilmes em superfícies. Assim, pretendemos desenvolver métodos para quantificar e visualizar biofilmes de Acinetobacter.Nosso protocolo fornece um método simples e fácil para quantificar e visualizar os biofilmes de Acinetobacter. O número viável de células no interior dos biofilmes é quantificado pelo método de contagem viável. Nossos resultados de pesquisa revelam que as cepas vetoriais de Acinetobacter naturalmente existentes têm potenciais bastante variados para a formação de biofilme.Além disso, existirão diferenças morfológicas distintas dentro dos vários biofilmes. Isso abriu caminho para pesquisas com foco nas causas de uma variação tão grande entre as cepas de Acinetobacter.

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Research

JoVE Journal

Biology

Quantification, Viability Assessment, and Visualization Strategies for Acinetobacter Biofilms

1.4K visualizações.  Korea Food Research Institute. Os biofilmes são compostos por células microbianas vivas e são difíceis de remover das superfícies. Cepas de Acinetobacter comumente encontradas em nosso meio, causando infecções nosocomiais, também são conhecidas por formar biofilmes em superfícies. Assim, pretendemos desenvolver métodos para quantificar e visualizar biofilmes de Acinetobacter.Nosso protocolo fornece um método simples e fácil para quantificar e visualizar os biofilmes de Acinetobacter. O número viável d...

Vídeo: Autor em destaque: um protocolo abrangente para quantificação, avaliação e visualização de biofilme de Acinetobacter 

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, biofilm quantification and visualization are important methods to assess the potential of Acinetobacter strains to cause nosocomial infections. The biofilms forming on the surface of the microplate can be quantified in terms of volume and cell numbers. Biofilm volumes can be quantified by staining using crystal violet, washing, destaining using ethanol, then measuring the solubilized dye using a microplate reader. To quantify the number of cells embedded in the biofilms, the biofilms are scrapped off using cell scrapers, harvested in the saline, vigorously agitated in the presence of glass beads, and spread on Acinetobacter agar. Then, the plates are incubated at 30 &#176;C for 24-42 h. After incubation, the red colonies are enumerated to estimate the number of cells in biofilms. This viable count method can also be useful for counting Acinetobacter cells in mixed-species biofilms. Acinetobacter biofilms can be visualized using fluorescent dyes. A commercially available microplate designed for microscopic analysis is employed to form biofilms. Then, the bottom-surface attached biofilms are stained with SYTO9 and propidium iodide dyes, washed, then visualized with confocal laser scanning microscopy.

This protocol describes the preparation of the inoculum, the biofilm quantification on microtiter plates using crystal violet dye, the viable count in biofilms, and the visualization of biofilms of Acinetobacter.

Biologia

Preparation of Bacterial Inoculum for Acinetobacter Biofilm Formation

Preparation of Bacterial Inoculum for Acinetobacter Biofilm Formation  

To begin the process of bacterial inoculum preparation, collect 2 to 10 microliters of the bacterial strain from the vial, using a sterile pipette tip, and inoculate a commercially-available blood agar plate with it. Using a sterile loop, streak the agar surface, thinning it out with intermittent flaming. Incubate the prepared agar plate in an upside-down position at 30 degrees Celsius for about 20 to 24 hours.Next, select a single colony of the bacterial culture with a sterile needle and inoculate five milliliters of sterile BHI broth with this culture. Incubate the inoculated broth in a shaking incubator at 30 degrees Celsius at a speed of 150 rotations per minute for about 20 to 24 hours. Then transfer one milliliter of the culture to a sterile micro-centrifuge tube and centrifuge at 6, 000 g and room temperature for 10 minutes.Following centrifugation, discard the supernatant. Add one milliliter of sterile phosphate-buffered saline, or PBS, to the pellet, and re-suspend it using a vortex. Centrifuge the re-suspended pellet at 6, 000 g for 10 minutes at room temperature and discard the supernatant.This time re-suspend the resulting pellet in sterile, tenfold-diluted BHI broth using vortex. Ensure to achieve an optical density of around 0.1 at 600 nanometers.

Preparação de Inóculo Bacteriano para Formação de Biofilme de Acinetobacter

Acinetobacter Biofilm Quantification Using Crystal Violet

Acinetobacter Biofilm Quantification Using Crystal Violet  

To begin, add 200 microliters of the bacterial inoculum to each well of a sterile polystyrene 96-well plate. Then add 200 microliters of deionized water into the outermost wells to keep the inner wells from drying out. Incubate the 96-well plate at 25 degrees Celsius for 24 hours.Following incubation, discard the supernatant in each well using a pipette. Carefully add 300 microliters of PBS to each well and remove the PBS again by using the pipette. Add 200 microliters of 1%crystal violet solution to each well before incubating the plate at room temperature for 30 minutes.Then after dispensing 200 microliters of absolute ethanol in each well, leave the plate for 15 minutes at room temperature. Ensure thorough mixing by pipetting the contents in each well up and down repeatedly. Using a microplate reader, measure the absorbance of the wells at 595 nanometers to determine the biofilm mass.The number of biofilms varied greatly depending on the strains, ranging from an optical density or OD value of 0.04 to 1.69 All of the Acetobacter isolates, except for A.bouvetii, formed biofilms, while A.radioresistens formed a weak biofilm. A.junii and A.baumannii formed moderate biofilms, and A.pittii and A.ursingii formed strong biofilms.

Acinetobacter Quantificação de Biofilme Utilizando Cristal Violeta

Assessing Acinetobacter Biofilm Viability Count

Assessing Acinetobacter Biofilm Viability Count  

Begin by adding one milliliter of the bacterial inoculum to each well of a sterile polystyrene 12 well plate. Incubate the plate at 25 degrees Celsius for 24 hours. Then, remove the supernatant using a pipette.Carefully add 1.5 milliliters of sterile phosphate buffered saline or PBS to each well, and again, remove the supernatant with the pipette. After adding one milliliter of sterile PBS to each well once more, use fitted cell scrapers to scrape off the bottom and wall surfaces of the wells. Transfer the harvested cell suspension to a sterile plastic tube marked as 10 to the negative one containing nine milliliters of saline and 10 to 20 glass beads.Vortex the tube for 60 seconds at maximum speed. Next, perform a tenfold serial dilution by transferring one milliliter of the cell suspension from the previous tube to another sterile tube marked 10 to the negative two containing nine milliliters of saline solution. Continue this process of serial dilution up to tube 10 to the negative seven.Spread 100 microliters from each dilution onto separate acinetobacter agar plates. Incubate the agar plates at 30 degrees Celsius for 24 to 42 hours. Then count the number of typical red colonies on each plate manually, considering those within the range between 10 and 250.All the acinetobacter isolates except for A.bouvetii had cells equivalent to seven to eight log CFU per well in their biofilms. While A.bouvetii had a much lower cell number at 4.4 Log CFU.

Avaliação da Contagem de Viabilidade do Biofilme de Acinetobacter

Acinetobacter Biofilm Visualization by Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM)

Begin by adding 200 microliters of bacterial inoculum into each well of a sterile 96-well plate prepared for microscopic analysis. Incubate the plate at 25 degrees Celsius for 24 hours before removing the supernatant with the pipette. Next, carefully add 300 microliters of filter-sterilized deionized water into each well.Remove the supernatant using a pipette once again. In another tube, prepare a diluted mixture of SYTO 9 and propidium iodide and filter-sterilized deionized water to the respective desired final concentrations. Then add 200 microliters of the mixture into each well and incubate the plate for 20 to 30 minutes at room temperature in a dark setting.Confocal laser scanning microscopy revealed that biofilm formation significantly varied depending on the strains. A substantial amount of biofilm was found in Acinetobacter junii, Acinetobacter baumannii, and Acinetobacter ursingii with distinct biofilm morphologies.