Este trabalho foi feito possível pela subvenção NIH: R01GM109028 (S.P.C.)

1. Nilo vermelho (NR) coloração de lipídios
<ol><li>Preparação de NR de 5 mg/mL de solução<ol>
<li>Em uma garrafa de 500 mL, adicione 100 mg de pó NR para 200 mL de acetona 100%.</li>
		<li>Cubra o frasco com papel de alumínio para evitar qualquer exposição à luz.</li>
		<li>Antes de usar, misture a solução por 2 h no escuro.</li>
		<li>Para uso a longo prazo, armazene a solução estoque NR em um frasco hermeticamente selado sem qualquer exposição à luz. Escala NR solução-mãe de acordo com as necessidades de pesquisa. Certifique-se de que a mesma solução estoque é usada através de experimentos NR-coloração para obter a coloração consistente e os resultados de imagem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação da solução de trabalho NR<ol>
<li>Para cada 1 mL de isopropanol 40% (v/v), adicione 6 µ l de solução-mãe de NR.</li>
		<li>Prepare-se para cada amostra de 600 µ l da solução de trabalho de NR. Nota: Fazer fresco NR funcionando direito solução antes da coloração. Dependendo das necessidades de solução-mãe de NR, use um tubo cônico graduado de 50 mL ou 15 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação de worms para coloração de lipídios NR<ol>
<li>Crescem vermes a fase inicial de L4 a 20 ° C, no meio de crescimento de nematoides (NGM) inoculado com final do log OP50 Escherichia coli.</li>
		<li>Lave os vermes no prato com 1 mL de 1x tampão fosfato salino + 0,01% solução de Triton X-100 (PBST) e colocar a suspensão de worm em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifugue que os vermes a 560 x g por 1 min. remover o sobrenadante e repita este passo até Escherichia coli está desmarcado de suspensão.</li>
		<li>Adicionar 100 µ l de isopropanol 40% para a pelota de verme e incube-lo em temperatura ambiente por 3 min.</li>
		<li>Centrifugue os vermes a 560 x g por 1 min e remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento do worm. Nota: Maiores volumes de uso de PBST para lavar os vermes os pratos se usando placas maiores ou mais vermes por placa de coloração. Não lave os vermes em PBST, há mais de 15 min antes da fixação da amostra. Realize lavagens adicionais se o sobrenadante não é livre de bactérias. Realize a incubação em isopropanol 40% usando um nutator ou balancim. Sempre monitore os tubos para certificar-se de agitação da amostra completa está ocorrendo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lipídios, coloração com NR<ol>
<li>No escuro, adicione 600 µ l da solução de trabalho de NR para cada amostra. Inverter os tubos três vezes e totalmente misturar os vermes em solução NR.</li>
		<li>Gire a amostra no escuro à temperatura ambiente por 2 h.</li>
		<li>Após a incubação, centrifugue os vermes a 560 x g por 1 min e retirar o sobrenadante.</li>
		<li>Adicione 600 µ l de PBST e incubar as amostras no escuro por 30 min remover a mancha excesso de NR.</li>
		<li>Centrifugar as amostras a 560 x g por 1 min e remover todos, mas cerca de 50 µ l do sobrenadante. Nota: Incubação NR não requer agitação. Sedimentação de vermes é comum durante esta etapa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação de slides para imagens de microscópio<ol>
<li>Ressuspender o worm no sobrenadante restante.</li>
		<li>Coloque 5 µ l de suspensão de worm em um microscópio e coloque uma lamela cuidadosamente para evitar captura quaisquer bolhas de ar.</li>
		<li>Sele a lamínula com esmalte antes da imagem latente de vermes.</li>
		<li>Prepare-se apenas alguns slides de cada vez. Isso garantirá que a imagem de NR permanece constante através de amostras. A qualidade das imagens manchadas de NR diminui depois de gotículas de lipídios discreta de 6 h. são difíceis de observar e fluorescência de fundo aumenta, o que interfere com a detecção do sinal NR.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imagens de worms NR-manchado<ol>
<li>Os vermes em 5 ampliação de X para capturar vários animais por campo de visão da imagem.</li>
		<li>Alternar para ampliação de 10x para melhor quantificação dos vermes individuais.</li>
		<li>Use o canal FITC/GFP para imagem manchada de NR vermes e tente tempos de exposição diferentes para determinar as condições ideais para quantificação.</li>
		<li>Salve arquivos em formato TIF para evitar perda de dados devido à compressão. Nota: Exposição típica vezes variam de MS. 100-1000, tendo um tempo de exposição ideal, usá-lo para todas as amostras para manter a consistência da imagem latente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantificação de imagem coloração NR<ol>
<li>Upload de fotos para ImageJ. No menu suspenso de Plugins, use a função de Bio-formatos se o arquivo de imagem não é reconhecido.</li>
		<li>Na imagem menu pull-down, sob a função de pilhas, use imagens-para-Stack para criar uma pilha de imagem quando várias micrografias são comparadas.</li>
		<li>No mesmo menu suspenso, ajustar o brilho/contraste da pilha imagem e propagar alterações a todas as imagens clicando em aplicar.</li>
		<li>Emprega a ferramenta de seleção Polygon para delinear cada verme imagem e usar a função da medida sob o menu pull-down de análise para quantificar a intensidade da fluorescência emitida pelo NR.</li>
		<li>Para cada imagem, medir cinco locais de fundo e calcular a intensidade de fluorescência do fundo.</li>
		<li>Subtrair a intensidade de fluorescência de fundo de cada imagem worm usando a fórmula N = G - (A x B), onde N representa líquida fluorescência, G para fluorescência bruta, A área total worm e B para fluorescência do fundo.</li>
		<li>Para normalizar a intensidade da fluorescência pelo tamanho do verme, divida líquida fluorescência de cada worm pela sua área total. Os resultados são relatados como intensidade de fluorescência, em unidades arbitrárias (u.a.), por pixel. Nota: Evite exportar imagens em formato JPEG. Enquanto a compressão faz com que mais gerenciável para armazenar arquivos, integridade dos dados é comprometida por esse formato. Certifique-se de que todas as imagens são modificadas e analisadas de forma idêntica. Lembre-se de incluir uma barra de escala para avaliar corretamente o tamanho em diferentes ampliações. Para visualizar melhor as diferenças na intensidade de fluorescência usando o ImageJ, mudar o tipo de imagem de RGB para 8-bit e selecione fogo no menu imagem pesquisa tabelas (LUT). Isso cria uma imagem de mapa de calor em qual cor maior brilho correlaciona-se com intensidade de aumento da fluorescência.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. óleo O vermelho mancha (ORO) de lipídios
<ol><li>Preparação da solução-mãe de ORO<ol>
<li>Em um frasco de 250 mL, adicionar 500 mg de pó ORO para 100 mL de isopropanol 100% e misture bem.</li>
		<li>Uma vez preparados, armazene a solução hermeticamente fechada sem exposição.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação da solução de trabalho de ORO<ol>
<li>Dilua a solução-mãe de ORO na água (3:2), 60% de isopropanol.</li>
		<li>Antes da utilização, filtre a solução de ORO de trabalho através de um filtro de seringa estéril de acetato de celulose de 0,2 µm. Nota: Para obter melhor qualidade de solução, preparar a solução de ORO de trabalho no dia anterior e deixá-lo misturar durante a noite. No entanto, se a solução é necessário mesmo dia, diluir e misture a solução ORO sobre um roqueiro para pelo menos 2 h antes da utilização. Antes de balanço, enrole o tubo cônico em fita de parafina para evitar o vazamento da solução ORO.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação de worms para coloração de lipídios ORO<ol>
<li>Crescem os vermes a 20 ° C em meio de crescimento de nematoides (NGM) inoculado com final do log OP50 Escherichia coli ao estágio de vida desejado.</li>
		<li>Adicionar 1 mL de solução PBST à placa e agite até que todos os vermes estão no prato. Incline o prato e lave-a com 1 mL de PBST. Transferi a suspensão de minhoca para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifugue que os vermes a 560 x g por 1 min. Retire o sobrenadante sem perturbar o sedimento e repetir a lavagem passo com 1 mL de PBST três vezes. Remova todos os µ l de sobrenadante mas 100.</li>
		<li>Adicione 600 µ l de isopropanol 40% para a pelota de verme e rock-lo em temperatura ambiente por 3 min.</li>
		<li>Centrifugue os vermes em 560 x g por 30 s e remover todo o sobrenadante, mas 100 µ l sem interromper a pelota de verme. Nota: Use volumes mais elevados de PBST lavar vermes pratos se fazendo coloração de alta produtividade. Não lave vermes em PBST, há mais de 15 min antes da fixação da amostra. Fazer lavagens adicionais se o sobrenadante não é livre de bactérias. Realize a incubação em isopropanol 40% usando um nutator ou balancim. Sempre monitore os tubos para certificar-se de agitação da amostra completa está ocorrendo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lipídios, coloração com ORO<ol>
<li>Adicione solução ORO 600 µ l de cada amostra. Inverter o tubo três vezes e misturar os vermes bem no ORO.</li>
		<li>Gire as amostras em 30 rpm para 2 h à temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugar as amostras a 560 x g por 1 min e eliminar todos os µ l de sobrenadante mas 100.</li>
		<li>Resuspenda as amostras em 600 µ l de PBST e gire os tubos a 30 rpm durante 30 min remover a mancha excesso de ORO.</li>
		<li>Centrifugar as amostras a 560 x g por 1 min e eliminar tudo mas 50 µ l do sobrenadante.</li>
		<li>Para melhor distinguir a localização do germline do animal e células intestinais, mancha núcleos adicionando 1 µ l de (2-(4-amidinophenyl) - 1 H-indol-6-carboxamidine) (DAPI) para cada 1 mL de solução de trabalho de ORO. Realize ORO mancha para 2h com a adição de DAPI antes da montagem de slides para a imagem latente. Núcleos intestinais são maiores em tamanho e a gônada distingue-se pelas células germinativas em desenvolvimento. Nota: Após coloração de ORO, worms podem aderir aos lados do tubo de microcentrífuga e falhar formar um pellet perceptível. Se isso acontecer, centrifugue os vermes novamente ou permitir worms para contentar por gravidade pelo menos 10 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação dos slides para verme de imagem<ol>
<li>Resuspenda os vermes no sobrenadante restante e homogeneizar a solução.</li>
		<li>Colocar 5 µ l de suspensão de worm em um microscópio e coloque uma lamela com cuidado, garantindo que nenhum ar as bolhas se formam.</li>
		<li>Sele a lamínula com esmalte e vermes de imagem. Nota: Após fixação e coloração, vermes podem ser muito rígidas e difíceis de colocar. Para contornar isso, deixe todo o furo pipetas cortando suas dicas.</li>
		<li>Armazene os slides em um rack de microcentrífuga a 4 ° C por até 24 h, se não de imagem imediatamente depois da coloração.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imagens de worms manchadas de ORO<ol>
<li>Use uma câmera compatível com cor para vermes de imagem manchada de ORO.</li>
		<li>Use 5 ampliação de X para vários vermes em um campo de visão da imagem.</li>
		<li>Alternar para ampliação de 10x para melhor exame de vermes individuais.</li>
		<li>Exportação de imagens em formato TIF para evitar perda de dados devido à compressão. Nota: Se manchar com ORO + DAPI, ligue a câmera capaz de cor para uma que pode capturar a fluorescência.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análise de imagens de worms manchadas de ORO<ol>
<li>Envie micrograph(s) para o ImageJ. No menu suspenso de Plugins, use a função de Bio-formatos se o arquivo de imagem não é reconhecido.</li>
		<li>Na imagem menu pull-down, sob a função de pilhas, use imagens-para-Stack para criar uma pilha de imagem quando várias micrografias são comparadas.</li>
		<li>Ajuste o brilho/contraste sob o mesmo menu pull-down para melhorar a visibilidade das gotículas lipídicas.</li>
		<li>Categorize as imagens de acordo com o acúmulo de lipídios por todo o corpo do animal ou em tecidos específicos.</li>
		<li>Para melhor avaliação da localização de lipídios e para a identificação de artefatos de imagem específico usando o ImageJ, seleccionar a função de cor sob o menu pull-down de imagem e clique na pilha para RGB para mostrar os sinais de cada componente RGB.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+red:+a+selective+fluorescent+stain+for+intracellular+lipid+droplets.">Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets.</a> J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).</li><li>Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+at+a+glance.">Lipid droplets at a glance.</a> J Cell Sci. 122 (6), 749-752 (2009).</li><li>Horobin, R. W., Kiernan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Conn's biological stains: a handbook of dyes, stains and fluorochromes for use in biology and medicine. , (2002).</li><li>Hulme, S. 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Os autores declaram não há conflitos de interesse.

O aumento da obesidade e doenças metabólicas tarifas faz c. elegans , um modelo adequado para estudar os mecanismos que regulam a acumulação de gordura nas células e tecidos. Recentes sugerem que as mudanças nos níveis de lipídios são correlacionadas com processos celulares que variam de8, a ativação de receptores hormonais2, a saída reprodutivo5a sinalização de insulina. Comparado com rótulo livre microscopia e métodos de cr...

Lipídios são essenciais para a vida. Eles são componentes integrais das membranas, atuam como mensageiros secundários e Transdutores de sinal e têm funções cruciais no armazenamento de energia. Quando o metabolismo lipídico é prejudicado, leva a doenças como obesidade e diabetes tipo II, que estão pressionando as preocupações de saúde pública9. Caenorhabditis elegans (C. elegans) é um organismo modelo excelente em que para estudar o metabolismo lipídico, porque tem um ciclo de vida relativamente curto, um corpo transparente, uma linhagem de células conhecidas e um genoma completamente sequenciado. Principalmente uma hermafrodita, o c. elegans permite que os pesquisadores levantar um grande número de animais isogénicas Resumindo períodos de tempo para realizar elevado-throughput avanço genéticos telas para estudar uma grande variedade de de genes e vias metabólicas4. Esta abordagem revelou-se um elevado grau de conservação em 273 c. elegans genes de metabolismo de lipídios entre seres humanos, ratos, ratos e drosófila. Além disso, mais de 300 genes de lipídios em c. elegans tem orthologues humano que estão associados com doenças não relacionadas com síndrome metabólica11. Tradicionalmente, exame de armazenamento de lipídios em c. elegans principalmente dependeu de tingir-etiquetados ensaios, que fornecem informação robusta sobre o acúmulo de lipídios. Menos comum é uma descrição de onde localizar lipídios e medidas diferenças na abundância de lipídios através de tecidos. No entanto, o trabalho recente revelou que a distribuição de lipídios pode ser tão importante como o acúmulo de lipídios6.
Ultimamente, estudos começaram a integrar métodos como alto rendimento líquido cromatografia / espectrometria de massa (HPLC-MS), cromatografia gasosa / espectrometria de massa (GC-MS), e coerente anti-stokes microscopia de Raman espalhamento (carros) para o endereço a deficiências de mancha-abordagens analisando diretamente o conteúdo de lipídios extratos e frações lipídica específica depósitos lipídicos, respectivamente de10,11. Além disso, a microscopia de carros revelou que vermelho Nilo pode servir apenas como um proxy para o acúmulo de gordura quando usado como um corante fixador, para seu uso como uma mancha vital leva para fora do alvo coloração de organelas autofluorescente10. No entanto, os conhecimentos técnicos necessários e os custos associados a estes cromatografia e métodos de microscopia tornam a sua utilização insustentável para muitas perguntas de pesquisa. Neste artigo, discutimos um método conveniente e confiável para se fixam e manchar os depósitos de lipídios neutros em c. elegans usando Nilo vermelho e O vermelho para distinguir a abundância de lipídios em animais inteiros e em tecidos específicos de óleo.
Nilo vermelho, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, é um corante benzophenoxazone que prontamente se dissolve em diversos solventes orgânicos, mas principalmente é insolúvel em água. É um excelente lisocromo corante usado para manchar lípidos neutros como triglicérides ou ésteres de colesterol porque ele apresenta uma cor forte, solubiliza bem em lipídios, tem interação insignificante com tecidos circundantes e é menos solúveis no solvente do que no lipídios. Tem uma excitação e emissão maxima de 450-500 e 520 nm, respectivamente1. Quando Nilo manchados de vermelho c. elegans é visto por fluorescência verde, corpos lipídico discreta podem ser observados em todo o intestino e outros tecidos ou em aglomerados ou uniformemente dispersos, dependendo do genótipo do animal ou tratamento experimental 7.
O óleo vermelho é um lisocromo, corante lipossolúvel usado para manchar os triglicerídeos e lipoproteínas. Chama-se um corante azoico porque sua estrutura química contém dois grupos azo ligados a três anéis aromáticos. É difícil ionizar, que torna altamente solúvel em lipídios. Sua mancha cor é vermelha e sua absorção de luz máxima é 518 nm 3. C. elegans manchado com óleo vermelho O mostrar gotículas lipídicas vermelho destacam-se contra o corpo do animal transparente, que facilita a avaliação qualitativa da distribuição de lipídios entre diferentes tecidos6.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Imager.M2m Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERC5s camera</td>
			<td>Axiocam</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Color-capable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRm camera</td>
			<td>Axiocam</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Fluorescence-capable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N1142</td>
			<td>Lipid Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil red O</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12989</td>
			<td>Lipid Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>DNA stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1133-1LP</td>
			<td>Fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m seterile syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-477</td>
			<td>Cellulose acetate filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428000015</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Rotisserie</td>
			<td>Lab Quake</td>
			<td>400110Q</td>
			<td>Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10136-084</td>
			<td>Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7758-11-4</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-88-5</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>L9110</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3147</td>
			<td>Bacterial growth</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in caenorhabditis elegans by nile red and oil red o staining

Caenorhabditis elegans é um organismo modelo excepcional em que para estudar o metabolismo lipídico e homeostase de energia. Muitos dos seus genes de lipídios são conservados em seres humanos e estão associados com a síndrome metabólica ou outras doenças. Exame do acúmulo de lipídios neste organismo pode ser realizada por corantes fixador ou métodos livre de rótulo. Manchas de fixador como Nilo vermelho e O vermelho de óleo são maneiras de baixo custo, confiáveis para medir quantitativamente os níveis de lipídios e observar qualitativamente distribuição de lipídios através de tecidos, respectivamente. Além disso, estas manchas permitem para elevado-throughput screening de vários genes do metabolismo de lipídios e caminhos. Além disso, sua natureza hidrofóbica facilita a solubilidade lipídica, reduz a interação com tecidos circundantes e impede que a dissociação em solvente. Embora esses métodos são eficazes em examinar o teor lipídico geral, eles não fornecem informações detalhadas sobre a composição química e diversidade dos depósitos de lipídios. Para estes fins, livre de rótulo métodos tais como a microscopia de GC-MS e carros estão melhores adequado, os seus custos, não obstante.

SKN-1 é um bZip, fator de transcrição de tilacoides que compartilha homologia com mamíferos NRF2 e foi mostrado para mediar a oxidação de ácidos graxos. Dependendo da concentração de glicose em sua dieta, vermes com um alelo constitutivamente ativado skn-1 mostram níveis lipídicos diferentes quando corados com Nilo vermelho7. Figura 1A -C mostra ativado skn-1 animais expostos a condições ...

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Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Quantificação de lipídios abundância e avaliação da distribuição de lipídios em Caenorhabditis elegans por Nilo vermelho e coloração do óleo vermelho O

Nile vermelho coloração do fixo Caenorhabditis elegans é um método para a medição quantitativa de depósitos de lipídios neutros, enquanto o óleo vermelho O coloração facilita a avaliação qualitativa da distribuição de lipídios entre tecidos.

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

20.0K visualizações.  University of Southern California. Nile vermelho coloração do fixo Caenorhabditis elegans é um método para a medição quantitativa de depósitos de lipídios neutros, enquanto o óleo vermelho O coloração facilita a avaliação qualitativa da distribuição de lipídios entre tecidos.

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Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

Avaliação da Distribuição Espacial da γH2AX seguintes Radiação Ionizante

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Biologia

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

Isolamento e In vitro A ativação do Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Lapso de tempo Microscopia de embriogênese inicial em Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos: Sincronização e observação

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Extração de prostaglandina e Análise em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Medição do metabolismo energético, no tecido da retina explantado, usando análise de fluxo extracelular

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Experimental Approach to Examine Leptin Signaling in the Carotid Bodies and its Effects on Control of Breathing

An adipocyte-produced hormone leptin is a potent respiratory stimulant, which may play an important role in defending respiratory function in obesity. The carotid bodies (CB), a key organ of peripheral hypoxic sensitivity, express the long functional isoform of leptin receptor (LepRb) but the role of leptin signaling in control of breathing has not been fully elucidated. We examined the hypoxic ventilatory response (HVR) (1) in C57BL/6J mice before and after leptin infusion at baseline and after CB denervation; (2) in LepRb-deficient obese db/db mice at baseline and after LepRb overexpression in CBs. In C57BL/6J mice, leptin increased HVR and effects of leptin on HVR were abolished by CB denervation. In db/db mice, LepRb expression in CB augmented the HVR. Therefore, we conclude that leptin acts in CB to augment responses to hypoxia.

Our study focuses on the effects of leptin signaling in carotid body (CB) on the hypoxic ventilatory response (HVR). We performed &#39;loss of function&#39; experiments measuring the effect of leptin on HVR after CB denervation and &#39;gain of function&#39; experiments measuring HVR after overexpression of the leptin receptor in CB.

Abordagem experimental para examinar a sinalização de leptina nos corpos carótidas e seus efeitos sobre o controle da respiração

An adipocyte-produced hormone leptin is a potent respiratory stimulant, which may play an important role in defending respiratory function in obesity. The ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

Cotocação e gota lipídica manchando de enocitos nas larvas de Drosophila

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

Isolamento e Caracterização de Fibroblastos Cardíacos Adultos e Miofibroblastos

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

Imagem livre de rótulos da Dinâmica de Armazenamento Lipídido em Elegans caenorhabditis usando microscopia de dispersão raman estimulada

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...