Este protocolo descreve duas estratégias de suplementação lipídica com uma combinação de análise longitudinal e transcricional no organismo modelo, C.elegans. A técnica descreve como examinar as mudanças transcricionais usando poucos vermes ou tecidos de vermes dissecados e como a alimentação líquida de uma população de insetos poderia ser acoplada a técnicas hidráulicas. Os indivíduos que realizam essa técnica devem praticar a dissecção tecidual devido à curta janela de tempo para realizar o experimento para alcançar a análise transcricional adequada.
Para começar, colete as bactérias OP50 centrifugando a cultura cultivada durante a noite a 4.000 G por 10 minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante. Suspenda o pellet bacteriano em 20 mililitros de diluição bacteriana, restrição alimentar ou base BDR por vórtice e, novamente, repita a centrifugação por 10 minutos.
Depois de descartar o sobrenadante, ressuspeite o pellet bacteriano no meio BDR para preparar um estoque bacteriano 20 X BDR. Dilua o estoque bacteriano para 5X usando um meio BDR antes do uso. Usando etanol ou sulfóxido de dimetilo como solvente, prepare uma solução de estoque lipídico em um novo frasco de vidro autoclavado e encha o frasco de vidro com argônio ou nitrogênio para evitar a oxidação.
Transfira a solução de estoque lipídico para a solução de bactérias BDR para atingir a concentração final desejada nas condições de alimentação. Misture bem por vórtice por 20 segundos. Preparar o veículo controlado misturando os mesmos volumes de etanol filtrado ou sulfóxido de dimetilo com bactérias BDR.
Realizar suplementação lipídica e cultura líquida transferindo a quantidade desejada de controle lipídico ou veicular para cada poço de uma placa de 12 poços com três a quatro repetições para cada condição de alimentação. Misture a suspensão sincronizada do verme Caenorrhabditis elegans com bactérias BDR 5X em uma proporção de um para um para atingir uma concentração final de 1.500 vermes por mililitro e 2,5X para bactérias. Em seguida, transfira dois mililitros da mistura de bactérias minhocas para cada poço da placa de 12 poços.
Quando terminar, envolva a placa de 12 poços com papel alumínio e agite a placa em uma incubadora de 20 graus Celsius a 100 RPMM para o comprimento de incubação desejado. Para suplementação lipídica em placas, semeie um mililitro das bactérias condicionadas por lipídios no centro de um meio de crescimento de nematoides de 10 centímetros ou placa de ágar NGM. Certifique-se de que a solução de trabalho final seja vórtice várias vezes entre semear as duas placas ao trabalhar com um alto número de placas.
Seque a placa no escuro dentro de um exaustor de biossegurança. Transfira 3000 vermes da cultura sincronizada de minhocas para a placa de 10 centímetros. Seque a placa em um exaustor de biossegurança até que os vermes que estavam nadando nas placas suplementadas com lipídios comecem a engatinhar.
Uma vez seca, incube a placa condicionada por lipídios em uma incubadora de 20 graus Celsius pelo período de tempo desejado e, se estiver usando lipídios poli-insaturados, proteja a placa da luz. Preparar 20 microlitros de solução de lise final para cada amostra misturando 0,2 microlitros de DNase I com 19,8 microlitros de solução de lise num tubo de PCR e misturá-lo bem pipetando para cima e para baixo cinco vezes. Para extrair o RNA do pequeno número de vermes inteiros, remova as bactérias transferindo 15 a 20 vermes do gramado bacteriano para uma placa de NGM recém-semeada.
Transferir 15 a 20 vermes da placa NGM não semeada para o tubo de PCR contendo 20 microlitros da solução de lise final recém-preparada com o número mínimo de bactérias e incubar a reação de lise por cinco minutos à temperatura ambiente. Uma vez que a incubação acabou, mantenha a amostra em um bom banho de água fria e sonda sonicate os vermes quatro vezes, cinco segundos de cada vez com 30% de amplitude e pulso por 15 segundos entre cada tempo de sonicação. Incubar o tubo à temperatura ambiente durante cinco minutos antes de adicionar dois microlitros de solução de paragem à reacção de lise e misturá-lo batendo suavemente.
Incubar a reação por dois minutos à temperatura ambiente e, em seguida, colocar o tubo no gelo. Para extrair o RNA do tecido do verme, pegue cerca de 20 vermes do gramado bacteriano e coloque-os em uma placa de NGM fresca não semeada para remover as bactérias dos vermes. Transfira 20 vermes com o menor número possível de bactérias para um vidro de relógio contendo 500 microlitros de solução M9 contendo quatro levamisole micromolares.
Quando os vermes estiverem imobilizados, disseque a linha germinativa ou o intestino usando uma agulha de calibre 25 que pode ser anexada à seringa de um mililitro. Usando uma pipeta de vidro autoclavada, transfira os tecidos dissecados para o tubo de PCR e deposite o tubo no gelo por dois minutos, permitindo a deposição do material no fundo. Remova o sobrenadante do tubo de PCR antes de adicionar 20 microlitros de solução de lise final e misture-o bem batendo em toque.
Depois de incubar a reação de lise por cinco minutos, adicione dois microlitros de solução de parada e toque no tubo várias vezes. Incubar o tubo por dois minutos antes de prosseguir para a transcrição reversa. No estudo de validação, o RNA extraído de uma grande população e de alguns vermes mostrou indução semelhante dos genes de processamento de neuropeptídeos, egl-3 e egl-21.
Isso sugere que a extração de RNA de alguns vermes pode ser uma alternativa válida às técnicas padrão de síntese de CDNA de grandes populações. No intestino dissecado dos vermes transgênicos lipl-4, suplementados com ácido dihomo-gama-linolênico, ou DGLA, os genes de processamento de neuropeptídeos neuronais não foram induzidos. A suplementação de DGLA em diferentes concentrações resgatou a extensão da vida útil nos vermes após a derrubada da gordura-3.
Vermes com suplementação lipídica também podem ser processados para sequenciamento de RNA, proteômica, metabolômica e estudos comportamentais para identificar fenótipos adicionais sob essas condições específicas. Esta metodologia pode ser aplicada à pesquisa do envelhecimento, biologia lipídica e qualquer outra área de pesquisa que vise estabelecer uma relação entre um determinado fenótipo e um fator nutricional ou metabólito.
