Questo lavoro è stato reso possibile dalla concessione NIH: R01GM109028 (S.P.C)

1. Nilo rosso (NR) colorazione dei lipidi
<ol><li>Preparazione della soluzione di riserva di 5 mg/mL NR<ol>
<li>In una bottiglia da 500 mL, aggiungere 200 mL di acetone 100% 100 mg di polvere di NR.</li>
		<li>Coprire la bottiglia con foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce.</li>
		<li>Prima dell'uso, agitare la soluzione per 2 h al buio.</li>
		<li>Per uso a lungo termine, conservare la soluzione di riserva di NR in bottiglia ermeticamente senza qualsiasi esposizione alla luce. Soluzione di riserva di scala NR secondo esigenze di ricerca. Assicurarsi che la stessa soluzione di riserva è utilizzata attraverso esperimenti NR-macchiatura per ottenere la colorazione coerente e risultati di formazione immagine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione della soluzione di lavoro di NR<ol>
<li>Per ogni 1 mL di isopropanolo 40% (v/v), aggiungere 6 µ l di soluzione madre NR.</li>
		<li>Preparare 600 µ l di soluzione di lavoro di NR per ciascun campione. Nota: Assicurarsi di fresco NR lavorando soluzione proprio prima della colorazione. A seconda delle esigenze di soluzione stock di NR, utilizzare un tubo conico graduata da 50 mL o 15 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione di vermi per colorazione di NR del lipido<ol>
<li>Crescere vermi alla fase iniziale di L4 a 20 ° C il mezzo di sviluppo del nematode (NGM) seminato con tardo-registro OP50 Escherichia coli.</li>
		<li>Lavare i vermi fuori la piastra con 1 mL di soluzione tampone fosfato + 0,01% Triton X-100 (PBST) soluzione: 1x e mettere la sospensione di vite senza fine in una provetta da 1,5 mL microfuge.</li>
		<li>Centrifugare che i vermi a 560 x g per 1 min. rimuovere il surnatante e ripetere questo passaggio fino a e. coli è deselezionato dalla sospensione.</li>
		<li>Aggiungere 100 µ l di 40% isopropanolo al pellet di verme e incubare a temperatura ambiente per 3 min.</li>
		<li>Centrifugare i vermi a 560 x g per 1 min e rimuovere il supernatante senza interrompere il pellet di verme. Nota: Maggiori volumi di uso di PBST per lavare i vermi fuori le piastre se utilizzando piastre più grandi o più vermi per piastra di colorazione. Non lavare i vermi in PBST più di 15 min prima della fissazione del campione. Eseguire ulteriori lavaggi se il surnatante non viene cancellato dei batteri. Svolgere l'incubazione in 40% isopropanolo utilizzando un nutator o un rocker. Monitorare sempre i tubi per assicurarsi di agitazione di esempio completo è in corso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lipidica macchiatura con NR<ol>
<li>Nel buio, aggiungere 600 µ l di soluzione di lavoro di NR per ogni campione. Invertire i tubi tre volte e mescolare completamente i vermi in soluzione NR.</li>
		<li>Ruotare il campione al buio a temperatura ambiente per 2 h.</li>
		<li>Dopo l'incubazione, centrifugare i vermi a 560 x g per 1 min e rimuovere il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere 600 µ l di PBST e incubare i campioni al buio per 30 minuti rimuovere macchie di NR in eccesso.</li>
		<li>Centrifugare i campioni a 560 x g per 1 min e rimuovete tutti ma circa 50 µ l del surnatante. Nota: Incubazione NR non richiede agitazione. Sedimentazione di worms è comune durante questo passaggio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione dei vetrini per formazione immagine del microscopio<ol>
<li>Risospendere il pellet di verme nel surnatante rimanenti.</li>
		<li>Posto 5 µ l di sospensione di vite senza fine su un vetrino da microscopio e messo un vetrino coprioggetto con attenzione per evitare di intrappolare bolle d'aria.</li>
		<li>Sigillare il coprioggetto con lo smalto prima dell'imaging di vermi.</li>
		<li>Preparare solo un paio di diapositive alla volta. In tal modo la formazione immagine NR rimane costante attraverso campioni. La qualità delle immagini NR-macchiato diminuisce dopo 6 h. discreti del lipido goccioline sono difficili da osservare e fluorescenza di fondo aumenta, che interferisce con il rilevamento del segnale NR.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imaging di vermi NR-macchiato<ol>
<li>I vermi a ingrandimento 5x per catturare animali diversi per campo di vista dell'immagine.</li>
		<li>Passare a 10 ingrandimenti per migliore quantificazione delle singole viti senza fine.</li>
		<li>Utilizzare FITC/GFP canale immagine vermi NR-macchiato e provare tempi di esposizione differenti per determinare le condizioni ottimali per la quantificazione.</li>
		<li>Salvare i file in formato TIF per evitare di perdere dati a causa di compressione. Nota: Tempi di esposizione tipico variano da MS. 100-1000 avendo un tempo di esposizione ottimale, utilizzare per tutti i campioni per mantenere la coerenza di imaging.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantificazione di immagine colorazione NR<ol>
<li>Caricare micrografie ImageJ. Nel menu pull-down di plugin, è necessario utilizzare la funzione Bio-Formats se il file di immagine non viene riconosciuto.</li>
		<li>Nell'immagine dal menu a discesa, sotto la funzione di stack, utilizzare immagini-Stack per creare una serie di immagini quando micrografie diversi vengono confrontati.</li>
		<li>Nello stesso menu pull-down, regolare la luminosità/contrasto dello stack immagine e propagare le modifiche a tutte le immagini facendo clic su Applica.</li>
		<li>Utilizzare lo strumento di selezione poligono per delineare ogni verme imaged e utilizzare la funzione di misura sotto menu pull-down di analisi per quantificare l'intensità di fluorescenza emessa dal NR.</li>
		<li>Per ogni immagine, cinque siti di fondo di misurare e calcolare l'intensità di fluorescenza di fondo media.</li>
		<li>Sottrarre l'intensità di fluorescenza di fondo da ogni verme imaged utilizzando la formula N = G - (A x B), dove N sta per fluorescenza netto, G per fluorescenza lordo, A per area totale verme e B per fluorescenza di fondo medio.</li>
		<li>Per normalizzare l'intensità della fluorescenza di dimensione del verme, dividere il fluorescenza netto di ogni verme dalla sua superficie totale. I risultati sono riportati come intensità di fluorescenza, in unità arbitrarie (UA), al pixel. Nota: Evitare di esportare le immagini in formato JPEG. Mentre la compressione rende più gestibile per archiviare i file, l'integrità dei dati è compromessa da questo formato. Assicurarsi che tutte le immagini sono per volta e analizzate in modo identico. Ricordati di includere una barra di scala per valutare adeguatamente formato a diversi ingrandimenti. Per visualizzare meglio le differenze nell'intensità di fluorescenza usando ImageJ, cambiare il tipo di immagine da RGB a 8 bit e selezionare fuoco dal menu immagine ricerca tabelle (LUT). Questo crea un'immagine di mappa di calore nel quale colore aumentata luminosità correla con l'intensità di fluorescenza maggiore.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. olio rosso O macchiatura (ORO) dei lipidi
<ol><li>Preparazione della soluzione di riserva ORO<ol>
<li>In una bottiglia da 250 mL, aggiungere 500 mg di polvere di ORO a 100 mL di isopropanolo 100% e mescolare bene.</li>
		<li>Una volta preparato, conservare la soluzione ermeticamente chiuso con nessuna esposizione alla luce.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione della soluzione di lavoro di ORO<ol>
<li>Diluire la soluzione di riserva di ORO in acqua (3:2) al 60% di isopropanolo.</li>
		<li>Prima dell'uso, è possibile filtrare la soluzione di ORO di lavoro attraverso un filtro da 0,2 µm in acetato di cellulosa siringa sterile. Nota: Per una migliore qualità di soluzione, preparare la soluzione di lavoro ORO il giorno prima e lasciarlo mescolare durante la notte. Tuttavia, se la soluzione è necessario lo stesso giorno, diluire e mescolare la soluzione ORO su un rocker per almeno 2 h prima dell'uso. Prima a dondolo, avvolgere tubo conico in nastro di paraffina per evitare la fuoriuscita della soluzione ORO.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione di vermi per colorazione di ORO del lipido<ol>
<li>Crescere i vermi a 20 ° C il mezzo di sviluppo del nematode (NGM) seminato con tardo-registro OP50 Escherichia coli alla fase di vita desiderato.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di soluzione PBST alla piastra e agitare fino a quando tutti i vermi sono fuori la piastra. Inclinare la piastra e lavare con 1 mL di PBST. Trasferire la sospensione di vite senza fine in una provetta di microfuge 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifugare che i vermi a 560 x g per 1 min. eliminare il surnatante senza disturbare il pellet e ripetere il lavaggio passo con 1 mL di PBST tre volte. Rimuovere tutti i supernatanti ma 100 µ l.</li>
		<li>Aggiungere 600 µ l di 40% isopropanolo al pellet di verme e rock a temperatura ambiente per 3 min.</li>
		<li>Centrifugare i vermi a 560 x g per 30 s e Rimuovi tutto surnatante ma 100 µ l senza interrompere il pellet di verme. Nota: Utilizzare volumi più elevati di PBST per lavare i vermi fuori piastre se facendo macchiatura di alto-rendimento. Non lavare vermi in PBST più di 15 min prima della fissazione del campione. Fare ulteriori lavaggi se surnatante non viene cancellato dei batteri. Svolgere con incubazione in 40% isopropanolo utilizzando un nutator o un rocker. Monitorare sempre i tubi per assicurarsi di agitazione di esempio completo è in corso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lipidica macchiatura con ORO<ol>
<li>Aggiungere 600 µ l ORO lavoro soluzione a ciascun campione. Capovolgere la provetta tre volte e mescolare i vermi bene in ORO.</li>
		<li>Ruotare i campioni a 30 rpm per 2 ore a temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugare i campioni a 560 x g per 1 min ed eliminare tutti i supernatanti ma 100 µ l.</li>
		<li>Risospendere i campioni in 600 µ l di PBST e ruotare i tubi a 30 rpm per 30 min rimuovere macchie di ORO in eccesso.</li>
		<li>Centrifugare i campioni a 560 x g per 1 min ed eliminare tutti, ma 50 µ l del surnatante.</li>
		<li>Per distinguere meglio la posizione di germline cellule intestinali e dell'animale, macchia i nuclei aggiungendo 1 µ l di (2-(4-amidinophenyl) - 1H-indole-6-detto) (DAPI) per ogni 1 mL di soluzione di lavoro di ORO. Eseguire colorazione ORO per 2 h con l'aggiunta di DAPI prima del montaggio diapositive per imaging. I nuclei intestinali sono di dimensioni maggiori e la gonade si distingue per le cellule germinali in via di sviluppo. Nota: Dopo ORO macchiatura, vermi possono aderire ai lati del tubo microfuge e non riescono a formare una pallina evidente. Se questo accade, centrifugare nuovamente i vermi o consentire vermi depositarsi per gravità per almeno 10 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione delle diapositive per worm imaging<ol>
<li>Risospendere i vermi nel surnatante rimanente e mescolare bene la soluzione.</li>
		<li>Mettere 5 µ l di sospensione di vite senza fine su un vetrino da microscopio e porre un coprivetrino attentamente, assicurando che nessun aria formano delle bolle.</li>
		<li>Sigillare il coprioggetto con smalto e vermi di immagine. Nota: Dopo la fissazione e colorazione, vermi possono essere molto rigidi e difficili da dispensare. Per aggirare questo problema, rendere wide-bore pipette, tagliando loro suggerimenti.</li>
		<li>Conservare i vetrini in un rack di micro-centrifuga a 4 ° C fino a 24 ore se non imaging immediatamente dopo la colorazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imaging di vermi ORO-macchiato<ol>
<li>Utilizzare una fotocamera in grado colore alle viti senza fine ORO tinto di immagine.</li>
		<li>Utilizzare ingrandimento 5x per diversi worm in un campo di vista di immagine.</li>
		<li>Passare a ingrandimento 10x per una migliore analisi delle singole viti senza fine.</li>
		<li>Esportare le immagini in formato TIF per evitare perdita di dati dovuta alla compressione. Nota: Se la macchiatura con ORO + DAPI, accendere la fotocamera in grado colore a uno che può catturare la fluorescenza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analisi di immagini di worms ORO-macchiato<ol>
<li>Caricare micrograph(s) ImageJ. Nel menu pull-down di plugin, è necessario utilizzare la funzione Bio-Formats se il file di immagine non viene riconosciuto.</li>
		<li>Nell'immagine dal menu a discesa, sotto la funzione di stack, utilizzare immagini-Stack per creare una serie di immagini quando micrografie diversi vengono confrontati.</li>
		<li>Regolare la luminosità/contrasto sotto menu pull-down stesso per migliorare la visibilità di goccioline lipidiche.</li>
		<li>Classificare le immagini secondo l'accumulazione del lipido in tutto il corpo dell'animale o in tessuti specifici.</li>
		<li>Migliore valutazione della localizzazione del lipido e per l'identificazione di artefatti dell'immagine non specifici usando ImageJ, selezionare la funzione di colore sotto menu pull-down di immagine e fare clic su Stack in RGB per mostrare i segnali di ogni componente RGB.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

L'aumento dell'obesità e tassi di malattia metabolica rende c. elegans un modello adatto per studiare i meccanismi che regolano l'accumulo di grasso nelle cellule e tessuti. La prova recente suggerisce che i cambiamenti nei livelli di lipidi sono correlati con i processi cellulari che vanno da8, l'attivazione di recettori dell'ormone2, a capacità riproduttiva5di segnalazione dell'insulina. Rispetto ai metodi di cromatografia, Nilo rosso e ...

I lipidi sono essenziali per la vita. Essi sono parti integranti delle membrane, fungono da messaggeri secondari e trasduttori del segnale e hanno funzioni cruciali in stoccaggio di energia. Quando il metabolismo dei lipidi è dysregulated, si porta a malattie come obesità e diabete di tipo II, che sono premendo di preoccupazioni di sanità pubblica9. Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un organismo modello eccellente per studiare il metabolismo dei lipidi perché ha un ciclo di vita relativamente breve, un corpo trasparente, un lignaggio di conosciuti delle cellule e un genoma sequenziato completamente. Principalmente un ermafrodito, c. elegans permette ai ricercatori di raccogliere grandi quantità di animali isogeni in breve periodi di tempo a carryout high throughput avanti schermi genetici per studiare una vasta gamma di geni e vie metaboliche4. Questo approccio ha rivelato un alto grado di conservazione in 273 c. elegans geni di metabolismo lipidico tra gli esseri umani, topi, ratti e della drosofila. Inoltre, oltre 300 geni del lipido in c. elegans hanno orthologues umana che sono associati con le malattie non correlate alla sindrome metabolica11. Esame di immagazzinaggio del lipido in c. elegans ha per lo più tradizionalmente, tingere-contrassegnati saggi, che forniscono informazioni affidabili sull'accumulo di lipidi. Meno comune è una descrizione di dove localizzare i lipidi e le differenze misurate in abbondanza di lipidi attraverso tessuti. Tuttavia, recenti studi hanno rilevato che la distribuzione dei lipidi può essere importante come accumulo di lipidi6.
Ultimamente, gli studi hanno cominciato a integrare metodi come spettrometria liquida di cromatografia-Massachussets ad alte prestazioni (HPLC-MS), spettrometria della cromatografia-massa del gas (GC-MS), e anti-stokes coerente della microscopia Raman scattering (automobili) all'indirizzo del carenze di approcci basati su macchia analizzando direttamente il contenuto di estratti del lipido, frazioni specifiche del lipido e giacimenti del lipido, rispettivamente10,11. Inoltre, microscopia di automobili ha rivelato che red Nilo può servire solo come un proxy per accumulo di grasso quando viene utilizzato come una fissativo della tintura, per il suo uso come una macchia vitale conduce alla macchiatura fuori bersaglio di auto-fluorescente organelli10. Tuttavia, le competenze tecniche necessarie e i costi associati con questi cromatografia e microscopia Metodi rendono loro uso insostenibile per molte domande di ricerca. In questo articolo, discutiamo un metodo conveniente e affidabile per fissarsi e macchia i depositi di lipidi neutri in c. elegans utilizzando Nilo rosso e olio rosso O per distinguere l'abbondanza del lipido in animali interi e in tessuti specifici.
Rosso del Nilo, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, è un colorante benzophenoxazone che prontamente si dissolve in vari solventi organici, ma è praticamente insolubile in acqua. Si tratta di un eccellente lysochrome colorante utilizzato per macchiare lipidi neutri come trigliceridi o esteri del colesterolo perché è dotato di un colore forte, solubilizza bene in lipidi, ha trascurabile interazione con i tessuti circostanti ed è meno solubili in solvente rispetto a lipidi. Ha un'eccitazione e emissione massimi di 450-500 e 520 nm, rispettivamente1. Quando il Nilo rosso-macchiato di c. elegans è visto per fluorescenza verde, corpi discreti del lipido possono essere osservati in tutto l'intestino e altri tessuti o in cluster o uniformemente dispersi, a seconda del genotipo dell'animale o il trattamento sperimentale 7.
Olio rosso O è un lysochrome, liposolubili colorante usato per macchiare i trigliceridi e lipoproteine. Si chiama un colorante azoico perché la sua struttura chimica contiene due gruppi azoici, collegati a tre anelli aromatici. È difficile ionizzare, che lo rende altamente solubili nei lipidi. La macchia di colore è rosso e il massimo di assorbimento della luce è 518 nm 3. C. elegans macchiato con olio rosso O Visualizza le goccioline del lipido rosso che si stagliano contro il corpo trasparente dell'animale, che facilita la valutazione qualitativa della distribuzione dei lipidi tra diversi tessuti6.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Imager.M2m Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERC5s camera</td>
			<td>Axiocam</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Color-capable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRm camera</td>
			<td>Axiocam</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Fluorescence-capable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N1142</td>
			<td>Lipid Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil red O</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12989</td>
			<td>Lipid Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>DNA stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1133-1LP</td>
			<td>Fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m seterile syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-477</td>
			<td>Cellulose acetate filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428000015</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Rotisserie</td>
			<td>Lab Quake</td>
			<td>400110Q</td>
			<td>Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10136-084</td>
			<td>Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7758-11-4</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-88-5</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>L9110</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3147</td>
			<td>Bacterial growth</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in caenorhabditis elegans by nile red and oil red o staining

Caenorhabditis elegans è un organismo modello eccezionale in cui studiare il metabolismo dei lipidi e dell'omeostasi energetica. Molti dei suoi geni del lipido sono conservati negli esseri umani e sono associati con la sindrome metabolica o altre malattie. Esame di accumulazione del lipido in questo organismo può essere effettuato da coloranti fissativi o metodi privo di etichetta. Macchie di fissativo come Nilo rosso e olio rosso O sono modi poco costosi, affidabili per misurare quantitativamente i livelli di lipidi e di osservare qualitativamente distribuzione dei lipidi attraverso tessuti, rispettivamente. Inoltre, queste macchie consentono per high throughput screening di vari geni del metabolismo di lipidi e percorsi. Inoltre, loro natura idrofobica facilita la solubilità dei lipidi, riduce l'interazione con i tessuti circostanti e previene la dissociazione in solvente. Anche se questi metodi sono efficaci ad esaminare il contenuto di lipidi in generale, non forniscono informazioni dettagliate circa la composizione chimica e la diversità dei giacimenti del lipido. Per questi scopi, metodi privo di etichetta come microscopia di GC-MS e automobili sono meglio adatto, le spese in deroga.

SKN-1 è un bZip, fattore di trascrizione di cytoprotective che condivide omologia con mammiferi NRF2 ed è stato indicato per mediare l'ossidazione degli acidi grassi. A seconda della concentrazione di glucosio nella loro dieta, worm con un allele costitutivamente attivato skn-1 mostrano livelli di lipidi differenti quando macchiato con Nilo rosso7. Figura 1A -C Mostra attivato skn-1 gli animali espo...

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Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Quantificazione dell'abbondanza del lipido e valutazione della distribuzione del lipido in Caenorhabditis elegans Nilo rosso e macchie di olio rosso O

Nilo rosso macchiatura di fisso Caenorhabditis elegans è un metodo per la misurazione quantitativa dei depositi di lipidi neutri, mentre olio rosso O colorazione facilita la valutazione qualitativa della distribuzione dei lipidi fra i tessuti.

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

20.0K Views.  University of Southern California. Nilo rosso macchiatura di fisso Caenorhabditis elegans è un metodo per la misurazione quantitativa dei depositi di lipidi neutri, mentre olio rosso O colorazione facilita la valutazione qualitativa della distribuzione dei lipidi fra i tessuti.

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Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

Valutazione della distribuzione spaziale delle γH2AX seguenti radiazioni ionizzanti

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Ricerca

Biologia

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

Isolamento e In vitro Attivazione di Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Microscopia time-lapse di Embriogenesi All&#39;inizio del Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Di base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metodi: sincronizzazione e di osservazione

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Prostaglandina estrazione e l&#39;analisi in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Misurazione del metabolismo energetico in tessuto retinico Explanted usando l'analisi di flusso extracellulare

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Experimental Approach to Examine Leptin Signaling in the Carotid Bodies and its Effects on Control of Breathing

An adipocyte-produced hormone leptin is a potent respiratory stimulant, which may play an important role in defending respiratory function in obesity. The carotid bodies (CB), a key organ of peripheral hypoxic sensitivity, express the long functional isoform of leptin receptor (LepRb) but the role of leptin signaling in control of breathing has not been fully elucidated. We examined the hypoxic ventilatory response (HVR) (1) in C57BL/6J mice before and after leptin infusion at baseline and after CB denervation; (2) in LepRb-deficient obese db/db mice at baseline and after LepRb overexpression in CBs. In C57BL/6J mice, leptin increased HVR and effects of leptin on HVR were abolished by CB denervation. In db/db mice, LepRb expression in CB augmented the HVR. Therefore, we conclude that leptin acts in CB to augment responses to hypoxia.

Our study focuses on the effects of leptin signaling in carotid body (CB) on the hypoxic ventilatory response (HVR). We performed &#39;loss of function&#39; experiments measuring the effect of leptin on HVR after CB denervation and &#39;gain of function&#39; experiments measuring HVR after overexpression of the leptin receptor in CB.

Approccio sperimentale per esaminare la segnalazione di Leptina nei corpi carotidi e i suoi effetti sul controllo della respirazione

An adipocyte-produced hormone leptin is a potent respiratory stimulant, which may play an important role in defending respiratory function in obesity. The ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

Colorazione delle goccioline per nidi e lipidi degli ovociti nelle larve di Drosophila

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

Isolamento e caratterizzazione di fibroblasti cardiaci adulti e miofibroblasti

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

Imaging privo di etichette delle dinamiche di conservazione lipidica negli elegani di caenorhabditis utilizzando la microscopia a dispersione Raman stimolata

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...

Quantificazione dell'abbondanza del lipido e valutazione della distribuzione del lipido in Caenorhabditis elegans Nilo rosso e macchie di olio rosso O

Riepilogo

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