Este trabajo fue posible por la concesión de NIH: R01GM109028 (criador)

1. el Nilo rojo (NR) tinción de lípidos
<ol><li>Preparación de solución 5 mg/mL NR<ol>
<li>En una botella de 500 mL, añadir 100 mg de polvo NR a 200 mL de acetona al 100%.</li>
		<li>Cubrir la botella con papel de aluminio para evitar cualquier exposición a la luz.</li>
		<li>Antes de usar, agitar la solución durante 2 h en la oscuridad.</li>
		<li>Para uso a largo plazo, guarde la solución NR en un frasco bien sellado sin ninguna exposición a la luz. Solución madre de escala NR según las necesidades de investigación. Asegúrese de que la misma solución se utiliza en experimentos NR-coloración para obtener coloración consistente y resultados de la proyección de imagen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de solución de trabajo NR<ol>
<li>Por cada 1 mL de isopropanol al 40% (v/v), añadir 6 μl de solución stock de NR.</li>
		<li>Preparar 600 μl de solución de trabajo NR para cada muestra. Nota: Asegúrese de NR fresco derecho solución de trabajo antes de la tinción. Según necesidades de la solución madre de NR, utilice un tubo cónico aforado de 50 mL o 15 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de gusanos para la tinción de lípidos NR<ol>
<li>Crecer gusanos a etapa temprana de la L4 a 20 ° C en medio del crecimiento de nematodos (NGM) sembrado con fines registro OP50 e. coli.</li>
		<li>Lavar los gusanos la placa con 1 mL de 1 x solución salina con tampón fosfato + solución al 0.01% Tritón X-100 (SAFT) y la suspensión de gusano en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
		<li>Centrífuga de que los gusanos a 560 x g durante 1 minuto retirar el sobrenadante y repetir este paso hasta que e. coli se borra de la suspensión.</li>
		<li>Añadir 100 μl de isopropanol al 40% para el pellet de gusano e incubar a temperatura ambiente durante 3 minutos.</li>
		<li>Centrifugue los gusanos a 560 x g durante 1 min y retirar el sobrenadante sin interrumpir la pelotilla del gusano. Nota: Volúmenes más altos de uso de SAFT para lavar los gusanos de las placas si usando las placas de mayor tamaño o coloración más gusanos por placa. No lave los gusanos en SAFT más que 15 min antes de la fijación de la muestra. Realizar lavados adicionales si no se elimina el sobrenadante de las bacterias. Llevar a cabo la incubación en isopropanol al 40% usando un nutator o balancín. Siempre controlar los tubos para asegurarse de que está produciendo agitación de lleno de la muestra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lípidos tinción con NR<ol>
<li>En la oscuridad, añadir 600 μl de solución de trabajo NR a cada muestra. Invertir los tubos tres veces y mezclar completamente los gusanos en la solución NR.</li>
		<li>Girar la muestra en la oscuridad a temperatura ambiente durante 2 h.</li>
		<li>Después de la incubación, centrifugar los gusanos a 560 x g durante 1 minuto y eliminar el sobrenadante.</li>
		<li>Añadir 600 μl de Saft e incubar las muestras en la oscuridad durante 30 minutos remover exceso mancha NR.</li>
		<li>Centrifugar las muestras a 560 x g durante 1 min y quitar todo pero aproximadamente 50 μl de sobrenadante. Nota: Incubación NR no requiere agitación. Adaptación de gusanos es común durante esta etapa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de transparencias para proyección de imagen de microscopio<ol>
<li>Resuspender el precipitado de gusano en el sobrenadante restante.</li>
		<li>Colocar 5 μl de la suspensión de gusano en un portaobjetos y un cubreobjetos en cuidadosamente para evitar atrapar burbujas de aire.</li>
		<li>Sellar el cubreobjetos con esmalte de uñas antes de gusanos la proyección de imagen.</li>
		<li>Preparar sólo unas diapositivas a la vez. Esto garantizará la proyección de imagen NR es constante a través de las muestras. La calidad de imágenes teñidas de NR disminuye después de 6 h. discreto lípido gotitas son difíciles de observar y aumenta la fluorescencia del fondo, que interfiere con la detección de señal NR.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Proyección de imagen de gusanos NR-manchado<ol>
<li>Imagen de los gusanos en el aumento de 5 X para capturar a varios animales por el campo de visión.</li>
		<li>Cambiar a 10 aumentos para la mejor cuantificación de los gusanos.</li>
		<li>Utilice FITC/GFP canal imagen gusanos NR-manchadas y tiempos de exposición diferentes para determinar las condiciones óptimas para la cuantificación.</li>
		<li>Guardar archivos en formato TIF para evitar perder datos debido a la compresión. Nota: Exposición típica veces desde el 100-1000 Sra. teniendo un tiempo de exposición óptima, utilizarlo para todas las muestras para mantener la coherencia de imagen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cuantificación de imagen tinción NR<ol>
<li>Subir imágenes a ImageJ. En el menú desplegable de Plugins, utilice la función Bio-formatos si no se reconoce el archivo de imagen.</li>
		<li>En el menú desplegable de imagen, bajo la función de pilas, utilizar pila de imágenes para crear una pila de imagen cuando se comparan varias imágenes.</li>
		<li>En el mismo menú desplegable, ajustar brillo y contraste de la pila de la imagen y propagar los cambios a todas las imágenes haciendo clic en aplicar.</li>
		<li>Emplear la herramienta de selección de polígono para delinear cada gusano imagen y utilice la función de medida del menú desplegable de análisis para cuantificar la intensidad de la fluorescencia emitida por NR.</li>
		<li>Para cada imagen, medir cinco localidades de fondo y calcular la intensidad de la fluorescencia de fondo promedio.</li>
		<li>Restar la intensidad de la fluorescencia de fondo de cada gusano reflejada mediante la fórmula N = G - (A x B), donde N es neta fluorescencia, G para fluorescencia bruta, A para el área total de gusano y B por fluorescencia del fondo promedio.</li>
		<li>Para normalizar la intensidad de fluorescencia por el tamaño del gusano, dividir fluorescencia neto de cada gusano por su área total. Los resultados se informan como intensidad de la fluorescencia en unidades arbitrarias (a.u.) por píxel. Nota: Evitar exportar imágenes en formato JPEG. Mientras que la compresión hace archivos más manejables para almacenar, integridad de los datos se ve comprometida por este formato. Asegúrese de que todas las imágenes se modifican y analizadas idénticamente. Recuerde incluir una barra de escala para evaluar adecuadamente el tamaño en diferentes aumentos. Para visualizar mejor las diferencias en la intensidad de fluorescencia con ImageJ, cambiar el tipo de imagen de RGB a 8 bits y seleccione fuego desde el menú de tablas (LUT) de búsqueda de imagen. Esto crea una imagen de mapa de calor en el color que mayor brillo se correlaciona con la intensidad creciente de la fluorescencia.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. aceite rojo O manchas (ORO) de lípidos
<ol><li>Preparación de solución madre de ORO<ol>
<li>En una botella de 250 mL, Añadir 500 mg de polvo ORO a 100 mL de isopropanol al 100% y mezclar bien.</li>
		<li>Una vez preparado, guarde la solución cerrada con ninguna exposición a la luz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de solución de trabajo de ORO<ol>
<li>Diluir solución stock de ORO en agua (3:2) isopropanol al 60%.</li>
		<li>Antes de usar, filtrar la solución de trabajo de ORO a través de un filtro de jeringa estéril de acetato de celulosa de 0,2 μm. Nota: Para mejor calidad de la solución, preparar solución de trabajo de ORO el día antes y deje mezclar durante la noche. Sin embargo, si la solución es mismo día necesario, diluir y mezclar ORO solución en un rockero durante al menos 2 h antes de su uso. Antes de mecedora, envuelva el tubo cónico en las cintas de parafina para evitar la salida de la solución ORO.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de gusanos para la tinción de lípidos ORO<ol>
<li>Crecen los gusanos a 20 ° C en medio del crecimiento de nematodos (NGM) sembradas con fines registro OP50 e. coli a la etapa de la vida deseada.</li>
		<li>Añadir 1 mL de solución de SAFT a la placa y agitar hasta que los gusanos están fuera de la placa. Incline la placa y lavar con 1 mL de SAFT. Transferir la suspensión de gusano a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
		<li>Centrífuga de que los gusanos a 560 x g durante 1 minuto sacar el sobrenadante sin perturbar el pellet y repetir el lavado paso con 1 mL de SAFT tres veces. Quitar todo flotante pero 100 μl.</li>
		<li>Añadir 600 μl de isopropanol al 40% para el pellet de gusano y el rock a temperatura ambiente durante 3 minutos.</li>
		<li>Centrifugue los gusanos en 560 x g durante 30 s y quite todo flotante pero 100 μl sin perturbar el pellet de gusano. Nota: Use mayores volúmenes de SAFT para lavar gusanos de placas si la coloración de alto rendimiento. No lave los gusanos en SAFT más que 15 min antes de la fijación de la muestra. Hacer lavados adicionales si no se elimina el sobrenadante de las bacterias. Llevar a cabo la incubación en isopropanol al 40% usando un nutator o balancín. Siempre controlar los tubos para asegurarse de que está produciendo agitación de lleno de la muestra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lípidos tinción con ORO<ol>
<li>Añadir solución de trabajo de ORO de 600 μl de cada muestra. Invertir el tubo tres veces y mezclar los gusanos bien en ORO.</li>
		<li>Rotar las muestras a 30 rpm por 2 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugar las muestras a 560 x g durante 1 min y eliminar todo flotante pero 100 μl.</li>
		<li>Resuspender las muestras en 600 μl de Saft y gire los tubos a 30 rpm por 30 min eliminar exceso mancha ORO.</li>
		<li>Centrifugar las muestras a 560 x g durante 1 min y eliminar todo pero 50 μl del sobrenadante.</li>
		<li>Para distinguir mejor la ubicación de la línea germinal y células intestinales del animal, la mancha núcleos mediante la adición de 1 μl de (2-(4-amidinophenyl) - 1 H-indol-6-carboxamidine) (DAPI) para cada 1 mL de solución de trabajo de ORO. Realizar coloración de ORO por 2 h con la adición de DAPI antes del montaje de diapositivas para la proyección de imagen. Núcleos intestinales son más grandes en tamaño y la gónada se distingue por las células germinales en desarrollo. Nota: Después de la coloración de ORO, gusanos pueden adherirse a los lados del tubo de microcentrífuga y no formar un pellet sensible. Si esto sucede, centrifugar los gusanos otra vez o permitir gusanos a asentarse por gravedad durante al menos 10 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de las diapositivas para la proyección de imagen del gusano<ol>
<li>Suspender los gusanos en el sobrenadante restante y mezcle bien la solución.</li>
		<li>Poner 5 μl de la suspensión de gusano en un portaobjetos y coloque un cubreobjetos cuidadosamente, asegurando que ningunas burbujas de aire forma.</li>
		<li>El cubreobjetos con esmalte de uñas y gusanos de la imagen del sello. Nota: Después de la fijación y tinción, gusanos pueden ser muy rígido y difícil de pipetear. Para evitar esto, asegúrese de pipetas ancha cortando sus consejos.</li>
		<li>Almacenar las diapositivas en un rack de microcentrífuga a 4 ° C hasta 24 horas si no de imágenes inmediatamente después de la tinción.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Proyección de imagen de gusanos teñidos de ORO<ol>
<li>Utilice una cámara compatible con color a los gusanos de ORO manchado de imagen.</li>
		<li>Utilice 5 aumentos para varios gusanos en un campo de visión de la imagen.</li>
		<li>Cambiar a 10 aumentos para mejor examen de los gusanos.</li>
		<li>Exportar imágenes en formato TIF para evitar pérdida de datos debido a la compresión. Nota: Si la coloración con ORO + DAPI, cambiar la cámara color a uno que puede captar la fluorescencia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análisis de imagen de gusanos teñidos de ORO<ol>
<li>Cargar micrograph(s) en ImageJ. En el menú desplegable de Plugins, utilice la función Bio-formatos si no se reconoce el archivo de imagen.</li>
		<li>En el menú desplegable de imagen, bajo la función de pilas, utilizar pila de imágenes para crear una pila de imagen cuando se comparan varias imágenes.</li>
		<li>Ajustar brillo y contraste en el mismo menú desplegable para mejorar la visibilidad de las gotitas de lípidos.</li>
		<li>Clasificar las imágenes según la acumulación de lípidos en el cuerpo del animal o en tejidos específicos.</li>
		<li>Para la mejor evaluación de la localización de los lípidos y para la identificación de los artefactos de imagen inespecífica con ImageJ, seleccionar la función de Color en el menú desplegable de imagen y haga clic en pila de RGB para mostrar las señales de cada componente RGB.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+red:+a+selective+fluorescent+stain+for+intracellular+lipid+droplets.">Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets.</a> J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).</li><li>Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+at+a+glance.">Lipid droplets at a glance.</a> J Cell Sci. 122 (6), 749-752 (2009).</li><li>Horobin, R. W., Kiernan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Conn's biological stains: a handbook of dyes, stains and fluorochromes for use in biology and medicine. , (2002).</li><li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+the+worm:+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research.">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angew Chem Int Edit. 50 (21), 4774-4807 (2011).</li><li>Khanna, A., Johnson, D. L., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+for+mafr-1+in+reproduction+and+lipid+homeostasis.">Physiological roles for mafr-1 in reproduction and lipid homeostasis.</a> Cell Rep. 9 (6), 2180-2191 (2014).</li><li>Lynn, D. A., Dalton, H. M., Sowa, J. N., Wang, M. C., Soukas, A. A., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omega-3+and-6+fatty+acids+allocate+somatic+and+germline+lipids+to+ensure+fitness+during+nutrient+and+oxidative+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Omega-3 and-6 fatty acids allocate somatic and germline lipids to ensure fitness during nutrient and oxidative stress in Caenorhabditis elegans.</a> P Natl Acad Sci USA. 112 (50), 15378-15383 (2015).</li><li>Pang, S., Lynn, D. A., Lo, J. Y., Paek, J., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKN-1+and+Nrf2+couples+proline+catabolism+with+lipid+metabolism+during+nutrient+deprivation.">SKN-1 and Nrf2 couples proline catabolism with lipid metabolism during nutrient deprivation.</a> Nat Commun. 5, (2014).</li><li>Saltiel, A. R., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+signalling+and+the+regulation+of+glucose+and+lipid+metabolism.">Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism.</a> Nature. 414 (6865), 799-806 (2001).</li><li>Witting, M., Schmitt-Kopplin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+lipidome:+A+primer+for+lipid+analysis+in+Caenorhabditis+elegans.">The Caenorhabditis elegans lipidome: A primer for lipid analysis in Caenorhabditis elegans.</a> Arch Biochem Biophys. 589, 27-37 (2016).</li><li>Yen, K., Le, T. T., Bansal, A., Narasimhan, S. D., Cheng, J. X., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+fat+storage+quantitation+in+nematode+Caenorhabditis+elegans+using+label+and+label-free+methods.">A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods.</a> PloS One. 5 (9), e12810 (2010).</li><li>Zhang, Y., Zou, X., Ding, Y., Wang, H., Wu, X., Liang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+and+functional+study+of+lipid+metabolic+genes+in+Caenorhabditis+elegans.">Comparative genomics and functional study of lipid metabolic genes in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Genomics. 14 (1), 164 (2013).</li><li>Folick, A., Min, W., Wang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+lipid+dynamics+using+Coherent+Anti-stokes+Raman+Scattering+(CARS)+and+Stimulated+Raman+Scattering+(SRS)+microscopy.">Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy.</a> Curr Opin Genet Dev. 21 (5), 585-590 (2011).</li><li>Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+high+throughput+microscopic+assessment+of+fat+mass+in+Caenorhabditis+elegans.">Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans.</a> J Vis Exp. (73), (2013).</li><li>O'Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+major+fats+are+stored+in+vesicles+distinct+from+lysosome-related+organelles.">C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles.</a> Cell Metab. 10 (5), 430-435 (2009).</li></ol>

Los autores no declaran conflictos de interés.

El aumento de la obesidad y las tasas de enfermedad metabólica hace que C. elegans un modelo adecuado para estudiar los mecanismos que regulan la acumulación de grasa en las células y tejidos. La evidencia reciente sugiere que los cambios en los niveles de lípidos están correlacionados con los procesos celulares que van desde8, la activación de la hormona receptores2, salida reproductiva5de señalización de la insulina. En comparació...

Los lípidos son esenciales para la vida. Son componentes integrales de las membranas, actúan como mensajeros secundarios y transductores de señales y tienen funciones cruciales en almacenamiento de energía. Cuando el metabolismo lipídico se altera, conduce a enfermedades como obesidad y diabetes tipo II, que están presionando de preocupaciones de salud pública9. Elegans de Caenorhabditis (C. elegans) es un organismo modelo excelente estudiar el metabolismo de los lípidos ya que tiene un ciclo de vida relativamente corto, un cuerpo transparente, un linaje de la célula conocidos y un genoma completamente secuenciado. Principalmente un hermafrodita C. elegans permite a los investigadores levantar grandes cantidades de animales isogénicas en breve períodos de tiempo a realizar alto rendimiento adelantados pantallas genéticas para estudiar una amplia gama de genes y rutas metabólicas4. Este enfoque ha revelado un alto grado de conservación de genes de metabolismo de lípido de C. elegans 273 entre los seres humanos, ratones, ratas y drosophila. Además, más de 300 genes de lípido en C. elegans tienen orthologues humano que están asociadas con enfermedades no relacionadas con el síndrome metabólico11. Tradicionalmente, examen del almacenaje del lípido en C. elegans ha dependido sobre todo de ensayos marcados con tinte, que proporcionan información confiable sobre la acumulación de lípidos. Menos común es una descripción de donde localización los lípidos y medidas diferencias en abundancia de lípidos en los tejidos. Sin embargo, trabajo reciente ha revelado que la distribución de lípidos puede ser tan importante como la acumulación de lípidos6.
Últimamente, los estudios han comenzado a integrar métodos tales como alto rendimiento líquido cromatografía-espectrometría de masas (HPLC-MS), cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), y anti-stokes coherente microscopia de Raman dispersión (coches) a la dirección del deficiencias de los enfoques basados en la mancha analizando directamente el contenido de extractos de lípidos y fracciones de lípidos específicos depósitos de lípido, respectivamente10,11. Por otra parte, microscopia de coches ha revelado que el rojo Nilo sólo puede servir como un proxy para la acumulación de grasa cuando se utiliza como un colorante fijador, para su uso como una tinción vital conduce al objetivo de tinción de organelos fluorescentes auto10. Sin embargo, los conocimientos técnicos requeridos y los costos asociados con estos cromatografía y los métodos de microscopía hacen su uso insostenible para muchas preguntas de investigación. En este artículo, discutimos un método conveniente y confiable para fijar y depósitos de lípidos neutros en C. elegans con Nilo rojo de la mancha y aceite O rojo para distinguir la abundancia de lípidos en animales enteros y en tejidos específicos.
Nilo rojo, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, es un tinte benzophenoxazone que fácilmente se disuelve en disolventes orgánicos varios, pero sobre todo es insoluble en agua. Es un excelente lysochrome colorante utilizado para teñir lípidos neutros como los triglicéridos o ésteres de colesterol ya que cuenta con un color fuerte, solubiliza bien en lípidos tiene insignificante interacción con los tejidos circundantes y es menos solubles en el solvente que en lípidos. Tiene una máxima excitación y de emisión de 450-500 y 520 nm, respectivamente1. Cuando Nilo teñido de rojo C. elegans para la fluorescencia verde, cuerpos lípidos discreta pueden ser observados a lo largo del intestino y otros tejidos ya sea en grupos o disperse uniformemente, dependiendo del genotipo del animal o el tratamiento experimental 7.
Aceite rojo O es a lysochrome, soluble en la grasa colorante utilizado para teñir los triglicéridos y las lipoproteínas. Se llama un colorante azo porque su estructura química contiene dos grupos azo a tres anillos aromáticos. Es difícil ionizar, que hace que sea altamente soluble en lípidos. Su color de tinte es rojo y su absorción de la luz máxima es 518 nm 3. C. elegans manchado con aceite O rojo muestran gotas lipídicas rojo que destacan contra el cuerpo del animal transparente, que facilita la evaluación cualitativa de la distribución de lípidos entre los tejidos diferentes6.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Imager.M2m Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERC5s camera</td>
			<td>Axiocam</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Color-capable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRm camera</td>
			<td>Axiocam</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Fluorescence-capable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N1142</td>
			<td>Lipid Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil red O</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12989</td>
			<td>Lipid Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>DNA stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1133-1LP</td>
			<td>Fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m seterile syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-477</td>
			<td>Cellulose acetate filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428000015</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Rotisserie</td>
			<td>Lab Quake</td>
			<td>400110Q</td>
			<td>Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10136-084</td>
			<td>Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7758-11-4</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-88-5</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>L9110</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3147</td>
			<td>Bacterial growth</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in caenorhabditis elegans by nile red and oil red o staining

Caenorhabditis elegans es un organismo modelo excepcional en el que estudiar el metabolismo de los lípidos y la homeostasis de la energía. Muchos de sus genes de lípidos se conservan en los seres humanos y están asociados con el síndrome metabólico u otras enfermedades. Examen de la acumulación de lípidos en este organismo puede realizarse por fijadores colorantes o métodos libres de etiqueta. Manchas de fijador como Nilo rojo y aceite O rojo son maneras baratas, confiables para medir cuantitativamente los niveles de lípidos y observar cualitativamente la distribución de lípidos a través de los tejidos, respectivamente. Por otra parte, estas manchas permiten proyección de alto rendimiento de varios genes del metabolismo de lípidos y vías. Además, su carácter hidrofóbico facilita la solubilidad en lípidos, reduce la interacción con los tejidos circundantes y evita la disociación en el solvente. Aunque estos métodos son eficaces en el examen de contenido lipídico general, no proporcionan toda la información sobre la composición química y la diversidad de los depósitos de lípidos. Para estos propósitos, métodos libres de etiqueta tales como microscopia de GC-MS y los coches son mejores satisfecho, sus costos no obstante.

SKN-1 es un bZip, factor de transcripción de cytoprotective que comparte homología con NRF2 mamíferos y se ha demostrado para mediar la oxidación de los ácidos grasos. Dependiendo de la concentración de glucosa en su dieta, gusanos con un alelo activado constitutivamente skn-1 muestran los niveles de lípidos diferentes cuando manchados con rojo Nilo7. Figura 1A -C muestra activado skn-1 animale...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining at JoVE.com

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Cuantificación de lípidos abundancia y evaluación de la distribución de lípidos en Caenorhabditis elegans por Nilo rojo y aceite rojo O manchas

Nilo rojo de fijo Caenorhabditis elegans es un método para la medición cuantitativa de los depósitos de lípidos neutros, mientras que el aceite rojo O tinción facilita la evaluación cualitativa de la distribución de lípidos entre los tejidos.

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

quantification-lipid-abundance-evaluation-lipid-distribution

Research

JoVE Journal

Biology

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

20.0K vistas.  University of Southern California. Nilo rojo de fijo Caenorhabditis elegans es un método para la medición cuantitativa de los depósitos de lípidos neutros, mientras que el aceite rojo O tinción facilita la evaluación cualitativa de la distribución de lípidos entre los tejidos.

Video: Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

Evaluación de la distribución espacial de la radiación ionizante γH2AX siguientes

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Investigación

Biología

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

El aislamiento y la In vitro La activación de Caenorhabditis elegans El esperma

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Time-lapse microscopía de embriogénesis temprana en Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos de sincronización y de observación

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Extracción y análisis de prostaglandina en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Medición del metabolismo energético en el tejido retiniano Explanted utilizando el análisis de flujo extracelular

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Experimental Approach to Examine Leptin Signaling in the Carotid Bodies and its Effects on Control of Breathing

An adipocyte-produced hormone leptin is a potent respiratory stimulant, which may play an important role in defending respiratory function in obesity. The carotid bodies (CB), a key organ of peripheral hypoxic sensitivity, express the long functional isoform of leptin receptor (LepRb) but the role of leptin signaling in control of breathing has not been fully elucidated. We examined the hypoxic ventilatory response (HVR) (1) in C57BL/6J mice before and after leptin infusion at baseline and after CB denervation; (2) in LepRb-deficient obese db/db mice at baseline and after LepRb overexpression in CBs. In C57BL/6J mice, leptin increased HVR and effects of leptin on HVR were abolished by CB denervation. In db/db mice, LepRb expression in CB augmented the HVR. Therefore, we conclude that leptin acts in CB to augment responses to hypoxia.

Our study focuses on the effects of leptin signaling in carotid body (CB) on the hypoxic ventilatory response (HVR). We performed &#39;loss of function&#39; experiments measuring the effect of leptin on HVR after CB denervation and &#39;gain of function&#39; experiments measuring HVR after overexpression of the leptin receptor in CB.

Enfoque Experimental para Examinar la Señalización de la leptina en los cuerpos carótidos y sus efectos en el control de la respiración

An adipocyte-produced hormone leptin is a potent respiratory stimulant, which may play an important role in defending respiratory function in obesity. The ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

Disección y tinción de gotas de lípidos de los ovenocitos en larvas de Drosophila

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

Aislamiento y caracterización de fibroblastos cardíacos adultos y miofibroblastos

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

Imágenes Libres De Etiquetas De La Dinámica De Almacenamiento De Lípidos En Caenorhabditis elegans Usando Microscopía De Dispersión Raman Estimulada

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...