이 작품 NIH 교부 금에 의해 가능 하 게 되었다: R01GM109028 (S.P.C.)

1. 나 일 빨강 (NR) 지질의 얼룩
<ol><li>5 mg/mL NR 재고 솔루션의 준비<ol>
<li>500 mL 병에서 NR 분말의 100 mg 100% 아세톤의 200 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>빛을 모든 노출을 피하기 위해 알루미늄 호 일 병을 커버.</li>
		<li>사용 하기 전에 어둠 속에서 2 시간에 대 한 솔루션을 저 어.</li>
		<li>장기 사용에 대 한 어떤 빛 노출 없이 단단히 밀봉된 병에 NR 재고 솔루션을 저장 합니다. 연구의 필요에 따라 NR 재고 솔루션을 확장 합니다. 동일한 재고 솔루션은 일관 된 얼룩 및 이미징 결과 NR 얼룩 실험에서 사용 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NR 작업 솔루션의 준비<ol>
<li>40% 소 프로 파 놀 (v/v)의 모든 1 ml NR 재고 솔루션의 6 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>각 샘플에 대 한 NR 작업 솔루션의 600 µ L를 준비 합니다. 참고: 신선한 NR 솔루션 오른쪽 얼룩이 지기 전에 작업을 확인 합니다. NR 재고 솔루션 요구에 따라 15 mL 또는 졸업 50 mL 원뿔 튜브를 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NR 지질 얼룩에 대 한 벌레의 준비<ol>
<li>선 충 류 성장 매체 (NGM) 시드 후반 로그 OP50 대장균과 20 ° C에서 초기 L4 단계에 벌레를 성장.</li>
		<li>인산 염 버퍼 식 염 수 + 0.01% 트라이 톤 X-100 (PBST) 솔루션 x 1의 1 mL와 함께 접시에서 벌레를 세척 하 고 웜 현 탁 액 1.5 mL microfuge 관에 넣어.</li>
		<li>560 x g 1 분에 벌레 제거 반복 대장균 까지이 단계를 삭제 하 고 상쾌한 현 탁 액에서 원심 분리기.</li>
		<li>웜 펠 릿을 40% 소 프로 파 놀의 100 µ L을 추가 하 고 3 분 동안 실내 온도에 그것을 품 어.</li>
		<li>560 x g 1 분 동안에 벌레를 원심 고 웜 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한을 제거 합니다. 참고: 경우 판에서 벌레를 세척 하는 PBST의 높은 볼륨 사용 큰 접시를 사용 하 여 또는 접시 당 더 많은 벌레를 얼룩. PBST에서 보다 더 15 분 샘플 고정 전에 벌레를 씻지 않는. 수행 추가 세척은 상쾌한 박테리아의 지워지지 않습니다. Nutator 또는 로커를 사용 하 여 40% 소 프로 파 놀에 보육을 실시 합니다. 항상 전체 샘플 동요 발생 되도록 튜브 모니터링 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nr 얼룩 지질<ol>
<li>어둠 속에서, 각 샘플에 NR 작업 솔루션의 600 µ L를 추가 합니다. 반전 튜브 세 번 하 고 NR 솔루션에서 벌레를 완벽 하 게 혼합.</li>
		<li>2 시간에 대 한 실 온에서 어둠 속에서 샘플을 회전 합니다.</li>
		<li>외피, 다음 1 분 동안 560 x g 에서 벌레를 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>PBST의 600 µ L을 추가 하 고 30 분 초과 NR 얼룩 제거에 대 한 어둠 속에서 샘플을 품 어.</li>
		<li>560 x g 1 분에 샘플 원심 고 상쾌한의 약 50 µ L를 제외한 모든 제거 하십시오. 참고: NR 인큐베이션 동요를 필요 하지 않습니다. 벌레의 정착은이 단계 동안 일반적 이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>현미경 이미징에 대 한 슬라이드의 준비<ol>
<li>나머지 상쾌한에 웜 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>현미경 슬라이드에 벌레 서 스 펜 션의 5 µ L을 놓고 신중 하 게 트래핑 어떤 공기 방울을 피하기 위해 하는 coverslip 넣어 합니다.</li>
		<li>벌레를 이미징 하기 전에 매니큐어와 coverslip 인감.</li>
		<li>한 번에 단지 몇 가지 슬라이드를 준비 합니다. 이렇게 하면 NR 이미징 일정 하 게 유지 샘플에서. NR 스테인드 이미지의 품질에는 6 헤 이산 지질 방울 관찰 하기 곤란 하다 며 배경 형광, NR 신호 검출을 방해는 감소 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NR 얼룩진 벌레의 이미징<ol>
<li>보기의 필드 당 여러 동물을 잡으려고 5 배 확대에 벌레 이미지.</li>
		<li>개별 벌레의 더 나은 정량화에 대 한 10 배 확대로 전환.</li>
		<li>FITC/GFP 채널을 사용 하 여 이미지 NR 스테인드 웜 및 정량화에 대 한 최적의 조건을 결정 하기 위해 다른 노출 시간을 시도.</li>
		<li>압축으로 인해 데이터 손실을 방지 하려면 TIF 형식으로 파일을 저장 합니다. 참고: 일반적인 노출 시간 100-1000 양 최적의 노출 시간에 이르기까지, 모든 샘플에 대 한 그것을 사용 하 여 이미징 일관성을 유지 하.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NR 얼룩 이미지 정량화<ol>
<li>ImageJ를 현미경을 업로드. 플러그인 풀 다운 메뉴에서 이미지 파일 인식 되지 않으면 바이오 형식 함수를 사용 합니다.</li>
		<li>스택 함수에서 이미지 풀 다운 메뉴에서 이미지 스택 사용 하 여 여러 현미경을 비교 하면 이미지 스택을 만듭니다.</li>
		<li>같은 풀 다운 메뉴에서 이미지 스택의 밝기/대비를 조정 하 고 적용을 클릭 하 여 모든 이미지에 변경 내용을 전파 합니다.</li>
		<li>각 이미지 웜 윤곽을 그리 다 하는 NR에서 방출 되는 형광 강도 계량 분석 풀 다운 메뉴에서 측정 함수를 사용 하 여 다각형 선택 도구를 사용 합니다.</li>
		<li>각 이미지에 대 한 5 개의 배경 위치를 측정 하 고 평균 배경 형광 강도 계산 합니다.</li>
		<li>수식 N을 사용 하 여 각 이미지 웜으로부터 배경 형광 강도 빼기 = G-(A x B), N 순 형광, 총 형광에 대 한 G, 총 웜 지역 A와 B 평균 배경 형광에 대 한 의미.</li>
		<li>웜 크기에 의해 형광 강도 정상화 하려면 각 벌레의 전체 면적에 의해 net 형광을 나눕니다. 결과 형광 강도, 픽셀 당 임의의 단위 (거리)으로 보고 됩니다. 참고: JPEG 형식으로 이미지를 수출 하지 마십시오. 압축 파일 저장을 더 관리 하면,이 형식에 의해 데이터 무결성 손상 됩니다. 모든 이미지 수정 및 동일 하 게 분석 다는 것을 확인 하십시오. 제대로 다른 배율에서 크기를 평가 하는 눈금 막대를 포함 하도록 하십시오. ImageJ를 사용 하 여 형광 강도 차이 더 나은 시각화 하려면 8 비트 RGB에서 이미지 형식을 전환 하 고 이미지 룩 업 테이블 (LUT) 메뉴에서 화재를 선택 합니다. 이 증가 색상 밝기 증가 형광 강도 상관 열 맵 이미지를 만듭니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 석유 지질 빨간 O 얼룩 (오로)
<ol><li>오로 재고 솔루션의 준비<ol>
<li>250 mL 병에서 100% 소 프로 파 놀의 100 mL를 오로 가루 500 밀리 그램을 추가 하 고 잘 혼합.</li>
		<li>일단 준비, 단단히 빛 노출 없이 밀봉 하는 솔루션을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>오로 작업 솔루션의 준비<ol>
<li>60% 소 프로 파 놀에 물 (3:2) 오로 재고 솔루션을 희석.</li>
		<li>사용 하기 전에 작업 오로 솔루션 0.2 µ m 셀 루 로스 아세테이트 멸 균 주사기 필터를 통해 필터링. 참고: 최상의 솔루션 품질을 위해 준비 작업 오로 솔루션 하루 전에, 그리고 섞어 하룻밤 보자. 그러나 솔루션은 필요한 같은 날, 희석과 혼합 사용 하기 전에 적어도 2 시간에 대 한 로커에 오로 솔루션. 락, 전에 오로 솔루션의 누설을 피하기 위해 파라핀 테이프에 원뿔 튜브 포장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>벌레의 오로 지질 얼룩을 위한 준비<ol>
<li>선 충 류 성장 매체 (NGM) 원하는 생활 단계에 늦게 로그 OP50 대장균 으로 시드에 20 ° C에서 벌레를 성장.</li>
		<li>접시에 PBST 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 모든 벌레는 접시에서 때까지 소용돌이. 접시를 기울기와 PBST의 1 mL와 함께 그것을 씻어. 1.5 mL microfuge 관 벌레 중지 전송.</li>
		<li>원심 분리기 560 x g 1 분에 벌레 제거는 상쾌한 펠 릿 및 세척 단계 PBST의 1 mL와 함께 세 번 반복을 방해 하지 않고. 모든 표면에 뜨는 하지만 100 µ L을 제거 합니다.</li>
		<li>웜 펠 릿을 40% 소 프로 파 놀의 600 µ L을 추가 하 고 3 분 동안 실내 온도에 바위.</li>
		<li>G 30 s 및 모든 표면에 뜨는 제거 하지만 100 µ L x 560에서 웜 웜 펠 렛을 방해 하지 않고 원심. 참고: PBST의 높은 볼륨을 사용 하 여 높은 처리량 얼룩 하 고 접시에서 벌레를 씻어. 웜 PBST에 보다 더 많은 샘플 고정 이전 15 분 세척 하지 마십시오. 추가 세척 할 상쾌한 박테리아의 지워지지 않습니다. 40% 소 프로 파 놀 nutator 또는 로커를 사용 하 여 부 화를 실시 합니다. 항상 전체 샘플 동요 발생 되도록 튜브 모니터링 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>오로와 얼룩 지질<ol>
<li>각 샘플에 600 µ L 오로 작업 솔루션을 추가 합니다. 반전 튜브 세 번 하 고 오로에서 벌레를 섞으십시오.</li>
		<li>실 온에서 2 h 30 rpm에서 샘플을 회전 합니다.</li>
		<li>1 분 동안 560 x g 에서 샘플 원심 고 모든 표면에 뜨는 하지만 100 µ L을 제거 합니다.</li>
		<li>PBST의 600 µ L에서 샘플을 resuspend 하 고 30 분 초과 오로 얼룩 제거 30 rpm에서 튜브를 회전.</li>
		<li>샘플 1 분 560 x g 에서 원심 하 고 상쾌한의 50 µ L를 제외한 모든 제거.</li>
		<li>더 나은 동물의 생식과 창 자 세포의 위치를 구별할,의 1 µ L을 추가 하 여 핵을 얼룩 (2-(4-amidinophenyl)-1 시간-indole-6-carboxamidine) (DAPI) 오로 작업 솔루션의 모든 1 ml. 이미징에 대 한 슬라이드를 장착 하기 전에 DAPI를 추가 2 h에 대 한 얼룩 오로 실시 합니다. 장 핵 크기에 더 큰 고 생식 개발 생식 세포에 의해 구별 된다. 참고: 후 오로 얼룩, 웜 수 있습니다 microfuge 관의 양쪽에 준수 고 눈에 띄는 펠 릿을 형성 하기 위하여 실패. 이 경우, 다시 벌레를 원심 하거나 적어도 10 분 동안 중력에 의해 침전 하는 벌레를 허용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>웜 이미징에 대 한 슬라이드의 준비<ol>
<li>나머지 상쾌한에 벌레를 resuspend 하 고 솔루션을 잘 섞는다.</li>
		<li>현미경 슬라이드에 벌레 서 스 펜 션의 5 µ L를 넣고 공기 폼 거품 확보는 coverslip 신중 하 게, 장소.</li>
		<li>매니큐어와 이미지 웜 coverslip 인감. 참고: 고정 하 고 얼룩, 후 웜 매우 견고 하 고 플라스틱 하기 어려운 수 있습니다. 회피, 그들의 끝을 절단 하 여 넓은 구멍 펫을 확인 합니다.</li>
		<li>안 착 직후 이미징 하는 경우 24 h까지 4 ° C에서 마이크로 원심 분리기 랙에 슬라이드를 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>오로 얼룩진 벌레의 이미징<ol>
<li>색상 가능 카메라 이미지 오로 얼룩진 벌레를 사용 하 여.</li>
		<li>5 배 확대를 사용 하 여 이미지 보기의 한 필드에 여러 가지 벌레를.</li>
		<li>개별 벌레의 더 나은 시험 10 배 확대로 전환.</li>
		<li>압축으로 인해 데이터 손실을 방지 하려면 TIF 형식에서 이미지를 내보냅니다. 참고: 경우 오로 + DAPI 얼룩, 형광을 캡처할 수 있는 하나에 색상 가능 카메라를 전환.</li>
	</ol>
</li>
	<li>오로 얼룩진 벌레의 이미지 분석<ol>
<li>ImageJ를 micrograph(s)을 업로드. 플러그인 풀 다운 메뉴에서 이미지 파일 인식 되지 않으면 바이오 형식 함수를 사용 합니다.</li>
		<li>스택 함수에서 이미지 풀 다운 메뉴에서 이미지 스택 사용 하 여 여러 현미경을 비교 하면 이미지 스택을 만듭니다.</li>
		<li>지질 작은 물방울의 가시성을 개선 하기 위해 동일한 풀-다운 메뉴에서 밝기/대비를 조정 합니다.</li>
		<li>특정 조직 또는 동물의 체 내 지질 축적에 따라 이미지를 분류할 수 있습니다.</li>
		<li>지질 지역화의 더 나은 평가 및 일반적인 이미지 유물 ImageJ를 사용 하 여 식별 이미지 풀 다운 메뉴에서 색상 기능을 선택 하 고 표시 각 RGB 구성 요소의 신호를 RGB로 스택 클릭 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.

비만 및 대사 질환에서 상승 선 충 C. 세포와 조직에 지방 축적 조절 메커니즘 연구에 적합 한 모델을 만든다. 최근의 증거는 지질 수준에 변화는 인슐린 신호8, 호르몬 수용 체2, 생식 출력5의 정품 인증에서에서 배열 하는 세포질 과정에 대 한 상관을 제안 합니다. 레이블 없는 현미경 검사 법 및 크로마토그래피 방법, 나 일 빨강 및 오일...

지질은 생활 필수품입니다. 그들은 세포 막의 필수 구성 요소, 보조 메신저 역할 및 신호 변환기, 그리고 에너지 저장에 중요 한 기능을가지고. 지질 대사 dysregulated 때, 그것은 공중 보건 우려9누르고 비만 타입 II 당뇨병 같은 질병에 이른다. 꼬마 선 충 (C. 선 충)은 상대적으로 짧은 수명 주기, 투명 한 몸, 알려진된 세포 계보와 완전히 시퀀스 된 게놈을가지고 있기 때문에 지질 대사를 공부 하는 우수한 모델 유기 체. 주로 남녀 추 니, C. 선 충 연구자를 인상 isogenic 동물의 많은 짧은 수행할 높은 처리량 앞으로 유전 스크린 다양 한 대사 유전자 및 통로4공부 기간에 있습니다. 이 이렇게 인간, 쥐, 쥐 및 초파리 중 273 선 충 C. 지질 물질 대사 유전자에서 보존의 높은 학위를 공개 했다. 또한, C. 선 충 에서 300 지질 유전자 변화 증후군11에 비관련 질병에 연결 된 인간의 orthologues가 있다. 전통적으로, C. 선 충 에 지질 저장의 검사는 주로 지질 축적에 대 한 강력한 정보를 제공 하는 염료 분류 분석 실험에 의존 했다. 덜 일반적인 조직에 걸쳐 지질 지역화 및 지질 풍부에서 측정 된 차이의 설명 이다. 그러나, 최근 작품은 지질 분포 지질 축적6만큼 중요 있을 수 있습니다 밝혔다.
최근에, 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석 (HPLC-석사), 가스 크로마토그래피-질량 분석 (GC-MS), 같은 통합 연구 시작 하 고 일관 된 안티-스톡 스 라만 산란 (자동차) 현미경 주소로 얼룩-기반 접근 직접 지질 추출, 특정 지질 분수, 및 지질 예금, 각각10,11의 내용을 분석 하 여 단점 또한, 자동차 현미경 나 일 빨강 수 있습니다만 중요 한 얼룩 리드 오프 대상 자동 형광 세포10의 얼룩에 사용을 위해 통 염료로 사용 하는 경우 지방 축적에 대 한 프록시 역할을 계시 했다. 그러나, 필요한 기술적 전문성과 비용 이러한 크로마토그래피와 관련 된 그리고 현미경 검사 법 방법 활용 그들의 많은 연구 질문에 대 한 점. 이 문서에서 우리는 흥분 시키는 중립 지질 예금 C. 선 충 나 일 빨강을 사용 하 여 얼룩 하 고 기름 빨간 O 지질 풍부 전체 동물에서 및 특정 조직에 구별을 편리 하 고 안정적인 방법 토론.
나 일 빨강, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, benzophenoxazone 염료를 쉽게 다양 한 유기 용 매에 녹이 고 주로 물에 용 해 되지 않습니다 이다. 그것은 우수한 lysochrome 염료 사용 트리 글리세라이드 등 중립 지질 얼룩 또는 콜레스테롤 에스테 르는 강한 색상을 보유 하 고 있습니다. 때문에 지질에 잘 solubilizes, 무시할 상호 주위 조직, 않으며 덜에 보다 용 매에 용 해 지질입니다. 그것은 450-500 및 520 nm, 각각1의 여기 및 방출 맥시 마. 개별 지질 시체를 소장 및 다른 조직에 걸쳐 관찰 중 하나에 클러스터 또는 동물의 유전자 형 또는 실험적인 치료에 따라 균등 하 게 분산 수 있습니다 녹색 형광에 대 한 일 레드 스테인드 C. 선 충 을 볼 때 7.
기름 빨간 O lysochrome, 트리 글리세라이드 및 단백질 얼룩을 사용 하는 지 용 성 염료 이다. 그것은 그것의 화학 구조 포함 3 개의 향기로운 반지에 연결 된 두 개의 아조 그룹 때문에 아조 염료 이라고 합니다. 그것은 어느 지질에서 높게 녹는 렌더링 이온화, 어렵다입니다. 얼룩 색은 빨간색 이며 그것의 빛을 흡수 최대 518 nm 3. C. 선 충 기름 빨간 O 쇼 다른 조직6중 지질 분포의 질적 평가 용이 하 게 동물의 투명 한 바디에 눈에 띄는 빨간 지질 방울 스테인드.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Imager.M2m Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERC5s camera</td>
			<td>Axiocam</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Color-capable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRm camera</td>
			<td>Axiocam</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Fluorescence-capable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N1142</td>
			<td>Lipid Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil red O</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12989</td>
			<td>Lipid Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>DNA stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1133-1LP</td>
			<td>Fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m seterile syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-477</td>
			<td>Cellulose acetate filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428000015</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Rotisserie</td>
			<td>Lab Quake</td>
			<td>400110Q</td>
			<td>Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10136-084</td>
			<td>Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7758-11-4</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-88-5</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>L9110</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3147</td>
			<td>Bacterial growth</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in caenorhabditis elegans by nile red and oil red o staining

꼬마 선 충 은 지질 대사 및 에너지 항상성 공부 하는 뛰어난 모델 유기 체입니다. 그것의 지질 유전자의 많은 인간에서 보존 하 고 대사 증후군 또는 다른 질병와 관련. 이 유기 체에서 지질 축적의 시험 통 염료 또는 레이블 자유로운 방법에 의해 밖으로 수행할 수 있습니다. 통 얼룩 나 일 빨강 좋아하고 기름 빨간 O 양적 지질 수준을 측정 하 고 질적 관찰 지질 분포, 조직에 걸쳐 각각 저렴 하 고 신뢰할 수 있는 방법이 있습니다. 또한, 이러한 얼룩 다양 한 지질 물질 대사 유전자 및 통로의 높은 처리량 검열을 허용 한다. 또한, 그들의 소수 성 자연 지질 용 해도 용이 하 게, 주변 조직와 상호 작용을 감소 및 용 매로 분리를 방지. 이 메서드는 일반적인 지질 콘텐츠 검사에 효과적, 비록 그들은 화학 성분 및 지질 예금의 다양성에 대 한 자세한 정보를 제공 하지 않습니다. 이러한 목적으로, GC-MS와 자동차 현미경 같은 레이블 없는 메서드는 더 나은 적합, 불구 하 고 그들의 비용.

SKN-1은 bZip, cytoprotective 전사 요소는 포유류 NRF2와 상 동을 공유 하 고 지방산 산화를 중재에 표시 되었습니다. 그들의 식단에 포도 당 농도 따라 웜 constitutively 활성화 skn 1 대립 유전자와 다른 지질 수준 나 일 빨강7물 때를 표시 합니다. 그림 1A -C 표시 활성화 skn-1 동물 지질 수준을 증가 하는 조건에 노출 됩...

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Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

지질 풍부 및 평가의 지질 분포 나 일 빨강, 기름 빨간 O 얼룩으로 꼬마 선 충 의 정량화

나 일 빨강 고정된 꼬마 선 충 의 얼룩 조직 중 지질 분포의 질적 평가 용이 하 게 기름 빨간 O 얼룩 동안 중립 지질 예금, 양적 측정 하기 위한 방법입니다.

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

20.0K 조회수.  University of Southern California. 나 일 빨강 고정된 꼬마 선 충 의 얼룩 조직 중 지질 분포의 질적 평가 용이 하 게 기름 빨간 O 얼룩 동안 중립 지질 예금, 양적 측정 하기 위한 방법입니다.

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Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

이온화 방사선 다음 γH2AX의 공간적 분포 평가

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

연구

생물학

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

분리 및 체외에서</em의> 활성화 Caenorhabditis 엘레간스 정자

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

상순 Embryogenesis의 시간 경과 현미경 Caenorhabditis 엘레간스

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

에서 프로스타글란딘 추출 및 분석<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Explanted 망막 조직 세포 외 유출 분석을 사용 하 여 신진 대사 에너지의 측정

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Experimental Approach to Examine Leptin Signaling in the Carotid Bodies and its Effects on Control of Breathing

An adipocyte-produced hormone leptin is a potent respiratory stimulant, which may play an important role in defending respiratory function in obesity. The carotid bodies (CB), a key organ of peripheral hypoxic sensitivity, express the long functional isoform of leptin receptor (LepRb) but the role of leptin signaling in control of breathing has not been fully elucidated. We examined the hypoxic ventilatory response (HVR) (1) in C57BL/6J mice before and after leptin infusion at baseline and after CB denervation; (2) in LepRb-deficient obese db/db mice at baseline and after LepRb overexpression in CBs. In C57BL/6J mice, leptin increased HVR and effects of leptin on HVR were abolished by CB denervation. In db/db mice, LepRb expression in CB augmented the HVR. Therefore, we conclude that leptin acts in CB to augment responses to hypoxia.

Our study focuses on the effects of leptin signaling in carotid body (CB) on the hypoxic ventilatory response (HVR). We performed &#39;loss of function&#39; experiments measuring the effect of leptin on HVR after CB denervation and &#39;gain of function&#39; experiments measuring HVR after overexpression of the leptin receptor in CB.

An adipocyte-produced hormone leptin is a potent respiratory stimulant, which may play an important role in defending respiratory function in obesity. The ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

초파리 유충에 있는 Oenocytes의 해부 그리고 지질 물방울 염색

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

성인 심장 섬유 아세포 및 근섬유 아세포의 격리 및 특성화

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

자극라만 산란 현미경 검사를 사용하여 Caenorhabditis elegans의 지질 저장 역학의 라벨 프리 이미징

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...