Este trabalho foi apoiado pelo Israel Ministério da ciência, tecnologia e espaço do Comitê o cientista-chefe do Ministério israelense da agricultura (#16-16-0003).

1. Material e condições de crescimento da planta
<ol><li>Sementes de um tabaco (cultivar Samsun) sementes por vaso de 5 cm x 5 cm cheio de médio padrão pot. Coloque os potenciômetros em bandejas. Crescem as plantas em uma sala de crescimento sob condições de dia longo (16/8 h claro/escuro) a uma temperatura constante de 23 ° C. Irrigue com água da torneira até drenos de água da panela.</li>
	<li>Depois de 50±5 dias, inicie tratamentos de Fe na irrigação, de acordo com as concentrações adequadas para o experimento. Por exemplo, usamos uma gama de concentrações de ferro, de 0 a 6 mM, complementado por um quelante de Fe solúvel (Fe EDDHA). Irriga as plantas com a solução adequada a cada dois dias (para evitar desidratação) por 6-8 dias.</li>
</ol>2. preparar as folhas para medição de ferro
Notas: Todos os materiais a ser utilizado devem ser isento de ferro a fim de reduzir o risco de contaminação de ferro. Limpe o pilão duas vezes com solução de HCl de 4% e seque com papel de filtro cada vez antes de usar. Se qualquer material é reutilizado, limpe-o duas vezes com solução de HCl de 4% e seque com papel de filtro.
<ol><li>Separe as folhas do tronco à mão, usando luvas (não utilize qualquer equipamento de metal). Use cerca de 10 g de folhas (peso fresco) para cada amostra. Limpe cada folha com água bidestilada (DDW) usando um frasco do pulverizador. Este passo é importante para evitar a contaminação de Fe.</li>
	<li>Seque as folhas em uma toalha de papel e colocá-los em um saco de papel. Transferi os sacos de papel para um forno a uma temperatura constante de 80 ° C durante 2-3 dias.</li>
	<li>Quando secar, esmaga as folhas em pó usando um almofariz e um pilão e transferência para tubos de plástico estéril 15 mL.</li>
</ol>3. queimar as folhas em cinzas.
Notas: O uso da solução de HCl com pH baixo (perto de 0) destina-se a aumentar a solubilidade de ferro. A lã de rocha é usado para evitar que os gases escapem do frasco durante a queima.
<ol><li>Pese um frasco de cintilação de novo e lacrado 20 mL sem tampa. Observe o valor ou defina o valor como zero utilizando o botão de Tara. Adicione as folhas secas esmagadas (amostra) para o frasco.</li>
	<li>Pesar a amostra e o recipiente e observe o valor. Feche o frasco com lã de rocha.</li>
	<li>Pesar 3 frascos adicionais sem adição de amostras e Observe seus valores. Estes frascos serão usados como controles para avaliar a quantidade de lã de rocha que poderia ter levado a qualquer aumento no peso de amostra.</li>
	<li>Coloque os frascos de amostra e controle em uma fornalha e começar a queimar usando as seguintes etapas de temperatura: temperatura ambiente, o rápido aumento de 425 ° C e, finalmente, a 425° C por 4 horas. Por esta altura, as folhas secas serão transformaram-se em cinzas.</li>
	<li>Deixe-o esfriar amostras até cerca de 100 ° C, mas não abaixo desta temperatura para as seguintes duas etapas evitar a umidade, que pode afetar o peso final da amostra. Usando luvas pesadas, remova as amostras da fornalha com uma pinça, segurando o frasco exteriormente.</li>
	<li>Colocar os frascos em uma superfície plana, remover a lã de rocha e fechar os frascos com as tampas originais.</li>
	<li>Pesar os frascos de 3 controle (ver 3.3) e calcular o seu ganho de peso médio. Se o ganho de peso é igual ou superior a 1% do peso da cinza (consulte a etapa 4.2), usar esse valor como uma estimativa do erro de medição.</li>
</ol>4. preparar as cinzas para medição de ferro
Notas: A concentração final de ferro na amostra inicial é calculada como o peso das cinzas dividido pelo volume de HCl adicionado.
<ol><li>Preparar uma solução de HCl 1 M (4% HCl) adicionando 12,5 mL de uma solução de HCl de 37% a 87,5 mL de DDW (em um frasco plástico ou vidro).</li>
	<li>Pesar um tubo plástico de 15 mL e observe o valor ou defina o valor como zero utilizando o botão de Tara. Transferir as cinzas para o tubo, pesar e observe o valor. Este é o peso das cinzas.</li>
	<li>Adicione 5 mL de 1 M de HCl para as cinzas. Filtrar as cinzas num filtro de 22 µm e adicionar um adicional 5 mL de 1 M de HCl através do mesmo filtro.</li>
	<li>O volume final deve ser de 10 mL. Note que o filtro vai perder parte da solução. Nota: As amostras agora estão prontas para a medição de Fe faby ou pelo método azul da Prússia.</li>
	<li>Faça uma curva de calibração com a concentração de Fe medida por espectrometria atômica e pelo método Prussian blue (ver Figura 4) para cada espécie de planta. Posteriormente, a concentração de Fe pode ser medida pelo método azul prussiano.</li>
</ol>5. medir a concentração de Fe por faby
<ol><li>Remova 4 mL de cada amostra para medição por faby.</li>
	<li>Divida os resultados obtidos com a medição de faby pelo peso das cinzas. Divida o valor resultante por 0,01 (porque as cinzas foram solubilizadas em 10 mL). O valor resultante é a concentração de ferro por grama cinza (ppm).</li>
</ol>6. preparar a solução de coloração azul da Prússia
<ol><li>Preparar um 4% solução Prussian blue adicionando 4 g de K4Fe(CN)6 a 100 mL DDW e vortex (outros volumes e/ou concentrações podem ser usadas para diferentes demandas). Note-se que neste estudo, um menos Prussian blue solução concentrada do que o utilizado anteriormente relatados (20%)14 .</li>
	<li>Manter a solução no escuro a 4 ° C até o uso. A solução é estável por 6 meses quando armazenado em tais condições.</li>
</ol>7. gerando uma curva de calibração para o método azul da Prússia, usando resultados de faby
Nota: Calcular a concentração de ferro nas cinzas usando a seguinte fórmula <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57408/57408eq1.jpg">Equação 1 C: concentração, v: volume de amostra, w: peso das cinzas (g).
<ol><li>Misture a 0,50 mL de solução de azul prussiano e 0,50 mL de 1 M de HCl. Isto servirá como solução em branco.</li>
	<li>Misturar 0,5 mL da amostra (cinzas em 4% HCl, conforme descrito na seção 3) e 0,5 mL de solução de azul prussiano (etapa 6.1) por pipetagem. Espere pelo menos 1 minuto, mas não mais de 5 minutos. Após 5 minutos, vai ocorrer sedimentação nas amostras.</li>
	<li>Transfira a mistura para uma cubeta e medir a D.O. a 715 nm, utilizando um espectrofotômetro. Observe o valor.</li>
	<li>Divida o valor de OD (passo 7.3) pelo peso das cinzas (passo 3.2) da amostra. O resultado representa OD por grama de cinzas.</li>
	<li>Plotar a regressão linear entre as concentrações de ferro obtidos a partir das medições de faby (eixo Y) e os valores de OD (eixo X). Use os resultados obtidos nas etapas 5.2 e 7,4. Calcular a fórmula de regressão, Y = a + bX, onde Y representa a concentração de ferro, um representa a absorvância se cruzam, b representa a inclinação de absorvância e X representa o OD.</li>
</ol>8. usando o método azul da Prússia para determinar os níveis de ferro em outras amostras do mesmo tipo de planta
Notas: Uma vez que já foi estabelecida uma curva de calibração para este tipo de planta, concentração de ferro em qualquer novas amostras do mesmo tipo de planta pode ser diretamente calculada usando a fórmula de regressão linear.
<ol><li>Execute as etapas nas seções 3 e 4, seguido por etapas 7.1 a 7.4.</li>
	<li>Calcule a concentração de ferro em solução usando a fórmula obtida a regressão linear (passo 7.5).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kobayashi, T., Nishizawa, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+uptake,+translocation,+and+regulation+in+higher+plants.">Iron uptake, translocation, and regulation in higher plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 63 (1), 131-152 (2012).</li><li>Bradley, J. M., Le Brun, N. E., Moore, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferritins:+Furnishing+proteins+with+iron.">Ferritins: Furnishing proteins with iron.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 21 (1), 13-28 (2012).</li><li>Zieli&#324;ska-Dawidziak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+ferritin+-+a+source+of+iron+to+prevent+its+deficiency.">Plant ferritin - a source of iron to prevent its deficiency.</a> Nutrients. 7 (2), 1184-1201 (2015).</li><li>Johnson, D. C., Dean, D. R., Smith, A. D., Johnson, M. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+of+iron+in+natural+water.">Chemistry of iron in natural water.</a> Report US Geological Survey. , 1-31 (1962).</li><li>Rout, G. R., Sahoo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+iron+in+plant+growth+and+metabolism.">Role of iron in plant growth and metabolism.</a> Reviews in Agricultural Science. 3, 1-24 (2015).</li><li>Speretto, R. A., Ricachenevsky, F. K., Stein, R. J., de Abreu Waldow, V., Fett, J. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+correlation+coefficient:+An+overview.">The correlation coefficient: An overview.</a> Critical Reviews in Analytical Chemistry. 36 (1), 41-59 (2006).</li><li>. Analytical Chemistry. Calibration Curves Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10188/calibration-curves">https://www.jove.com/science-education/10188/calibration-curves</a> (2018)</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Medição de ferro nos tecidos da planta é muito importante para avaliar os efeitos da irrigação ou outras condições ambientais. Aqui, descrevemos um método colorimétrico fácil e preciso para a medição de conteúdo Fe em folhas de tabaco, que podem ser facilmente adaptados para outras espécies de plantas e tecidos.
Na otimização de condições para o método colorimétrico, usamos um médio baixo pH (pH < 1.0) para permitir que a solubilidade de ferro. O processo de gravação foi...

Ferro (Fe) é um micronutriente importante em todos os organismos vivos. Em plantas, é um micronutriente essencial1 por causa de seu envolvimento em processos básicos, tais como respiração, fotossíntese e a clorofila biossíntese. Alta acumulação de íons de ferro livre é prejudicial às células devido a reações, levando à liberação de radicais livres, causando estresse oxidativo vegetais. Para manter a homeostase de ferro dentro da célula vegetal, íons são armazenadas em vacúolos e sequestrados dentro ferritins, gaiolas de proteína diretamente envolvidas na homeostase de ferro2 e a estrutura de armazenamento principal de ferro em todos os organismos vivos. Ao mesmo tempo, a anemia por deficiência de ferro afeta uma proporção significativa da população humana, resultando em uma crescente necessidade de planta Fe biofortificação. Devido as propriedades únicas de ferritina de planta, enriquecimento de alimentos com ferro-ferritina oferece uma promissora estratégia para combater este problema de desnutrição de3.
Íons de ferro são principalmente encontrados em dois Estados de oxidação, ou seja, o ferrosos (divalentes Fe2 + ou ferro (II)) e férrico (trivalente Fe3 + ou ferro (III)) formas. Várias outras formas de ferro, tais como aglomerados de ferro4, também são encontradas nas células. Fe é armazenado como óxido de ferro dentro da célula e, naturalmente, hematita formas (Fe2O3) e ferryhidrites ((Fe3 +)2O30,5 H2O) sob condições fisiológicas5. Os hidróxidos formados nessas reacções, especialmente o formulário férrico, têm muito baixa solubilidade. Retenção de ferro é consequentemente afetada pelo pH da solução e é em grande parte em um estado sólido acima de pH 56.
Considerando o pobre solubilidade e alta reatividade de Fe, sua transferência entre tecidos vegetais e órgãos deve ser associada com moléculas quelantes apropriadas. Além disso, seus Estados de redox entre os formulários ferroso e férrico1 devem ser controlados. Dentro de folhas, cerca de 80% do ferro é encontrado nas células fotossintéticas, devido à suas funções essenciais no sistema de transporte de elétrons, na biossíntese de citocromos, clorofila e outras moléculas de heme e na formação de Fe-S7de clusters. No caso de ferro em excesso dentro da célula, o excedente é translocado para o vacúolo, onde o metal é armazenado em moléculas de ferritina8.
Ferro pode ser medido em tecidos vegetais por vários métodos, incluindo chama absorção atômica espectroscopia9 (faby) ou ensaios colorimétricos10, o primeiro sendo muito mais precisos do que o último. Faby é uma técnica de alta precisa que permite que se determine a composição elementar de uma amostra com base a emissão eletromagnética dos elementos individuais. Faby converte íons metálicos para Estados atômicos, flama-aquecimento da amostra, levando a excitação do íon e a emissão de um comprimento de onda específico quando um determinado íon retorna ao seu estado fundamental. As emissões de íons de diferentes são separadas por um monocromador e detectadas por um sensor de absorção11. Faby, portanto, serve para quantificar diretamente as concentrações de ferro. Outras técnicas para a visualização de ferro nos tecidos biológicos são, no entanto, disponíveis. Espectroscopia de massa de plasma indutivamente acoplado (ICP-MS)12 é uma técnica muito precisa para medição de ferro e outros oligoelementos, mas a falta de equipamento, tanto para faby e ICP-MS, é um problema comum. Por outro lado, a medição de ferro por tiocianato colorimetria13 carece de precisão e falha detectar pequenas variações entre as amostras. Prussian blue coloração14,15,16,17 é um método indireto baseado na reação de férrico de ferrocianeto de potássio (K4Fe(CN)6) com cátions Fe, produzindo um cor azul forte e é utilizado para detecção qualitativa de ferro em cortes histológicos de tecidos animais e vegetais.
Ferro metálico (zero-valente) é raro na litosfera. A forma iônica não-complexado dominante de ferro no ambiente é ditada principalmente pela quantidade de oxigênio na atmosfera, com ferro ferroso, sendo relativamente mais abundantes em ambientes anóxica e ferro férrico, predominando em sites aeróbios. Esta última forma é também dominante em ambientes extremamente ácidas, embora os agentes causadores da oxidação de ferro ferroso diferem frequentemente em ambiente anóxico e ácido18. Quando o ferro é solubilizado em 4% HCl (pH 0) em um ambiente aeróbio, a maior parte do ferro diluído existe como forma a férrico (Fe3 +)19,20.
As reações entre íons de Fe e K4Fe(CN)6 são como segue:
Fe3 +: FeCl3 + K4Fe(CN)6 = KFe(III)Fe(II)(CN)6¯ + 3KCl
Fe2 +: 4 FeCl2 + K 24Fe(CN)6 =4(Fe(CN)6) de Fe2 + 8 KCl
No presente estudo, perguntamos se a coloração azul prussiano pode ser útil para medir os níveis de ferro na solução.
Inicialmente, verificamos que a correlação entre a concentração de Fe em solução aquosa e coloração azul prussiano. A concentração de Fe (como FeCl2, FeCl3 ou uma mistura de 1:1 dos dois) em soluções aquosas foi medida por espectroscopia atômica e pela absorvância (OD) após a adição de azul da Prússia. A Figura 1 mostra as curvas de regressão linear para as medições obtidas por cada método. Concluímos que o método Prussian blue pode ser usado para análise quantitativa da concentração de ferro na solução.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57408/57408fig1.jpg"> Figura 1: regressões lineares entre concentração de Fe medido por faby e absorbância de luz (OD, 715 nm) obtidos pelo método Prussian blue. Os quadrados azuis e linha representam a solução de Fe2 + , os quadrados vermelhos e linha representam a solução de Fe3 + e os quadrados pretos e linha representam uma mistura 1:1 entre Fe2 + e Fe3 +. Obtiveram-se as regressões a seguintes: [Fe2 +] = 3 + 123 x OD, r = 0.996, R2 = 0.989; [Fe3 +] = 1 + 292 OD x, r = 0.999, R2 = 0.997; e [Fe2 + 3 +] = 11 + 146 x OD, r = 0.983, R2 = 0.956. O Fe2 + doador era FeCl2 e o Fe3 + doador era FeCl3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57408/57408fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para adaptar o método colorimétrico azul prussiano para análise quantitativa do ferro de tecidos vegetais, o teor de ferro de cinzas de folhas de tabaco foi medido por espectroscopia atômica de absorção de chama e coloração azul prussiano. Houve boa correlação entre os resultados pelas duas técnicas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Potassium Hexacyanoferrate(II)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>14459-95-1</td>
			<td>Reagent for the Pussian Blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Syringe Filter Unit, Vial Vent 0.22 &#956;m</td>
			<td>Millec</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Filter used to filter the ashes + 4% HCl Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Vials</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>03-337-4</td>
			<td>Used to keep the dry powdered plant material during the burning procedure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Syringe 10 ml</td>
			<td>Medi-Plus</td>
			<td>1931</td>
			<td>Syringe used during the filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>231-595-7</td>
			<td>Used in the 4% HCl solution to dilute the ashes and clean the materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobacco, Nicotiana tabacum cv. Samsun NN</td>
			<td>Obtained from Prof. Simon Barak and routinely used in the Zaccai Lab</td>
			<td>Barak S, Nejidat A, Heimer Y, Volokita M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of the glycolate oxidase gene in tobacco seedlings. Plant Molecular Biology. 2001 Mar 1;45(4):399-407.</td>
			<td>Tobacco cultivar used in this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Wool (Rock Wool)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>659997-17-3</td>
			<td>Used in the procedure of burning samples in the furnace.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a colorimetric method for measuring iron content in plants

Ferro, dentre os mais importantes micronutrientes em organismos vivos, está envolvido em processos básicos, tais como a respiração e a fotossíntese. Teor de ferro é bastante baixo em todos os organismos, que se elevam em plantas para cerca de 0,009% do peso seco. Até à data, um dos métodos mais precisos para medir a concentração de ferro nos tecidos da planta é chama espectroscopia de absorção atômica. No entanto, esta abordagem é demorado e caro e requer equipamento específico não comumente encontrado em laboratórios da planta. Portanto, um método mais simples, mas preciso que pode ser usado rotineiramente é necessária. O método colorimétrico do azul da Prússia é usado regularmente para ferro qualitativo em cortes histológicos animais e vegetais de coloração. Neste estudo, adaptamos o método para medições quantitativas de ferro no tabaco deixa o azul da Prússia. Nós validado a precisão deste método usando espectroscopia atômica e azul da Prússia coloração para medir o teor de ferro nas mesmas amostras e encontrou uma regressão linear (R2 = 0.988) entre os dois processos. Concluímos que o método azul da Prússia para medição quantitativa de ferro nos tecidos da planta é preciso, simples e barato. No entanto, a regressão linear apresentada aqui pode não ser apropriada para outras espécies de plantas, devido a possíveis interações entre a amostra e o reagente. Estabelecimento de uma curva de regressão, portanto, é necessária para diferentes espécies de plantas.

Quando este protocolo é realizado corretamente, um deve ficar excelente correlação entre os resultados obtidos com os métodos de espectroscopia atômica e azul prussiano. Portanto, o método Prussian blue pode ser facilmente usado para obter uma medição precisa da concentração de ferro em amostras de plantas, como refletido no seguinte experimento.
Plantas de tabaco foram cultivadas, conforme descrito no protocolo e irri...

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A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Um método colorimétrico para medir o teor de ferro nas plantas

Apresentamos um protocolo simples e confiável para medir o teor de ferro em tecidos vegetais usando o método colorimétrico do azul da Prússia.

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

21.9K visualizações.  Ben-Gurion University of the Negev. Apresentamos um protocolo simples e confiável para medir o teor de ferro em tecidos vegetais usando o método colorimétrico do azul da Prússia.

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A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies have revealed that these reversible RNA modifications affect RNA splicing, translation, degradation, and localization. Multiple physiological processes, like circadian rhythms, stem cell pluripotency, fibrosis, triglyceride metabolism, and obesity are also controlled by m6A modifications. Immunoprecipitation/sequencing, mass spectrometry, and modified northern blotting are some of the methods commonly employed to measure m6A modifications. Herein, we present a northeastern blotting technique for measuring m6A modifications. The current protocol provides good size separation of RNA, better accommodation and standardization for various experimental designs, and clear delineation of m6A modifications in various sources of RNA. While m6A modifications are known to have a crucial impact on human physiology relating to circadian rhythms and obesity, their roles in other (patho)physiological states are unclear. Therefore, investigations on m6A modifications have immense possibility to provide key insights into molecular physiology.

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A modified northern blotting method for measuring N6-methyladenosine (m6A) modifications in RNA is described. The current method can detect modifications in diverse RNAs and controls under various experimental designs.

Um método para medir RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine modificações nas células e tecidos

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Bioquímica

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. Moreover, even cultures of a single cell type may contain cells in distinct metabolic states, such as resting or cycling cells. Methods for measuring metabolic activities of such subpopulations are valuable tools for understanding cellular metabolism. Complex cell populations are most commonly separated using a cell sorter, and subpopulations isolated by this method can be analyzed by metabolomics methods. However, a problem with this approach is that the cell sorting procedure subjects cells to stresses that may distort their metabolism.
To overcome these issues, we reasoned that the mass isotopomer distributions (MIDs) of metabolites from cells cultured with stable isotope-labeled nutrients are likely to be more stable than absolute metabolite concentrations, because MIDs are formed over longer time scales and should be less affected by short-term exposure to cell sorting conditions. Here, we describe a method based on this principle, combining cell sorting with liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). The procedure involves analyzing three types of samples: (1) metabolite extracts obtained directly from the complex population; (2) extracts of "mock sorted" cells passed through the cell sorter instrument without gating any specific population; and (3) extracts of the actual sorted populations. The mock sorted cells are compared against direct extraction to verify that MIDs are indeed not altered by the cell sorting procedure itself, prior to analyzing the actual sorted populations. We show example results from HeLa cells sorted according to cell cycle phase, revealing changes in nucleotide metabolism.

This article describes a method for studying cellular metabolism in complex communities of multiple cell types, using a combination of stable isotope tracing, cell sorting to isolate specific cell types, and mass spectrometry.

Um método para medir o metabolismo em Ordenado subpopulações de Comunidades celulares complexas usando Stable Isotope Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by networks of interacting protein complexes, which are often difficult to investigate because their binding is non-covalent and easily perturbed by purification techniques. This work describes a method of stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Tissue lysate is loaded onto a non-denaturing blue-native polyacrylamide gel, then an electric current is applied until the protein migrates a short distance into the gel. The gel strip containing the migrated protein is then excised and incubated with the amine-reactive cross-linking reagent dithiobis(succinimidyl propionate), which covalently stabilizes protein complexes. The gel strip containing cross-linked complexes is then cast into a sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel, and the complexes are separated completely. The method relies on techniques and materials familiar to most molecular biologists, meaning it is inexpensive and easy to learn. While it is limited in its ability to adequately separate extremely large complexes, and has not been universally successful, the method was able to capture a wide variety of well-studied complexes, and is likely applicable to many systems of interest.

A method for stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue lysate using an amine-reactive protein cross-linker coupled to a novel two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) system is presented.

Multímero-PAGE: Um método para capturar e Solução de proteína em amostras biológicas Complexos

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have highlighted complex mechanisms of glycogen metabolism, including the diel cycle of biosynthesis and catabolism, redox regulation, and the involvement of non-coding RNA. At the same time, efforts are being made to redirect carbon from glycogen to desirable products in genetically engineered cyanobacteria to enhance product yields. Several methods are used to determine the glycogen contents in cyanobacteria, with variable accuracies and technical complexities. Here, we provide a detailed protocol for the reliable determination of the glycogen content in cyanobacteria that can be performed in a standard life science laboratory. The protocol entails the selective precipitation of glycogen from the cell lysate and the enzymatic depolymerization of glycogen to generate glucose monomers, which are detected by a glucose oxidase-peroxidase (GOD-POD) enzyme coupled assay. The method has been applied to Synechocystis sp. PCC 6803 and Synechococcus sp. PCC 7002, two model cyanobacterial species that are widely used in metabolic engineering. Moreover, the method successfully showed differences in the glycogen contents between the wildtype and mutants defective in regulatory elements or glycogen biosynthetic genes.

Here, we present a reliable and easy assay to measure the glycogen content in cyanobacterial cells. The procedure entails precipitation, selectable depolymerization, and the detection of glucose residues. This method is suitable for both wildtype and genetically engineered strains and can facilitate the metabolic engineering of cyanobacteria.

Determinação do conteúdo de glicogênio em cianobactérias

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts of purified material. Here, we describe a simple method for gaining detailed polysaccharide structural information, including resolution of structural isomers. For polysaccharide analysis by gel electrophoresis (PACE), plant cell wall material is hydrolyzed with glycosyl hydrolases specific to the polysaccharide of interest (e.g., mannanases for mannan). Large format polyacrylamide gels are then used to separate the released oligosaccharides, which have been fluorescently labeled. Gels can be visualized with a modified gel imaging system (see Table of Materials). The resulting oligosaccharide fingerprint can either be compared qualitatively or, with replication, quantitatively. Linkage and branching information can be established using additional glycosyl hydrolases (e.g., mannosidases and galactosidases). Whilst this protocol describes a method for analyzing glucomannan structure, it can be applied to any polysaccharide for which characterized glycosyl hydrolases exist. Alternatively, it can be used to characterize novel glycosyl hydrolases using defined polysaccharide substrates.

A protocol for the structural analysis of polysaccharides by gel electrophoresis (PACE), using mannan as an example, is described.

Caracterização estrutural de polissacarídeos de parede celular Medeiros em plantas usando a ritmo

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Um método simples para High Throughput Screening químico em Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are the most important components of phycobilisomes, the major light-harvesting antennae in cyanobacteria and several algae taxa. The phycobilisomes of Synechocystis contain two phycobiliproteins: phycocyanin and allophycocyanin. This protocol describes a simple, efficient, and reliable method for the quantitative determination of both phycocyanin and allophycocyanin in this model cyanobacterium. We compared several methods of phycobiliprotein extraction and spectrophotometric quantification. The extraction procedure as described in this protocol was also successfully applied to other cyanobacteria strains such as Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., and Nostoc sp., as well as to red algae Porphyridium cruentum. However, the extinction coefficients of specific phycobiliproteins from various taxa can differ and it is, therefore, recommended to validate the spectrophotometric quantification method for every single strain individually. The protocol requires little time and can be performed in any standard life science laboratory since it requires only standard equipment.

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Here, we present a protocol to quantitatively determine phycobiliprotein content in the cyanobacterium Synechocystis using a spectrophotometric method. The extraction procedure was also successfully applied to other cyanobacteria and algae strains; however, due to variations in pigment absorption spectra, it is necessary to test the spectrophotometric equations for each strain individually.

Determinação espectrofotométrica de Phycobiliprotein conteúdo em associação Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the progression of cancer, diabetes, neurodegeneration, and aging to name a few. For instance, changes in mitochondrial activity, the cell&#39;s metabolic powerhouse, have been characterized in many such diseases. Generally, the oxygen consumption rates of mitochondria were considered a reliable readout of mitochondrial activity and measurements in some of these studies were based on isolated mitochondria or cells. However, such conditions may not represent the complexity of a whole tissue. Recently, we have developed a novel method that enables the dynamic measurement of oxygen consumption rates from whole isolated fly heads. By utilizing this method, we have recorded lower oxygen consumption rates of the whole head segment in young versus aged flies. Secondly, we have discovered that lysine deacetylase inhibitors rapidly alter the oxygen consumption in the whole head. Our novel technique may therefore aid in uncovering new properties of various drugs, which may impact metabolic rates. Furthermore, our method may give a better understanding of metabolic behavior in an experimental setup that more closely resembles physiological states.

Measuring alterations in metabolic rates is central to understanding the progression of various diseases and aging. Here, we present a novel technique to measure whole head oxygen consumption that more closely resembles the physiological state and may aid in revealing novel drugs that modify mitochondrial activity.

Medindo e interpretando a taxas de consumo de oxigênio em toda a cabeça segmentos de voar

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe validation. Methods that measure this phenomenon without modification of the protein target or small molecule are particularly valuable though technically challenging. The cellular thermal shift assay (CETSA) is one technique to monitor target engagement in living cells. Here, we describe an adaptation of the original CETSA protocol, which allows for high throughput measurements while retaining subcellular localization at the single cell level. We believe this protocol offers important advances to the application of CETSA for in-depth characterization of compound-target interaction, especially in heterogeneous populations of cells.

Measurements of drug target engagement are central to effective drug development and chemical probe validation. Here, we detail a protocol for measuring drug-target engagement using high content imaging in a microplate-compatible adaption of the cellular thermal shift assay (CETSA).

Usando o índice elevado de imagem para quantificar o destino noivado em células aderentes

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of physiological processes. Mitochondrial dysfunction is a primary cause of a number of metabolic and neurodegenerative diseases. Intact mitochondria are critical for their proper functioning. The enzyme citrate synthase is localized in the mitochondrial matrix and thus can be used as a quantitative enzyme marker of intact mitochondrial mass. Given that many molecules and pathways that have important functions in mitochondria are highly conserved between humans and Drosophila, and that an array of powerful genetic tools are available in Drosophila, Drosophila serves as a good model system for studying mitochondrial function. Here, we present a protocol for fast and simple measurement of citrate synthase activity in tissue homogenate from adult flies without isolating mitochondria. This protocol is also suitable for measuring citrate synthase activity in larvae, cultured cells, and mammalian tissues.

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

We present a protocol for a colorimetric assay of citrate synthase activity for quantification of intact mitochondrial mass in Drosophila tissue homogenates.