Questo lavoro è stato supportato da l'Israele Ministero della scienza, tecnologia e progettuali da una sovvenzione del Chief Scientist del Ministero israeliano dell'agricoltura (n. 16-16-0003).

1. materiale e le condizioni di crescita della pianta
<ol><li>Semi di semi di tabacco di una (cultivar Samsun) per vaso di 5cm x 5cm riempito con mezzo vaso standard. Posizionare i vasi su vassoi. Crescere le piante in una stanza di crescita in condizioni di giorno lungo (16/8 h chiaro/scuro) ad una temperatura costante di 23 ° C. Irrigare con acqua di rubinetto fino a quando gli scoli dell'acqua dalla pentola.</li>
	<li>Dopo giorni di 50 ± 5, iniziare trattamenti di Fe nell'irrigazione, secondo le concentrazioni adatte per l'esperimento. Ad esempio, abbiamo utilizzato un intervallo di concentrazioni di ferro da 0 a 6 mM, completato da un chelatore Fe solubile (Fe EDDHA). Irrigare le piante con la soluzione appropriata ogni due giorni (per evitare la disidratazione) per 6-8 giorni.</li>
</ol>2. preparazione delle foglie per la misura di ferro
Note: Tutti i materiali da utilizzare devono essere esente da ferro in modo da ridurre il rischio di contaminazione da ferro. Pulire il mortaio e il pestello due volte con soluzione di HCl 4% e asciugare con carta da filtro ogni volta prima dell'uso. Se qualsiasi materiale viene riutilizzato, pulirlo due volte con una soluzione di HCl 4% e asciugare con carta da filtro.
<ol><li>Staccare le foglie dal gambo a mano, utilizzando guanti (non utilizzare qualsiasi apparecchiatura del metallo). Utilizzare circa 10 g di foglie (peso fresco) per ogni campione. Pulire ogni foglia con doppia acqua distillata (DDW) utilizzando un flacone spray. Questo passaggio è importante per evitare la contaminazione di Fe.</li>
	<li>Asciugare le foglie su un tovagliolo di carta e metterli in un sacchetto di carta. Trasferire i sacchi di carta da forno ad una temperatura costante di 80 ° C per 2-3 giorni.</li>
	<li>Quando asciutto, schiacciare le foglie in polvere utilizzando un mortaio e pestello e trasferimento a tubi in plastica sterili da 15 mL.</li>
</ol>3. bruciare le foglie di frassino
Note: L'utilizzo di una basso pH (vicino a 0) soluzione di HCl è destinato per aumentare la solubilità del ferro. La lana di roccia viene utilizzata per impedire i gas di fuggire il flaconcino durante la masterizzazione.
<ol><li>Pesare una fiala di scintillazione 20ml nuovo, sigillato senza coperchio. Prendere nota del valore o impostare il valore su zero utilizzando il tasto tare. Aggiungere i fogli secchi schiacciati (campione) nel flaconcino.</li>
	<li>Pesare il campione e il contenitore e prendere nota del valore. Chiudere la cuvetta con lana di roccia.</li>
	<li>Pesare 3 fiale aggiuntive senza aggiungere campioni e notare i loro valori. Queste fiale usarsi come controlli per valutare la quantità di lana di roccia che potrebbe condurre ad un aumento in peso del campione.</li>
	<li>Posizionare le fiale del campione e controllo in una fornace e avviare la masterizzazione utilizzando la seguente procedura di temperatura: temperatura ambiente, rapido aumento di 425 ° C e, infine, a 425° C per 4 ore. Entro questo tempo, le foglie secche si sono rivolti alla cenere.</li>
	<li>Lasciate raffreddare il campioni a circa 100 ° C, ma non sotto questa temperatura per i due passaggi seguenti evitare l'umidità, che potrebbe pregiudicare il peso finale del campione. Utilizzando guanti pesanti, rimuovere i campioni dalla fornace con le pinzette, tenendo il flaconcino esteriormente.</li>
	<li>Posizionare le fiale su una superficie piana, rimuovere la lana di roccia e chiudere i flaconi con i loro coperchi originali.</li>
	<li>Pesare le fiale di 3 controllo (Vedi 3.3) e calcolare il loro guadagno di peso medio. Se l'aumento di peso è uguale o superiore all'1% del peso della cenere (Vedi punto 4.2), utilizzare questo valore come una stima dell'errore di misurazione.</li>
</ol>4. preparare le ceneri per la misura di ferro
Note: La concentrazione di ferro finale nel campione iniziale viene calcolata come il peso delle ceneri diviso per il volume aggiunto di HCl.
<ol><li>Preparare una soluzione di HCl 1 M (4% HCl) con l'aggiunta di 12,5 mL di una soluzione madre di HCl 37% a 87,5 mL di DDW (in un fiasco di vetro o plastica).</li>
	<li>Pesare un tubo di plastica da 15 mL e prendere nota del valore o impostare il valore su zero utilizzando il tasto tare. Trasferire le ceneri sul tubo, pesare e prendere nota del valore. Questo è il peso di cenere.</li>
	<li>Aggiungere 5 mL di 1 M HCl per le ceneri. Le ceneri filtrare su un filtro 22 µm e aggiungere un ulteriore 5 mL di 1 M HCl attraverso lo stesso filtro.</li>
	<li>Il volume finale deve essere di 10 mL. Si noti che parte della soluzione sarà perso nel filtro. Nota: I campioni sono ora pronti per la misurazione di Fe FAAS oppure dal metodo blu di Prussia.</li>
	<li>Fare una curva di calibrazione con la concentrazione di Fe misurata mediante Spettrometria atomica e dal metodo prussiano blu (Vedi Figura 4) per ogni specie di pianta. Successivamente, concentrazione di Fe può essere misurata con il metodo prussiano blu da solo.</li>
</ol>5. misurazione della concentrazione di Fe da FAAS
<ol><li>Rimuovere da 4 mL di ogni campione per la misura di FAAS.</li>
	<li>Dividere i risultati ottenuti dalla misurazione FAAS dal peso delle ceneri. Dividere il valore risultante da 0,01 (perché le ceneri erano solubilizzate in 10 mL). Il valore risultante è la concentrazione di ferro per grammo cenere (ppm).</li>
</ol>6. preparare il blu di Prussia macchiatura soluzione
<ol><li>Preparare un 4% soluzione di blu di Prussia con l'aggiunta di 4 g di K4Fe(CN)6 a 100 mL DDW e vortice (altri volumi e/o concentrazioni possono essere utilizzate per diverse esigenze). Si noti che in questo studio, un meno concentrata soluzione blu di Prussia che è stato utilizzato precedentemente segnalati (20%)14 .</li>
	<li>Mantenere la soluzione al buio a 4 ° C fino all'utilizzo. La soluzione è stabile per 6 mesi se conservato a tali condizioni.</li>
</ol>7. generazione di una curva di calibrazione per il metodo di blu di Prussia utilizzando FAAS risultati
Nota: Calcolare la concentrazione di ferro nella cenere utilizzando la seguente formula <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57408/57408eq1.jpg">Equazione 1 C: concentrazione, v: volume, peso di w: cenere (g) del campione.
<ol><li>Mescolare 0,50 mL di soluzione di blu di Prussia e 0,50 mL di 1 M HCl. Questo servirà come la soluzione vuota.</li>
	<li>Mescolare 0,5 mL di campione (ceneri nel 4% HCl, come descritto nella sezione 3) e 0,5 mL di soluzione di blu di Prussia (punto 6.1) di pipettaggio. Attendere almeno 1 minuto, ma non più di 5 minuti. Dopo 5 minuti, si verificherà la sedimentazione nei campioni.</li>
	<li>Trasferire il mix in una cuvetta e misurare il diametro esterno a 715 nm utilizzando uno spettrofotometro. Prendere nota del valore.</li>
	<li>Dividere il valore di OD (punto 7.3) per il peso della cenere (punto 3.2) del campione. Il risultato rappresenta OD al grammo cenere.</li>
	<li>Tracciare la regressione lineare fra le concentrazioni di ferro ottenuti da misurazioni FAAS (asse Y) e i valori di OD (asse X). Utilizzare i risultati ottenuti ai punti 5.2 e 7.4. Calcolare la formula di regressione, Y = a + bX, dove Y rappresenta la concentrazione di ferro, una rappresenta l'assorbanza si intersecano, b rappresenta la pendenza di assorbanza e X rappresenta il OD.</li>
</ol>8. utilizzando il metodo di blu di Prussia per determinare i livelli di ferro in altri campioni provenienti dallo stesso tipo di pianta
Note: Dal momento che una curva di taratura è già stata stabilita per questo tipo di pianta, concentrazione di ferro in qualsiasi nuovi campioni provenienti dallo stesso tipo di pianta può essere direttamente calcolato utilizzando la formula di regressione lineare.
<ol><li>Eseguire i passaggi nelle sezioni 3 e 4, seguita da passaggi 7.1 a 7.4.</li>
	<li>Calcolare la concentrazione di ferro in soluzione mediante la formula ottenuta dalla regressione lineare (punto 7.5).</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Misurazione di ferro nei tessuti vegetali è molto importante per la valutazione degli effetti di irrigazione o altre condizioni ambientali. Qui, abbiamo descritto un metodo colorimetrico facile e preciso per la misurazione del contenuto Fe in foglie di tabacco, che può essere facilmente adattato ad altre specie di piante e tessuti.
Nell'ottimizzazione delle condizioni per il metodo colorimetrico, abbiamo usato un mezzo a basso pH (pH < 1.0) per consentire la solubilità del ferro. Il processo di masterizzazione è stato effettuato per rilasciare tutte le forme di ferro e per garantire che nessun contaminanti presenti nei campioni sarebbero modificare i risultati. Per quanto riguarda la contaminazione del ferro, si dovrebbe tenere a mente che il 6,7% della crosta terrestre comprende ossido di ferro (FeOn) specie21 e che le loro concentrazioni possono raggiungere 0,009% del peso a secco di pianta22. Pertanto, si dovrebbe considerare il rischio di contaminazione da polvere, che può contenere tanto quanto 3-7% ferro (a seconda della regione)23, possono influenzare notevolmente i risultati. È anche indispensabile controllare attentamente il contenuto di ferro di tutte le apparecchiature utilizzate nell'esperimento e di prendere tutte le precauzioni necessarie per evitare la contaminazione. Si consiglia di pulire tutte le apparecchiature che era stato a contatto con aria o che è da riutilizzare nell'esperimento con 4% HCl soluzione. L'uso di qualsiasi strumenti metallici, come forbici o cucchiai, dovrebbe essere totalmente evitato, invece di essere sostituito da versioni in plastica o vetro. Fasi critiche per evitare la contaminazione del ferro sono state evidenziate ai punti 3.1 e 4.1, per esempio.
Non riuscendo ad ottenere un segnale da un campione potrebbe verificarsi a causa di problemi legati alle diverse fasi del protocollo. In questo caso, si raccomanda di controllare i reagenti contro soluzioni con una concentrazione di ferro noto. Se i problemi persistono, deve essere preparato fresco reagente blu di Prussia. Dovrebbe la norma, tuttavia, mostrano un segnale, questo indica che la concentrazione di ferro nel campione era sotto la soglia di rilevazione e che il campione dovrebbe essere più concentrato. Grandi variazioni tra repliche potrebbero derivare da contaminazione da ferro e richiedono l'uso di nuovi campioni.
Curve di taratura devono essere generati ogni sei mesi o ogni volta che un nuovo lotto di reagente blu di Prussia è usato. La curva di taratura iniziale dovrebbe essere riconvalidata contenuto di ferro in almeno 6 campioni di misura e confermando che la regressione lineare è ancora precisa. In curve di calibrazione, è essenziale per ottenere i valori nei pressi di + 1 o -1 per r (il coefficiente di correlazione) e 1 per R2 (il coefficiente di determinazione)24,25,26. Mentre una linea perfetta avrebbe un valore di2 R di 1, la maggior parte R2 valori sopra 0.95 sono accettabili per le curve di calibrazione.
Limitazioni del protocollo includono il fatto che specie e tessuti vegetali differenti possono mostrare le curve di correlazione diversi utilizzando le procedure descritte per la determinazione di concentrazione di ferro. Pertanto, si consiglia di eseguire un test pilota per garantire che la curva di correlazione è precisa per un determinato esperimento. Per utilizzare la curva per risultati ottenuti, il valore di OD appena misurato deve essere sostituito nella formula Y = a + bX. Nel caso di specie, è stata utilizzata la seguente formula: [Fe] = 0,32 + 25,3 x OD.
Un'altra limitazione nasce dall'esigenza di una quantità piuttosto grande di tessuto vegetale. Questo può essere aggirato in una certa misura, adattando il volume di HCl utilizzato per sciogliere le ceneri (Vedi punto 5.3) in modo da ottenere un segnale adeguato. Tuttavia, il metodo qui descritto è una buona opzione se costose apparecchiature, come quello usato per ICP-MS, pronto accesso a FAAS o non sono disponibile e/o numerosi campioni della stessa specie vegetale devono essere analizzati.
Ulteriori possibili applicazioni del metodo prussiano blu come un sistema di rilevamento di ferro comprendono la rilevazione quantitativa di ferro in qualsiasi materiale organico che può essere portato ad ash, nonché in materia inorganica, come suoli.

Ferro (Fe) è un micronutriente importante in tutti gli organismi viventi. Nelle piante, è un micronutriente essenziale1 a causa del suo coinvolgimento in processi di base, come la respirazione, la fotosintesi e la clorofilla biosintesi. Elevato accumulo di ioni di ferro libero è nociva alla pianta cellule a causa di reazioni che portano alla liberazione di radicali liberi che causano stress ossidativo. Per mantenere l'omeostasi del ferro all'interno della cellula vegetale, gli ioni sono memorizzati nei vacuoli e sequestrati all'interno di ferritine, gabbie di proteina direttamente coinvolte nell' omeostasi di ferro2 e la struttura di archiviazione principale del ferro in tutti gli organismi viventi. Allo stesso tempo, l'anemia sideropenica colpisce una percentuale significativa della popolazione umana, risultante in un crescente bisogno di pianta Fe bioarricchimento. A causa delle proprietà uniche di ferritina pianta, arricchimento di cibo con ferritina-ferro offre una strategia promettente per combattere questo problema della malnutrizione3.
Gli ioni di ferro sono principalmente trovati in due stati di ossidazione, vale a dire i metalli ferrosi (ferro (II) o bivalente Fe2 + ) e ferrico (ferro (III) o trivalente Fe3 + ) forme. Diverse altre forme di ferro, come ferro cluster4, si trovano anche nelle cellule. Fe è memorizzato come ossido di ferro all'interno della cella e naturalmente ematiti forme (Fe2O3) e ferryhidrites ((Fe3 +)2O30,5 H2O) sotto condizioni fisiologiche5. Idrossidi formate in queste reazioni, soprattutto la forma ferrica, hanno solubilità molto bassa. Ritenzione di ferro conseguenza è influenzata dal pH della soluzione ed è in gran parte in uno stato solido sopra pH 56.
Considerando la scarsa solubilità e l'alta reattività del Fe, suo trasferimento tra organi e tessuti vegetali deve essere associato a molecole chelanti adatte. Inoltre, i suoi Stati redox tra i moduli ferrosi e ferrici1 devono essere controllati. All'interno di foglie, circa l'80% del ferro si trova nelle cellule fotosintetiche, a causa di suoi ruoli essenziali del sistema di trasporto dell'elettrone, nella biosintesi dei citocromi, clorofilla e altre molecole di eme e nella formazione di Fe-S cluster7. Nel caso di ferro in eccesso all'interno della cellula, l'eccedenza è traslocata nel vacuolo dove il metallo è memorizzato in molecole di ferritina8.
Ferro da stiro può essere misurata nei tessuti vegetali da diversi metodi, tra cui fiamma spettroscopia ad assorbimento atomico9 (FAAS) o saggi colorimetrici10, il primo è molto più precisa rispetto al secondo. FAAS è una tecnica estremamente precisa che consente di determinare la composizione elementare di un campione con l'emissione elettromagnetica dei singoli elementi. FAAS converte ioni metallici stati atomici di fiamma-riscaldamento del campione, che conduce agli ioni eccitazione e di emissione di una specifica lunghezza d'onda quando un determinato ione ritorna al suo stato fondamentale. Le emissioni da diversi ioni sono separate da un monocromatore e rilevate da un sensore di assorbimento11. FAAS quindi serve a quantificare direttamente le concentrazioni di ferro. Altre tecniche per la visualizzazione di ferro nei tessuti biologici sono, tuttavia, disponibili. Spettroscopia di massa del plasma ad accoppiamento induttivo (ICP-MS)12 è una tecnica molto precisa per la misurazione del ferro e altri oligoelementi, ma la mancanza di attrezzature, sia per FAAS e ICP-MS, è un problema comune. D'altra parte, misura del ferro di tiocianato colorimetria13 manca di precisione e non riesce a rilevare piccole variazioni tra campioni. 14,15,16,di colorazione blu di Prussia17 è un metodo indiretto basato sulla reazione di ferrocianuro ferrico di potassio (K4Fe(CN)6) con cationi di Fe, producendo un colore blu forte e viene utilizzato per la rilevazione qualitativa di ferro nelle sezioni istologiche dei tessuti animali e vegetali.
Ferro metallico (zero-valent) è rara nella litosfera. La forma ionica non complessato dominante di ferro nell'ambiente è principalmente dettata dalla quantità di ossigeno nei dintorni, con ferro ferroso, essendo relativamente più abbondante in ambienti anossici e ferro ferrico che predomina nei siti di aerobiche. Quest'ultima forma è anche dominante in ambienti estremamente acidi, anche se gli agenti causali di ossidazione del ferro ferroso spesso differiscono in un ambiente anossico e acide18. Quando il ferro viene solubilizzato in 4% HCl (pH 0) in un ambiente aerobico, la maggior parte del ferro diluito esiste come forma il ferrico (Fe3 +)19,20.
Le reazioni tra ioni Fe e K4Fe(CN)6 sono come segue:
Fe3 +: FeCl3 + K4Fe(CN)6 = KFe(III)Fe(II)(CN)6¯ + 3KCl
Fe2 +: 4 FeCl2 + 2K4Fe(CN)6 = Fe4(Fe(CN)6)2 + 8 KCl
Nello studio presente, abbiamo chiesto se la colorazione blu di Prussia può essere utile per misurare i livelli di ferro in soluzione.
Inizialmente, abbiamo verificato la correlazione tra la concentrazione di Fe in soluzione acquosa e colorazione blu di Prussia. La concentrazione di Fe (come FeCl2, FeCl3 o una miscela di 1:1 dei due) in soluzioni acquose è stata misurata sia di assorbanza (OD) di spettroscopia atomica dopo l'aggiunta del blu di Prussia. La figura 1 Mostra le curve di regressione lineare per misurazioni ottenute da ciascun metodo. Abbiamo concluso che il metodo prussiano blu può essere utilizzato per l'analisi quantitativa della concentrazione di ferro in soluzione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57408/57408fig1.jpg"> Figura 1: regressione lineare tra concentrazione di Fe misurata FAAS e assorbanza della luce (OD, 715 nm) ottenuti con il metodo prussiano blu. I quadrati blu e linea rappresentano la soluzione di Fe2 + , i quadrati rossi e linea rappresentano la soluzione3 + Fe e i quadrati neri e linea rappresentano una miscela 1:1 tra Fe2 + e Fe3 +. Le regressioni seguenti sono state ottenute: [Fe2 +] = 3 + 123 x OD, r = 0,996, R2 = 0,989; [Fe3 +] = 1 + 292 x OD, r = 0,999, R2 = 0.997; e [Fe2 + 3 +] = 11 + 146 x OD, r = 0,983, R2 = 0.956. Il Fe2 + donatore era FeCl2 e il Fe3 + donatore era FeCl3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57408/57408fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Per adattare il metodo colorimetrico blu di Prussia per l'analisi quantitativa di ferro dei tessuti vegetali, il contenuto di ferro delle ceneri di foglia di tabacco è stato misurato dalla spettroscopia di assorbimento atomico di fiamma e colorazione blu di Prussia. C'era buona correlazione tra i risultati di due tecniche.

<table><tbody><tr><td>Potassium Hexacyanoferrate(II)</td><td>Fisher Chemical</td><td>14459-95-1</td><td>Reagent for the Pussian Blue</td></tr><tr><td>Millex Syringe Filter Unit, Vial Vent 0.22 &amp;mu;m</td><td>Millec</td><td>SLGP033RS</td><td>Filter used to filter the ashes + 4% HCl Solution</td></tr><tr><td>Scintillation Vials</td><td>Fisherbrand</td><td>03-337-4</td><td>Used to keep the dry powdered plant material during the burning procedure.</td></tr><tr><td>Disposable Syringe 10 ml</td><td>Medi-Plus</td><td>1931</td><td>Syringe used during the filtration</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>231-595-7</td><td>Used in the 4% HCl solution to dilute the ashes and clean the materials</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Tobacco, Nicotiana tabacum&lt;/em&gt; cv. Samsun NN</td><td>Obtained from Prof. Simon Barak and routinely used in the Zaccai Lab</td><td>Barak S, Nejidat A, Heimer Y, Volokita M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of the glycolate oxidase gene in tobacco seedlings. Plant Molecular Biology. 2001 Mar 1;45(4):399-407.</td><td>Tobacco cultivar used in this protocol</td></tr><tr><td>Glass Wool (Rock Wool)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>659997-17-3</td><td>Used in the procedure of burning samples in the furnace.</td></tr></tbody></table>

a colorimetric method for measuring iron content in plants

Ferro, uno dei più importanti micronutrienti negli organismi viventi, è coinvolto in processi di base, come la respirazione e la fotosintesi. Contenuto di ferro è piuttosto bassa in tutti gli organismi, pari a piante a circa 0,009% del peso secco. Ad oggi, uno dei metodi più precisi per misurare la concentrazione di ferro nei tessuti vegetali è fiamma spettroscopia di assorbimento atomico. Tuttavia, questo approccio è che richiede tempo e costoso e richiede attrezzature specifiche non comunemente trovate in laboratori di pianta. Pertanto, è necessario un metodo più semplice, ma preciso che può essere utilizzato regolarmente. Il metodo colorimetrico di blu di Prussia è regolarmente utilizzato per ferro qualitativo colorazione nelle sezioni istologiche di animali e vegetali. In questo studio, abbiamo adattato il metodo per la misurazione quantitativa del ferro nel tabacco lascia il blu di Prussia. Abbiamo validato la precisione di questo metodo utilizzando sia la spettroscopia atomica e blu di Prussia macchiatura per misurare il contenuto di ferro negli stessi campioni e trovato una regressione lineare (R2 = 0,988) fra le due procedure. Concludiamo che il metodo di blu di Prussia per la misurazione quantitativa del ferro nei tessuti vegetali è preciso, semplice e poco costoso. Tuttavia, la regressione lineare qui presentata non può essere appropriata per altre specie di piante, a causa di potenziali interazioni tra il campione e il reagente. Istituzione di una curva di regressione è quindi necessaria per diverse specie di piante.

Quando questo protocollo viene eseguito correttamente, si dovrebbe avere ottima correlazione tra i risultati ottenuti con i metodi di spettroscopia atomica e blu di Prussia. Pertanto, il metodo blu di Prussia può essere facilmente utilizzato per ottenere una misurazione accurata della concentrazione di ferro in campioni di piante, come risulta il seguente esperimento.
Piante di tabacco erano cresciute come descritto nel protocollo e irrigate con acqua contenente concentrazioni differenti del ferro (0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 mM) per 7 giorni. Le piante sono state poi raccolte, pulite e secchi per 3 giorni a 80 ° C. I passaggi successivi (cioè, dal punto 2.3) del protocollo sono stati seguiti come descritto. Poiché le fiale di controllo ha mostrato una variazione inferiore al 1% del peso di cenere, questo valore non è stato aggiunto per ulteriori calcoli.
Concentrazione di ferro è stato misurato da FAAS. La tabella 1 Mostra i risultati rappresentativi di queste misurazioni. I dati ottenuti da 21 campioni (7 concentrazioni in 3 replica) sono stati utilizzati per generare una curva di calibrazione.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Trattamento (ferro mM nell'irrigazione)</td>
			<td>Pianta</td>
			<td>Concentrazione di ferro in soluzione di HCl (ppm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td>A</td>
			<td>7.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>B</td>
			<td>16,6</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>C</td>
			<td>23,4</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>D</td>
			<td>31,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>F</td>
			<td>47,4</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>G</td>
			<td>50,7</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>H</td>
			<td>41,6</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Concentrazione di ferro nelle soluzioni di cenere di tabacco foglie da piante irrigate con acqua contenente livelli differenti del ferro.
La concentrazione di ferro nelle ceneri dei 21 campioni sopra citati è stata calcolata utilizzando i valori ottenuti da FAAS (Vedi nota nel passaggio 7). I risultati hanno mostrato che la concentrazione di ferro nell'acqua di irrigazione notevolmente influenzato il contenuto di ferro foglia (Figura 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57408/57408fig2.jpg"> Figura 2: effetto del ferro fornito nell'irrigazione sulla concentrazione di ferro nel tabacco foglie. Barre rappresentano deviazioni standard (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57408/57408fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
In un esperimento preliminare (non mostrato), sono stati misurati gli spettri di assorbanza delle soluzioni contenenti diverse concentrazioni di Fe2 + e Fe3 + e il picco migliore è stato ottenuto a 715 nm. Tutti gli spettri dei 21 campioni sono stati testati anche con il metodo blu di Prussia. Era chiaro che assorbanza a 715 nm è stata anche la lunghezza d'onda ottima qui pure (Figura 3). Di conseguenza, questa lunghezza d'onda è stata utilizzata in tutti gli esperimenti.
Una curva di regressione lineare è stata tracciata tra i valori di concentrazione di ferro ottenuti da FAAS e i valori di assorbanza (OD) ottenuti utilizzando il metodo prussiano blu per gli esempi rappresentati in Figura 3 (Figura 4). È stata ottenuta la regressione seguente: [Fe] = 0,32 + 25,3 x OD, r = 0,994 e R2= 0,988.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57408/57408fig3.jpg"> Figura 3: spettri di lunghezza d'onda di assorbanza delle ceneri di tabacco mescolano con soluzione di blu di Prussia come descritto nel protocollo. Gli spettri di lunghezza d'onda sono stati divisi dalla concentrazione di cenere. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57408/57408fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57408/57408fig4.jpg"> Figura 4: le regressioni lineari di concentrazione di Fe in frassino tabacco misurata FAAS e assorbanza della luce (OD, 715 nm) ottenuti con il metodo del blu di Prussia. È stata ottenuta la regressione seguente: [Fe] = 0,32 + 25,3 x OD, r = 0,994, R2= 0,988. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57408/57408fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
La regressione lineare ottenuta ora può essere utilizzata per nuovi campioni provenienti dallo stesso tipo di pianta, come indicato nel passaggio 8.

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A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Un metodo colorimetrico per la misurazione del ferro contenuto nelle piante

Vi presentiamo un protocollo semplice e affidabile per misurare il contenuto di ferro nei tessuti vegetali, utilizzando il metodo colorimetrico di blu di Prussia.

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

a-colorimetric-method-for-measuring-iron-content-in-plants

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

22.0K Views.  Ben-Gurion University of the Negev. Vi presentiamo un protocollo semplice e affidabile per misurare il contenuto di ferro nei tessuti vegetali, utilizzando il metodo colorimetrico di blu di Prussia.

Video: A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop cultivars against environmental stresses. An experimental protocol is presented for RGB and hyperspectral imaging of root systems. The approach uses rhizoboxes where plants grow in natural soil over a longer time to observe fully developed root systems. Experimental settings are exemplified for assessing rhizobox plants under water stress and studying the role of roots. An RGB imaging setup is described for cheap and quick quantification of root development over time. Hyperspectral imaging improves root segmentation from the soil background compared to RGB color based thresholding. The particular strength of hyperspectral imaging is the acquisition of chemometric information on the root-soil system for functional understanding. This is demonstrated with high resolution water content mapping. Spectral imaging however is more complex in image acquisition, processing and analysis compared to the RGB approach. A combination of both methods can optimize a comprehensive assessment of the root system. Application examples integrating root and aboveground traits are given for the context of plant phenotyping and plant physiological research. Further improvement of root imaging can be obtained by optimizing RGB image quality with better illumination using different light sources and by extension of image analysis methods to infer on root zone properties from spectral data.

An experimental protocol is presented for assessment of soil grown plant root systems with RGB and hyperspectral imaging. Combination of RGB image time series with chemometric information from hyperspectral scans optimizes insights into plant root dynamics.

RGB e Imaging spettrale radice per pianta Phenotyping e ricerca fisiologica: messa a punto sperimentale e protocolli di Imaging

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop ...

Ricerca

Ambiente

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn (Zea mays) As an Exemplar

Elemental data are commonly used to infer plant quality as a resource to herbivores. However, the ubiquity of carbon in biomolecules, the presence of nitrogen-containing plant defensive compounds, and variation in species-specific correlations between nitrogen and plant protein content all limit the accuracy of these inferences. Additionally, research focused on plant and/or herbivore physiology require a level of accuracy that is not achieved using generalized correlations. The methods presented here offer researchers a clear and rapid protocol for directly measuring plant soluble proteins and digestible carbohydrates, the two plant macronutrients most closely tied to animal physiological performance. The protocols combine well characterized colorimetric assays with optimized plant-specific digestion steps to provide precise and reproducible results. Our analyses of different sweet corn tissues show that these assays have the sensitivity to detect variation in plant soluble protein and digestible carbohydrate content across multiple spatial scales. These include between-plant differences across growing regions and plant species or varieties, as well as within-plant differences in tissue type and even positional differences within the same tissue. Combining soluble protein and digestible carbohydrate content with elemental data also has the potential to provide new opportunities in plant biology to connect plant mineral nutrition with plant physiological processes. These analyses also help generate the soluble protein and digestible carbohydrate data needed to study nutritional ecology, plant-herbivore interactions and food-web dynamics, which will in turn enhance physiology and ecological research.

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn Zea mays As an Exemplar

The protocols described herein provide a clear and approachable methodology for measuring soluble protein and digestible (non-structural) carbohydrate content in plant tissues. The ability to quantify these two plant macronutrients has significant implications for advancing the fields of plant physiology, nutritional ecology, plant-herbivore interactions and food-web ecology.

Quantificare la pianta proteina solubile e digeribile carboidrati contenuti, utilizzando mais (Zea mays) As an Exemplar

Elemental data are commonly used to infer plant quality as a resource to herbivores. However, the ubiquity of carbon in biomolecules, the presence of ...

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative conditions. Excessive iron results in free redox-active Fe(II) and can cause devastating effects within the cell like oxidative stress (OS) and death by lipid peroxidation known as ferroptosis (FPT). Therefore, quantitative measurements of ferrous (Fe(II)) and ferric (Fe(III)) iron rather than total Fe-determination is the key for closer insight into these detrimental processes. Since Fe(II)/(III) determinations can be hampered by fast redox-state shifts and low concentrations in relevant samples, like cerebrospinal fluid (CSF), methods should be available that analyze quickly and provide low limits of quantification (LOQ). Capillary electrophoresis (CE) offers the advantage of fast Fe(II)/Fe(III) separation and works without a stationary phase, which could interfere with the redox balance or cause analyte sticking. CE combined with inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) as a detector offers further improvement of detection sensitivity and selectivity. The presented method uses 20 mM HCl as a background electrolyte and a voltage of +25 kV. Peak shapes and concentration detection limits are improved by conductivity-pH-stacking. For reduction of 56[ArO]+, ICP-MS was operated in the dynamic reaction cell (DRC) mode with NH3 as a reaction gas. The method achieves a limit of detection (LOD) of 3 &#181;g/L. Due to stacking, higher injection volumes were possible without hampering separation but improving LOD. Calibrations related to peak area were linear up to 150 &#181;g/L. Measurement precision was 2.2% (Fe(III)) to 3.5% (Fe(II)). Migration time precision was &#60;3% for both species, determined in 1:2 diluted lysates of human neuroblastoma (SH-SY5Y) cells. Recovery experiments with standard addition revealed accuracy of 97% Fe(III) and 105 % Fe(II). In real-life bio-samples like CSF, migration time can vary according to varying conductivity (i.e., salinity). Thus, peak identification is confirmed by standard addition.

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry CE-ICP-MS for Quantification of Iron Redox Species FeII, FeIII

This iron redox speciation method is based on capillary electrophoresis-inductively coupled plasma mass spectrometry with sample stacking combined with short analysis in one run. The method quickly analyzes and provides low limits of quantification for iron redox species across a diverse range of tissues and biofluid samples.

Impostazione della spettrometria di massa al plasma accoppiata capillare (CE-ICP-MS) per la quantificazione delle specie di iron Redox (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...

Chimica

<meta charset="utf8"></head><body>Saggio fluorescente per la rilevazione di nuovi chelanti del ferro

Quantifiable and Inexpensive Cell-Free Fluorescent Method to Confirm the Ability of Novel Compounds to Chelate Iron

Cancer cells require large amounts of iron to maintain their proliferation. Iron metabolism is considered a hallmark of cancer, making iron a valid target for anti-cancer approaches. The development of novel compounds and the identification of leads for further modification requires that proof of mechanism assays be carried out. There are many assays to evaluate the impact on proliferation; however, the ability to chelate iron is an important and sometimes overlooked end-point measure due to the high costs of equipment and the challenge to quickly and reproducibly quantify the strength of chelation. Here, we describe a quantifiable and inexpensive cell-free fluorescent method to confirm the ability of novel compounds to chelate iron. Our assay relies on the commercially available inexpensive fluorescent dye Calcein, whose fluorescence can be quantified on most fluorescent microtiter plate readers. Calcein is a weak iron chelator, and its fluorescence is quenched when it binds Fe2+/3+; fluorescence is restored when a novel chelator outcompetes Calcein for bound Fe2+/3+. The removal of fluorescent quenching and the resulting increase in fluorescence allows the chelation ability of a novel putative chelator to be determined. Therefore, we offer an inexpensive, high-throughput assay that allows the rapid screening of novel candidate chelator compounds.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Valutazione dell'impatto di nuovi chelanti del ferro sul metabolismo delle cellule tumorali

We describe a fluorescent assay that can quickly and inexpensively confirm the ability of novel compounds to chelate iron. The assay measures the ability of compounds to outcompete the iron binding activity of the weak iron chelating fluorescent probe Calcein, resulting in a quantifiable increase in fluorescence when chelation occurs.

Metodo fluorescente quantificabile ed economico per confermare la capacità di nuovi composti di chelare il ferro 

Cancer cells require large amounts of iron to maintain their proliferation. Iron metabolism is considered a hallmark of cancer, making iron a valid target ...

Ricerca sul cancro

Measurement of Tissue Non-Heme Iron Content using a Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay

Iron is an essential micronutrient. Both iron overload and deficiency are highly detrimental to humans, and tissue iron levels are finely regulated. The use of experimental animal models of iron overload or deficiency has been instrumental to advance knowledge of the mechanisms involved in the systemic and cellular regulation of iron homeostasis. The measurement of total iron levels in animal tissues is commonly performed with atomic absorption spectroscopy or with a colorimetric assay based on the reaction of non-heme iron with a bathophenanthroline reagent. For many years, the colorimetric assay has been used for the measurement of the non-heme iron content in a wide range of animal tissues. Unlike atomic absorption spectroscopy, it excludes the contribution of heme iron derived from hemoglobin contained in red blood cells. Moreover, it does not require sophisticated analytical skills or highly expensive equipment, and can thus be easily implemented in most laboratories. Finally, the colorimetric assay can be either cuvette-based or adapted to a microplate format, allowing higher sample throughput. The present work provides a well-established protocol that is suited for the detection of alterations in tissue iron levels in a variety of experimental animal models of iron overload or iron deficiency.

Here, a protocol for the measurement of the non-heme iron content in animal tissues is provided, using a simple, well-established colorimetric assay that can be easily implemented in most laboratories.

Misurazione del contenuto di ferro non eme tissutale utilizzando un saggio colorimetrico basato su bathofenantrolina

Iron is an essential micronutrient. Both iron overload and deficiency are highly detrimental to humans, and tissue iron levels are finely regulated. The ...

Medicina

Quantitating Iron Transport Across the Mouse Placenta In Vivo Using Nonradioactive Iron Isotopes

Iron is essential for maternal and fetal health during pregnancy, with approximately 1 g of iron needed in humans to sustain a healthy pregnancy. Fetal iron endowment is entirely dependent on iron transfer across the placenta, and perturbations of this transfer can lead to adverse pregnancy outcomes. In mice, measurement of iron fluxes across the placenta traditionally relied on radioactive iron isotopes, a highly sensitive but burdensome approach. Stable iron isotopes (57Fe and 58Fe) offer a nonradioactive alternative for use in human pregnancy studies.
Under physiological conditions, transferrin-bound iron is the predominant form of iron taken up by the placenta. Thus, 58Fe-transferrin was prepared and injected intravenously in pregnant dams to directly assess placental iron transport and bypass maternal intestinal iron absorption as a confounding variable. Isotopic iron was quantitated in the placenta and mouse embryonic tissues by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS). These methods can also be employed in other animal model systems of physiology or disease to quantify in vivo iron dynamics.

Quantitating Iron Transport Across the Mouse Placenta In Vivo Using Nonradioactive Iron Isotopes

This article demonstrates how to prepare and administer transferrin-bound nonradioactive isotopic iron for studies of iron transport in mouse pregnancy. The approach for quantifying isotopic iron in fetoplacental compartments is also described.

Quantificazione del trasporto del ferro attraverso la placenta di topo in vivo utilizzando isotopi di ferro non radioattivi

Iron is essential for maternal and fetal health during pregnancy, with approximately 1 g of iron needed in humans to sustain a healthy pregnancy. Fetal ...

Biologia

The Caco-2 Cell Bioassay for Measurement of Food Iron Bioavailability

Knowledge of Fe bioavailability is critical to the assessment of the nutritional quality of Fe in foods. In vivo measurement of Fe bioavailability is limited by cost, throughput, and the caveats inherent to isotopic labeling of the food Fe. Thus, there exists a critical need for an approach that is high-throughput and cost-effective. The Caco-2 cell bioassay was developed to satisfy this need. The Caco-2 cell bioassay for Fe bioavailability utilizes simulated gastric and intestinal digestion coupled with culture of a human intestinal epithelial cell line known as Caco-2. In Caco-2 cells, Fe uptake stimulates the intracellular formation of ferritin, an Fe storage protein easily measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Ferritin forms in proportion to Fe uptake; thus, by measuring Caco-2 cell ferritin production, one can assess intestinal Fe uptake from simulated food digests into the enterocyte. 
Via this approach, the model replicates the key initial step that determines food Fe bioavailability. Since its inception in 1998, this model approach has been rigorously compared to factors known to influence human Fe bioavailability. Moreover, it has been applied in parallel studies, with three human efficacy studies evaluating Fe biofortified crops. In all cases, the bioassay correctly predicted the relative amounts of Fe bioavailability from the factors, crops, and overall diet. This paper provides detailed methods on Caco-2 cell culture coupled with the in vitro digestion process and cell ferritin ELISA necessary to conduct the Caco-2 cell bioassay for Fe bioavailability.

The Caco-2 cell bioassay for iron (Fe) bioavailability represents a cost-effective and versatile approach to assess Fe bioavailability from foods, food products, supplements, meals, and even diet regimens. Thoroughly validated to human studies, it represents the state of the art for studies of Fe bioavailability.

Il saggio biologico delle cellule Caco-2 per la misurazione della biodisponibilità del ferro negli alimenti

Knowledge of Fe bioavailability is critical to the assessment of the nutritional quality of Fe in foods. In vivo measurement of Fe bioavailability is ...

Introduction to Mass Spectrometry

Source: Laboratory of Dr. Khuloud Al-Jamal - King&#39;s College London

Mass spectrometry is an analytical chemistry technique that enables the identification of unknown compounds within a sample, the quantification of known materials, the determination of the structure, and chemical properties of different molecules.
A mass spectrometer is composed of an ionization source, an analyzer,&#160;and a detector. The process involves the ionization of chemical compounds to generate ions. When using inductively coupled plasma (ICP), samples containing elements of interest are introduced into argon plasma as aerosol droplets. The plasma dries the aerosol, dissociates the molecules, and then removes an electron from the components to be detected by the mass spectrometer. Other ionization methods such as electrospray ionization (ESI) and matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) are used to analyze biological samples. Following the ionization procedure, ions are separated in the mass spectrometer according to their mass-to-charge ratio (m/z), and the relative abundance of each ion type is measured. Finally, the detector commonly consists in an electron multiplier where the collision of ions with a charged anode leads to a cascade of increasing number of electrons, which can be detected by an electrical circuit connected to a computer.
In this video, the procedure of ICP-MS analysis will be described by the detection of 56Fe as an example.

Un metodo colorimetrico per la misurazione del ferro contenuto nelle piante

Riepilogo

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Metodo fluorescente quantificabile ed economico per confermare la capacità di nuovi composti di chelare il ferro

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