Name: homogeneous time-resolved förster resonance energy transfer-based assay for detection of insulin secretion
Uploaded: 2018-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
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Os autores não têm nada para divulgar.

1. INS-1E células: manutenção e chapeamento
<ol><li>Manter células INS-1E numa incubadora de2 ˚C/5% CO 37 umidificado e culta com meio RPMI 1640 suplementado com 5% (v/v) inactivadas pelo calor fetal soro bovino, 2 mM L-glutamina, 10 mM HEPES, piruvato de sódio de 1 mM, 100 U/mL penicilina/estreptomicina solução de 50 µM de β-Mercaptoetanol. Cultura de células em meio RPMI 1640 completo de 10 mL (por placa), até atingirem a confluência de 80-90%, quando podem ser trypsinized e passadas ou usados para o ensaio de secreção de insulina.</li>
	<li>
Dia 1: Aspirar a mídia e lavar as células uma vez com 5 mL de PBS pré-aquecido. Adicione 0,5 mL de tripsina (0.025%) diluído 1:1 em 0,5 mL de PBS trypsinize as células e incubar durante 3-4 minutos a 37 ˚ c. Desactive a tripsina adicionando mídia completa 9 mL e a transferência de células para um tubo de centrífuga de 15 mL por pipetagem.</li>
	<li>Células de pelotas por centrifugação e ressuspender o centrifugado em aproximadamente 5 mL fresco meios de comunicação.</li>
	<li>Pegue 10 µ l de células re-suspensas e misture com 10 µ l corante vital de Trypan azul para verificar a viabilidade celular. Contar as células vivas e mortas em 10 µ l desta mistura usando um hemocytometer. Nível de viabilidade deve ser acima de 90%. Dilua as células re-suspensas em mídia fresca para 1 milhão de células por mL.</li>
	<li>Células de INS-1E de 0,5 mL de semente por bem em um poli-L-Lysine pré-revestido placa de 24, com uma densidade de 500.000 células/poço.</li>
	<li>
Dia 2: Remova a mídia 18-24h depois de chapeamento e adicionar 500 µ l/poço de mídia de RPMI 1640 fresco. Incube as células para outro 24h permitir que as células para se recuperar totalmente da etapa passaging prévia. Esse tempo adicional permite que as células a se espalhar na placa de cultura de tecidos.</li>
</ol>2. insulina secreção ensaio (dia 3)
<ol><li>Preparar o tampão KRB: 132,2 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 5mm NaHCO3, 0.5 mM NaH2PO4, 0.5 mM MgCl2, 1,5 mM CaCl2e 0,001 g/mL albumina de soro bovino (BSA), pH 7,4.</li>
	<li>Aspire os meios de comunicação de células e lave duas vezes com PBS pré-aquecido.</li>
	<li>Para a etapa de fome de glicose, adicione 450 µ l/poço KRB (contendo BSA) sem glicose para 1h 37 ˚C/5% CO2.</li>
	<li>Durante a etapa de fome de glicose, preparar diluições em série da droga (s) em KRB contendo 200 mM glicose (10 x concentração).<ol>
<li>Prepare a droga em 10 x a concentração final em KRB suplementado com glicose 200 mM (também 10 x a concentração final de glicose). Se o estoque de drogas (e mais o adicionado 10 x glicose) é em DMSO, certifique-se de percentual de DMSO é mantido consistente durante todo o ensaio (idealmente final percentual inferior a 0,1% DMSO).</li>
		<li>Para tratamentos de dopamina e quinpirole, usar um intervalo de concentração de drogas de ensaio final de 100 µM a 100 pM (do maior para menor concentração), com o último ponto da resposta dose não contendo nenhuma droga. Para bromocriptina, use um intervalo de concentração de ensaio final de 10 µM para 22:00, com o último ponto da resposta dose sendo o controle de drogas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Depois da fome de glicose, adicione diluições em série drogas para o ensaio para produzir uma resposta de dose.</li>
	<li>Adicione 50 µ l/poço de cada diluição serial nos poços correspondentes (ensaio total volume 500 µ l).</li>
	<li>Para a etapa de estimulação de glicose, incubar as células com as diluições de série respectivas drogas (na presença de glicose de 20 mM) durante 90 minutos a 37 ˚C/5% CO2. Incluem um conjunto de poços de controle: (1) estimulação com glicose 20mm sozinho na ausência de qualquer droga adicional e (2) células que nem são estimuladas com drogas nem glicose (que fornece uma taxa basal de secreção).</li>
	<li>Após a etapa de estimulação, remova com cuidado os sobrenadantes (uso diretamente ou loja no 4 ˚ c). Nota: Um passo de centrifugação suave adicional 5 min (600 g de x, 1 min) pode ser introduzido neste momento para remover quaisquer células remanescentes nos sobrenadantes de ensaio.</li>
</ol>3. HTRF a secreção de insulina medida
<ol><li>Dilua o ensaio sobrenadantes 01:10 em KRB (sem BSA), de preferência em placas de 96 poços claros.</li>
	<li>Prepare a curva padrão de insulina para o ensaio de insulina HTRF (tabela 1).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Solução-padrão estoque 500 ng/ml</td>
			<td>Diluições em série</td>
			<td>Trabalhando [insulina] ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 7</td>
			<td>30 µ l estoque + 140 µ l KRB</td>
			<td>150</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 6</td>
			<td>30 µ l STD 7 + 45 µ l KRB</td>
			<td>60</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 5</td>
			<td>30 µ l STD 6 + 45 µ l KRB</td>
			<td>24</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 4</td>
			<td>30 µ l STD 5 + 45 µ l KRB</td>
			<td>9.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>DST 3</td>
			<td>30 µ l STD 4 + 45 µ l KRB</td>
			<td>3,84</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 2</td>
			<td>30 µ l STD 3 + 45 µ l KRB</td>
			<td>1,54</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 1</td>
			<td>30 µ l STD 2 + 45 µ l KRB</td>
			<td>0,61</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 0</td>
			<td>µ l 45 KRB</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Nota: Estoque STD é 500 ng/ml</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1. Diluições em série para fazer a curva padrão de insulina.
<ol start="3"><li>Adicione as amostras de curva padrão e os sobrenadantes de ensaio diluída para a placa HTRF. A medição de insulina secretada por HTRF pode efectuar-se em um poço-96 ou um formato de placa 384, mantendo em mente que o volume de ensaio deve ser re-ajustado. Uso 10 µ l/poço amostra em brancas 96 poços meia-área chapas ou 5 µ l/poço em uma placa de baixo volume, fundo redondo 384-poço branco (consulte Tabela de materiais).</li>
	<li>Preparar a mistura de anticorpo no buffer de deteção (ver Tabela de materiais) em um doador de 1:2 (cryptate) / relação do aceitador (XL-665). Nota: Mais detalhes específicos sobre o ensaio HTRF estão disponíveis do fabricante.</li>
	<li>Adicione a mistura de anticorpos para o ensaio em 30 µ l/poço (para um formato de 96-placa de ensaio) ou 15 µ l/poço (para um formato de ensaio de placa 384).</li>
	<li>Selar a placa e incubar à temperatura ambiente.</li>
	<li>Ler a placa depois de 2h, 4h, e/ou incubação durante a noite com anticorpos usando o leitor e o módulo de óptica de HTRF apropriado (337 665 620 nm) (ver Tabela de materiais e as instruções do fabricante). Definir o início da integração em 60 µs e o tempo de integração em 400 µs. uso 200 pisca por bem. Nota: Estes parâmetros foram baseados na utilização de nosso leitor específico. A leitura a 620 nm e 665 nm pode variar entre diferentes instrumentos. Esta é uma das razões que sugerimos usar a relação de 665/620. No cálculo deste rácio, quaisquer diferenças de potencial de leitor para leitor vão ser normalizadas em fornecem valores consistentes independentemente do instrumento utilizado para medir a HTRF.</li>
</ol>4. normalização e análise de dados
<ol><li>Calcular as concentrações de insulina dos poços de ensaio através de extrapolação de ratiometric leituras de fluorescência (665 nm/620 nm) para uma segunda ordem polinomial curva quadrática (Figura 2).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57531/57531fig2.jpg"> Figura 2 : Curva padrão insulina. Estoque de insulina humana de concentrações conhecidas foi usado para gerar a curva padrão de insulina. Os rácios HTRF resultantes (665 nm / 620 nm) foram plotados contra as concentrações de insulina. Os dados foram o melhor ajuste para uma segunda curva polinomial quadrático de ordem (R2 = 0.99996). Esta é uma curva padrão representativa. Barras de erro = SEM. <a href="/files/ftp_upload/57531/57531fig2large.jpg" target="_blank">, por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="2"><li>Com os dados extrapolados como ng/mL de insulina secretada, normalize (insulina secretada em resposta ao aumento da concentração de ligante) para o valor médio de poços de teste a % máxima de insulina secreção (condição sozinho de glicose 20 mM).</li>
	<li>Use o ajuste de curva (R2) de uma única experiência para calcular a variação de intraplate. Dentro do experimento, derivado dos valores individuais de2 R as duplicatas intra experimentais, permitindo o cálculo do erro padrão da média para a curva de ajuste.</li>
	<li>Para determinar a variação interplate, use os dados de pelo menos três experimentos individuais para calcular o erro padrão da média para o valor de2 R da curva coletiva.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+nodes+in+signalling+pathways:+Insights+into+insulin+action.">Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (2), 85-96 (2006).</li><li>Vetere, A., Choudhary, A., Burns, S. M., Wagner, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+pancreatic+beta-cell+to+treat+diabetes.">Targeting the pancreatic beta-cell to treat diabetes.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (4), 278-289 (2014).</li><li>Despres, J. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+insulin+assay+by+homogenous+time-resolved+fluorescence.">Development of a rapid insulin assay by homogenous time-resolved fluorescence.</a> PLoS One. 11 (2), e0148684 (2016).</li><li>Simpson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine-mediated+autocrine+inhibitory+circuit+regulating+human+insulin+secretion+in+vitro.">Dopamine-mediated autocrine inhibitory circuit regulating human insulin secretion in vitro.</a> Mol Endocrinol. 26 (10), 1757-1772 (2012).</li><li>Heyduk, E., Moxley, M. M., Salvatori, A., Corbett, J. 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E., Sportsman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-resolved+fluorescence+immunoassay+for+insulin+in+rodent+plasma.">A time-resolved fluorescence immunoassay for insulin in rodent plasma.</a> J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 335-342 (1999).</li><li>Merglen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+sensitivity+and+metabolism-secretion+coupling+studied+during+two-year+continuous+culture+in+INS-1E+insulinoma+cells.">Glucose sensitivity and metabolism-secretion coupling studied during two-year continuous culture in INS-1E insulinoma cells.</a> Endocrinology. 145 (2), 667-678 (2004).</li><li>Ustione, A., Piston, D. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+receptor+D2+agonist+bromocriptine+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+by+direct+activation+of+the+alpha2-adrenergic+receptors+in+beta+cells.">The dopamine receptor D2 agonist bromocriptine inhibits glucose-stimulated insulin secretion by direct activation of the alpha2-adrenergic receptors in beta cells.</a> Biochem Pharmacol. 79 (12), 1827-1836 (2010).</li></ol>

Agradecemos Nicolas Pierre (Cisbio bioensaios) para conselhos úteis e Dr. Pierre Maechler (Universidade de Genebra) generosamente, fornecendo células INS-1E. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do departamento de defesa (grant PR141292 a Z.F.) e John F. e Nancy A. Emmerling fundo da Fundação de Pittsburgh (a Z.F.).

O ensaio de insulina HTRF descrito aqui oferece um sistema rápido e eficiente para medir a secreção de insulina de um sistema de baseados em células cultivada. Entre suas vantagens mais importantes, neste ensaio oferece um sinal baixo fundo devido a alta relação sinal-ruído. Além disso, confirmamos que o sinal HTRF é estável durante longos períodos de tempo (> 24 h)7. No entanto, desde que os anticorpos monoclonais de ligação de insulina rapidamente chegar a saturação de ligação a...

A regulação do metabolismo energético é aperfeiçoá-lo por um importante hormônio anabólico, a insulina. Insulina é sintetizada e liberada por células-beta do pâncreas em resposta aos níveis de glicose extracelular aumentado. A insulina liberada provoca a absorção de glicose pelos tecidos sensíveis à insulina1,2. Fisiologicamente, isto está ligado à elevação da concentração de glicose após uma refeição, seguida de secreção de insulina para regular a absorção de glicose. Perturbações na homeostase de glicose levam a deficiências metabólicas, culminando na resistência à insulina e, finalmente, no início da43,2,do diabetes tipo 2.
Embora a secreção de insulina tem sido extensivamente estudada, seus mecanismos regulatórios permanecem mal compreendidos. Uma área crítica de investigação tem sido a identificação de novos moduladores de secreção de insulina em células beta5,6,7,8. Estes estudos requerem uma melhor compreensão da relação de acoplamento entre a estimulação de glicose e a secreção de insulina. Portanto, a capacidade de precisão de monitorar e quantificar os níveis de secreção de insulina glicose-estimulada (GSIS) tem sido essencial. Até à data, no entanto, apenas um número limitado de métodos estava disponível para permitir a quantificação de GSIS usando linhas de células secretoras de insulina e/ou de ilhotas pancreáticas. Um é o radioimunoensaio (RIA), que utiliza anticorpos e insulina radioisótopo-tag. As principais limitações desta abordagem incluem questões de segurança devido à manipulação e eliminação de materiais radioactivos. Além disso, este método é trabalhoso, envolvendo múltiplos lavagem longa e etapas de incubação. Ensaio imunoenzimático (ELISA) é outra abordagem dispendiosa e trabalhosa que utiliza anticorpos para a deteção de insulina. Variação em afinidades de anticorpo e da eficiência de reconhecer a insulina estão limitando fatores desse método e pode afetar a reprodutibilidade dos resultados. ELISA, nem RIA foi projetado para experimentos de alta produtividade. AlphaScreen é um ensaio homogêneo usado para detectar e medir os níveis de secreção de insulina. AlphaScreen tecnologia baseia-se na conversão de oxigênio ambiente em um estado singlete oxigênio excitado que pode reagir com espécies quimioluminescente, resultando na geração de quimioluminescência. Porque o ensaio é homogêneo, muitas das etapas lavagem associadas a RIA e ELISA são eliminadas. No entanto, a instabilidade do sinal devido à natureza da reação é um fator limitante que possam afectar a leitura do ensaio. (TR-pinça, desenvolvido pela Heyduk e colegas9, é outra abordagem homogénea para medição de insulina com base na ligação de dois anticorpos separados para diferentes epitopos na molécula de insulina. Os anticorpos são cada DNA encalhado quimicamente ligado à dupla com curto complementares único encalhado DNA saliências. Ligação dos anticorpos à insulina reúne-os e leva a um duplex de DNA encalhado dobro. Cada anticorpo também está associado com um fluoróforo dador ou aceitador respectivo, e a associação do duplex de DNA reúne estes fluorophores para gerar a transferência de energia de ressonância de Förster (FRET). Uma limitação potencial de TR-pinça, baseia-se no entanto, com o traste em si. A incapacidade de dissipar rapidamente fluorescência de fundo durante a reação de FRET pode levar a níveis relativamente elevados de fluorescência de fundo e um baixo sinal à relação de ruído dentro do ensaio. Portanto, ainda existe uma necessidade para um ensaio confiável, robusto e econômico para quantificar GSIS em uma maneira de alta produtividade.
Avanços recentes em Biofísica culminaram no desenvolvimento de um ensaio de transferência (HTRF) com base de ressonância de energia homogênea fluorescência tempo-resolvido. Especificamente, enquanto a energia de transferência dentro o ensaio pode ser descrito como baseado no traste, mais precisamente, HTRF depende da luminescência energia ressonância transferência (LRET)10 que é non-radiative transferência de energia entre o doador e o aceptor espécie de11,12,13. Esta distinção é importante, desde o momento de uma fluorescência ou têmpera interação com base de FRET é muito diferente do que é para LRET, embora os mesmos tipos de retenção podem ser usados para FRET e LRET. Além disso, o uso de terras raras lantanídeos cryptate compostos tais como o európio ou térbio cryptate em HTRF produz fluorescência longa meia-vida de12,14. Isto oferece a vantagem exclusiva da introdução de um atraso de tempo (microssegundos por) entre a excitação do doador e a medição das emissões do aceitador (isto é, tempo-resolvido do ensaio). Este atraso do tempo permite tempo suficiente para que a fluorescência de fundo a dissipar-se antes da medição de fluorescência de emissão aceitador. Consequentemente, a leitura é livre de fluorescência não-específica e assim, uma alta relação sinal-ruído é alcançada (Figura 1). Além disso, a natureza homogênea de HTRF elimina a necessidade de etapas de lavagem para lavar a espécie desacoplada, fazendo o ensaio muito mais rápido do que os métodos baseados em RIA ou ELISA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57531/57531fig1.jpg"> Figura 1: esquemático do mecanismo para a deteção de insulina HTRF. Dois anticorpos monoclonais independentemente gerados especificamente reconhece e vincule a insulina em locais separados. Estes anticorpos são conjugados para o doador de cryptate de európio ou o aceitador de XL665. Excitação do doador em 337 resultados de nm em emissão a 620 nm. A transferência de energia resultante faz com que XL665 emitir um comprimento de onda mais longos, 665 nm. <a href="/files/ftp_upload/57531/57531fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para usar uma abordagem baseada em HTRF para determinar os níveis de GSIS de células INS-1E, uma bem estabelecida insulina secretoras derivado de células beta rato insulinoma célula linha15. Além disso, este ensaio pode ser utilizado para identificar o perfil farmacológico de reguladores moleculares da secreção de insulina. Aplicamos este ensaio de insulina com base em HTRF para examinar a dopamina D2-como o Regulamento do receptor de GSIS. Cada vez mais estudos têm revelado que o neurotransmissor dopamina é um importante regulador do GSIS8,16,17,18,19,20, 21 , 22. dopamina afeta GSIS de maneira autócrina/parácrina negativa através de ações sobre a dopamina D2-como os receptores (D2, D3, receptores de4 D) expressados na superfície de células pancreáticas beta8 , 16 , 19. usando este ensaio, confirmar o papel da dopamina como um regulador negativo de GSIS e demonstrar que a dopamina D2-como receptor agonistas bromocriptina e quinpirole também reduzem GSIS.

<table><tbody><tr><td>96-well white half area plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82050-042</td><td></td></tr><tr><td>384-well white low-volume, round-bottom plate</td><td>Corning</td><td>15100157</td><td></td></tr><tr><td>Insulin High Range Kit</td><td>Cisbio Bioassays</td><td>62IN1PEH&amp;nbsp;</td><td>10,000 test HTRF-based insulin assay kit</td></tr><tr><td>PHERAstar FSX plate reader</td><td>BMG Labtech</td><td>FSX</td><td>Plate reader adapted for HTRF-based assay readings</td></tr><tr><td>Plate sealers</td><td>Fisher Scientific</td><td>DY992</td><td>To seal plate while antibodies incubate</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1x)</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>11875-093</td><td>[+] L-glutamine</td></tr><tr><td>Trypsin 0.05%&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td>0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate</td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>Without calcium and magnesium</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>156-30-080</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin solution 100x</td><td>Corning</td><td>30-002 CT</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M1348</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Dopamine hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>8502</td><td></td></tr><tr><td>Bromocriptine mesylate</td><td>Tocris</td><td>427</td><td></td></tr><tr><td>(-)-Quinpirole hydrochloride</td><td>Tocris</td><td>1061</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Calbiochem</td><td>12659</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td><td>Sigma</td><td>276855</td><td></td></tr></tbody></table>

homogeneous time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer-based assay for detection of insulin secretion

A detecção de secreção de insulina é fundamental para elucidar os mecanismos de secreção regulamentado, bem como em estudos de metabolismo. Apesar de inúmeros ensaios de insulina já existem há décadas, o recente advento da tecnologia de Förster ressonância energia de transferência (HTRF) de tempo-resolvido homogênea simplificou significativamente estas medições. Isto é um ensaio óptico rápido, econômico, reprodutível e robusto depende dos anticorpos conjugados a brilhante fluorophores com emissão de longa duração, que facilita o tempo-resolvido Förster ressonância transferir energia. Além disso, a detecção de insulina HTRF é favorável para o desenvolvimento de ensaios de rastreio com throughput alto. Aqui usamos o HTRF para detectar a secreção de insulina em células INS-1E, uma linha de celular insulinoma-derivado de rato. Isso nos permite estimar os níveis basais de insulina e suas mudanças em resposta à estimulação de glicose. Além disso, nós usamos este sistema de deteção de insulina para confirmar o papel da dopamina como um regulador negativo da secreção de insulina glicose-estimulada (GSIS). De forma semelhante, outros de dopamina D2-como agonistas dos receptores, quinpirole e bromocriptina, reduzem GSIS de forma concentração-dependente. Nossos resultados destacam o utilitário do formato HTRF insulina ensaio para determinar o papel de numerosas drogas em GSIS e seus perfis farmacológicos.

Nós validado o nosso ensaio HTRF de insulina, gerando uma curva padrão de insulina, usando insulina humana purificada padrões predefinidos concentrações (Figura 2). Geração da curva padrão nos permitiu extrapolar as leituras de fluorescência ratiometric e, portanto, para determinar os níveis de insulina secretada em resposta aos tratamentos de drogas (Figura 2). Intraplate variação para o encaixe de curva foi mínima ...

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Homogeneous Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

Aqui, apresentamos homogênea tempo resolvido FRET (HTRF) como um método eficiente para detecção rápida de insulina secretada de células.

Förster homogênea de tempo-resolvido ressonância energia baseada em transferência ensaio para detecção de secreção de insulina

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous ...

homogeneous-time-resolved-frster-resonance-energy-transfer-based

Research

JoVE Journal

Medicine

9.1K visualizações.  University of Pittsburgh. Aqui, apresentamos homogênea tempo resolvido FRET (HTRF) como um método eficiente para detecção rápida de insulina secretada de células.

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Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and amino acids. However, the innate weak signal intensity of FRET sensors is a major challenge that prevents their application in various fields and makes the use of expensive, high-end fluorometers necessary. Previously, we built a cost-effective, high-performance FRET analyzer that can specifically measure the ratio of two emission wavelength bands (530 and 480 nm) to achieve high detection sensitivity. More recently, it was discovered that FRET sensors with bacterial periplasmic binding proteins detect ligands with maximum sensitivity in the critical temperature range of 50 - 55 &#176;C. This report describes a protocol for assessing sugar content in commercially-available beverage samples using our portable FRET analyzer with a temperature-specific FRET sensor. Our results showed that the additional preheating process of the FRET sensor significantly increases the FRET ratio signal, to enable more accurate measurement of sugar content. The custom-made FRET analyzer and sensor were successfully applied to quantify the sugar content in three types of commercial beverages. We anticipate that further size reduction and performance enhancement of the equipment will facilitate the use of hand-held analyzers in environments where high-end equipment is not available.

This protocol describes the rapid and highly sensitive quantification of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensor data using a custom-made portable FRET analyzer. The device was used to detect maltose within a critical temperature range that maximizes detection sensitivity, enabling practical and efficient assessment of sugar content.

Altamente sensível e rápido de detecção de fluorescência com um portátil FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

Bioquímica

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. Screening peptides affords an additional layer of complexity as conventional tip-based sample handling methods expose peptides to a large surface area of plasticware, providing an increased opportunity for peptide loss via adsorption. Preventing excessive exposure to plasticware reduces peptide loss via adherence to plastics and thus minimizes inaccuracies in potency prediction, and we have previously described the benefits of non-contact acoustic dispensing for in vitro high-throughput screening of peptide agonists1. Here we discuss a fully integrated automation solution for non-contact acoustic preparation of peptide serial dilutions in microtiter plates utilizing the example of screening for peptide agonists at the mouse glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). Our methods allow for high-throughput cell-based assays to screen for agonists and are easily scalable to support increased sample throughput, or to allow for increased numbers of assay plate copies (e.g., for a panel of more target cell lines).

Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.

Automated acústico de distribuição para a diluição de série do Peptide agonistas em potência Determinação Ensaios

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be validated for predictive purposes. Ideally such systems would be low volume, which precludes sampling and destructive analyses when time course data are to be obtained. What is needed is an in situ monitoring tool which can report the necessary information in real-time and noninvasively. An interesting option is the use of fluorescent, protein-based in vivo biological sensors as reporters of intracellular concentrations. One particular class of in vivo biosensors that has found applications in metabolite quantification is based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorescent proteins connected by a ligand binding domain. FRET integrated biological sensors (FIBS) are constitutively produced within the cell line, they have fast response times and their spectral characteristics change based on the concentration of metabolite within the cell. In this paper, the method for constructing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines that constitutively express a FIBS for glucose and glutamine and calibrating the FIBS in vivo in batch cell culture in order to enable future quantification of intracellular metabolite concentration is described. Data from fed-batch CHO cell cultures demonstrates that the FIBS was able in each case to detect the resulting change in the intracellular concentration. Using the fluorescent signal from the FIBS and the previously constructed calibration curve, the intracellular concentration was accurately determined as confirmed by an independent enzymatic assay.

A description of how to calibrate F&#246;rster Resonance Energy Transfer integrated biological sensors (FIBS) for in situ metabolic profiling is presented.&#160;The FIBS can be used to measure intracellular levels of metabolites noninvasively aiding in the development of metabolic models and high throughput screening of bioprocess conditions.

FIBS habilitado Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Bioengenharia

Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to cytokines and growth factors. STAT proteins are activated by tyrosine phosphorylation mediated mainly by JAKs. The abnormal activation of STAT signaling pathways is implicated in many human diseases, especially cancer and immune-related conditions. Therefore, the ability to monitor STAT protein phosphorylation within the native cell signaling environment is important for both academic and drug discovery research. The traditional assay formats available to quantify phosphorylated STAT proteins include western blotting and the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). These heterogeneous methods are labor-intensive, low-throughput, and often not reliable (specific) in the case of western blotting. Homogeneous (no-wash) methods are available but remain expensive. 
Here, detailed protocols are provided for the sensitive, robust, and cost-effective measurement in a 384-well format of endogenous levels of phosphorylated STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699), and STAT6 (Y641) in cell lysates from adherent or suspension cells using the novel THUNDER time-resolved F&#246;rster resonance energy transfer (TR-FRET) platform. The workflow for the cellular assay is simple, fast, and designed for high-throughput screening (HTS). The assay protocol is flexible, uses a low-volume sample (15 &#181;L), requires only one reagent addition step, and can be adapted to low-throughput and high-throughput applications. Each phospho-STAT sandwich immunoassay is validated under optimized conditions with known agonists and inhibitors and generates the expected pharmacology and Z'-factor values. As TR-FRET assays are ratiometric and require no washing steps, they provide much better reproducibility than traditional approaches. Together, this suite of assays provides new cost-effective tools for a more comprehensive analysis of specific phosphorylated STAT proteins following cell treatment and the screening and characterization of specific and selective modulators of the JAK/STAT signaling pathway.

Time-resolved F&#246;rster resonance energy transfer cell-based assay protocols are described for the simple, specific, sensitive, and robust quantification of endogenous phosphorylated signal transducer and activator of transcription (STAT) 1/3/4/5/6 proteins in cell lysates in a 384-well format.

Ensaios de transferência de energia de ressonância de Förster para medição de proteínas STAT fosforilatos endogensas em células humanas

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to ...

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-Producing Islet Clusters

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and diabetes treatment. However, challenges remain in obtaining stem cell-derived beta cells that adequately mimic native human beta cells. Building upon previous studies, hPSC-derived islet cells have been generated to create a protocol with improved differentiation outcomes and consistency. The protocol described here utilizes a pancreatic progenitor kit during Stages 1-4, followed by a protocol modified from a paper previously published in 2014 (termed "R-protocol" hereafter) during Stages 5-7. Detailed procedures for using the pancreatic progenitor kit and 400 &#181;m diameter microwell plates to generate pancreatic progenitor clusters, R-protocol for endocrine differentiation in a 96-well static suspension format, and in vitro characterization and functional evaluation of hPSC-derived islets, are included. The complete protocol takes 1 week for initial hPSC expansion followed by ~5 weeks to obtain insulin-producing hPSC islets. Personnel with basic stem cell culture techniques and training in biological assays can reproduce this protocol.

The differentiation of stem cells into islet cells provides an alternative solution to conventional diabetes treatment and disease modeling. We describe a detailed stem cell culture protocol that combines a commercial differentiation kit with a previously validated method to aid in producing insulin-secreting, stem cell-derived islets in a dish.

Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Humanas em Aglomerados de Ilhotas Produtoras de Insulina

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and ...

Biologia do Desenvolvimento

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ECL assay is a nonradioactive fluid phase assay for islet autoantibodies with higher sensitivity and specificity than the current 'gold' standard radio-binding assay (RBA). ECL assays can more precisely define the onset of presymptomatic T1D by distinguishing the high-risk, high-affinity autoantibodies from the low-risk, low-affinity autoantibodies generated in RBAs, and conventional enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). The antigen protein used in this ECL assay is labeled with Sulfo-tag and Biotin, respectively. Each ECL autoantibody assay that uses a particular antigen protein needs an optimization step before it can be used for laboratory application. This step is especially vital in determining the requirements for serum acid treatments, concentrations, and ratios of the two different antigens labeled with Sulfo-tag and Biotin. To perform the assay, serum samples are mixed with Sulfo-tag-conjugated and biotinylated capture antigen protein in phosphate buffered solution (PBS), containing 5% Bovine Serum Albumin (BSA). Afterwards, the samples are incubated overnight at 4 &#176;C. The same day, a streptavidin-coated plate is prepared with blocker buffer and incubated overnight at 4 &#176;C. On the second day, wash the streptavidin plate and transfer the serum-antigen mixture onto the plate. Place the plate on the plate shaker, set it at low speed, and incubate at room temperature for 1 h. Subsequently, the plate is washed again, and reader buffer is added. The plate is then counted on the plate reader machine. The results are conveyed through an index, which is generated from internal standard positive and negative control serum samples.

Here, we presented the methods to detect human islet autoantibodies using electrochemiluminescence (ECL) assays. The protocol, used to predict type 1 diabetes, can be expanded upon to detect autoantibodies for other autoimmune diseases.

Ensaios de eletroquimioluminescência para humano ilhéu auto-anticorpos

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

Imunologia e Infecção

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate "pancreatospheres" in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 &mu;L of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin &beta;B, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.

A three-dimensional clonogenic assay that allows pancreatic-like progenitors to differentiate into insulin-expressing colonies is described. This method takes advantage of semi-solid media containing methylcellulose, Matrigel and growth factors, in which single progenitors proliferate and differentiate in vitro, permitting quantification of the number of functional progenitors in a population.

Uma análise quantitativa para expressar Insulin-formadoras de colônias Progenitores

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Biologia

Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, depending on the specific assay. Secreted luciferase assays expedite results and lower the assay cost per sample substantially. Here we present a relatively underused approach to gauge insulin secretory activity from pancreatic &#946; cells by using Gaussia luciferase genetically inserted within the C-peptide. During proteolytic processing of proinsulin, the C-peptide is excised releasing the luciferase within the insulin secretory vesicle where it is co-secreted with insulin. Results can be obtained within minutes after sample collection because of the speed of luciferase assays. A limitation of the assay is that it is a relative measurement of insulin secretion and not an absolute quantitation. However, this protocol is economical, scalable, and can be performed using most standard luminescence plate readers. Analog and digital multichannel pipettes facilitate multiple steps of the assay. Many different experimental variations can be tested simultaneously. Once a focused set of conditions are decided upon, insulin concentrations should be measured directly using antibody-based assays with standard curves to confirm the luciferase assay results.

This protocol describes how to perform rapid low-cost luciferase assays at medium-throughput using an insulin-linked Gaussia luciferase as a proxy for insulin secretion from beta cells. The assay can be performed with most luminescence plate readers and multichannel pipettes.

Medindo a secreção relativa de insulina usando um substituto de luciferase co-secretado

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, ...

Eventos de sinalização intracelular e secreção hormonal em pseudoilhotas humanas

Human Pseudoislet System for Synchronous Assessment of Fluorescent Biosensor Dynamics and Hormone Secretory Profiles

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, have a central role in the control of glucose homeostasis through the secretion of insulin by beta cells, which lowers blood glucose, and glucagon by alpha cells, which raises blood glucose. Intracellular signaling pathways, including those mediated by cAMP, are key for regulated alpha and beta cell hormone secretion. The 3D islet structure, while essential for coordinated islet function, presents experimental challenges for mechanistic studies of the intracellular signaling pathways in primary human islet cells. To overcome these challenges and limitations, this protocol describes an integrated live-cell imaging and microfluidic platform using primary human pseudoislets generated from donors without diabetes that resemble native islets in their morphology, composition, and function. These pseudoislets are size-controlled through the dispersion and reaggregation process of primary human islet cells. In the dispersed state, islet cell gene expression can be manipulated; for example, biosensors such as the genetically encoded cAMP biosensor, cADDis, can be introduced. Once formed, pseudoislets expressing a genetically encoded biosensor, in combination with confocal microscopy and a microperifusion platform, allow for the synchronous assessment of fluorescent biosensor dynamics and alpha and beta cell hormone secretory profiles to provide more insight into cellular processes and function.

Autor em destaque: Investigando anormalidades e função de ilhotas com um protocolo de pseudoilhotas 

This protocol describes a method for the synchronous acquisition and co-registration of intracellular signaling events and the secretion of insulin and glucagon by primary human pseudoislets using the adenoviral delivery of a cyclic adenosine monophosphate (cAMP) biosensor, a cAMP difference detector in situ (cADDis), and a microperifusion system.

Sistema de Pseudoilhotas Humanas para Avaliação Síncrona da Dinâmica de Biossensores Fluorescentes e Perfis Secretores de Hormônios

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, ...

Förster homogênea de tempo-resolvido ressonância energia baseada em transferência ensaio para detecção de secreção de insulina

Resumo

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Altamente sensível e rápido de detecção de fluorescência com um portátil FRET Analyzer

Automated acústico de distribuição para a diluição de série do Peptide agonistas em potência Determinação Ensaios

FIBS habilitado Noninvasive Metabolic Profiling

Ensaios de transferência de energia de ressonância de Förster para medição de proteínas STAT fosforilatos endogensas em células humanas

Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Humanas em Aglomerados de Ilhotas Produtoras de Insulina

Ensaios de eletroquimioluminescência para humano ilhéu auto-anticorpos

Uma análise quantitativa para expressar Insulin-formadoras de colônias Progenitores

Medindo a secreção relativa de insulina usando um substituto de luciferase co-secretado

Sistema de Pseudoilhotas Humanas para Avaliação Síncrona da Dinâmica de Biossensores Fluorescentes e Perfis Secretores de Hormônios

Sistema de Pseudoilhotas Humanas para Avaliação Síncrona da Dinâmica de Biossensores Fluorescentes e Perfis Secretores de Hormônios