Os ensaios baseados em TR-FRET fornecem novas ferramentas econômicas para a triagem e caracterização farmacológica de moduladores específicos e seletivos das vias de sinalização JAK/STAT. Esta técnica é muito mais fácil, rápida, reproduzível e robusta do que métodos convencionais como a mancha ocidental e a ELISA. Não são necessárias etapas de lavagem e os reagentes são adicionados em uma única etapa.
Esta plataforma de imunoensaio pode ser facilmente aplicada a outras proteínas de sinalização celular, desde que anticorpos específicos estejam disponíveis. Para projetar ensaios reprodutíveis, você deve usar boas práticas de cultura celular e estabelecer procedimentos operacionais padrão. Além disso, você deve otimizar cuidadosamente a cultura celular e as condições de tratamento.
Demonstrando o procedimento estará Genevieve Chatel, uma cientista do nosso laboratório. Para começar, cultura HeLa e células A431 em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono usando DMEM suplementada com 10% de FBS. Quando as células atingem 70 a 80% de confluência, tente-as e seja para passar ou usá-las para ensaios.
Para realizar o ensaio, dispense 50 microliters de células na densidade pré-otimizada em uma placa tratada com cultura de tecido de 96 poços no meio de cultura adequado, em seguida, incuba-los durante a noite em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, prepare a série de diluição intermediária dupla e quatro vezes dos compostos de teste, diluindo o composto em um meio livre de soro em 12 poços de uma placa de polipropileno 96-well. Para estimulação celular, adicione 50 microliters de meio livre de soro contendo o simulador em uma concentração de 2X e incuba as células para o tempo pré-otimizado em temperatura ambiente ou 37 graus.
Para inibição celular, adicione 25 microliters de meio livre de soro contendo o inibidor em uma concentração de 4X e incuba as células para o tempo pré-otimizado em temperatura ambiente ou 37 graus, em seguida, adicione 25 microliters de meio livre de soro contendo o estimulador em uma concentração de 4X e incubar para o tempo pré-otimizado. Em seguida, para lise as células, prepare o tampão de lise suplementada 1X e adicione coquetel inibidor de fosfatase a ele. Depois de remover cuidadosamente e descartar o meio de cultura celular, adicione imediatamente 50 microliters do tampão de 1X suplementado preparado e incubar por 30 minutos à temperatura ambiente sob agitação moderada.
Para detecção de TR-FRET, prepare o mix de detecção de anticorpos 4X no buffer de detecção de 1X e, em seguida, prepare as soluções de anticorpos EUAB1 e FRAB2, bem como as soluções de anticorpos EUAB3 e FRAB4 no buffer de detecção de 1X. Finalmente, misture o EUAB1 pré-diluído com o FRAB2 pré-diluído para detecção de fosfoproteína e EUAB3 pré-diluído e FRAB4 pré-diluído para detecção de proteína total. Em seguida, cuidadosamente pipeta 15 microliters da célula lysate da placa de cultura de 96 poços para um poço de uma microplata branca de baixo volume 384-bem.
Em seguida, adicione 15 microliters do lysate de controle positivo e 15 microliters de tampão de 1X lysis como um controle negativo para poços de ensaio separados. Aos poços que contêm 15 microlitadores do liseto, adicione cinco microliters da mistura correspondente de detecção de anticorpos 4X para detectar a fosfoproteína ou a proteína total. Depois de cobrir a placa com um selador de placa, incuba-o à temperatura ambiente por uma hora a noite, dependendo do kit de ensaio.
Após a conclusão da incubação, remova o selador da placa adesiva e leia a placa em um leitor de microplacão compatível com TR-FRET. Os resultados dos ensaios TR-FRET para detecção e quantificação de fosfo-STAT1 com total STAT1 e phospho-STAT4 em células U266B1, juntamente com fosfo-STAT5 com total STAT5 em células A431 são representados usando curvas de resposta de concentração. Da mesma forma, os ensaios TR-FRET para detecção e quantificação de fosfo-STAT3 e total STAT3 e phospho-STAT6 e total STAT6 em células HeLa são representados usando curvas de resposta de concentração.
No geral, todos os ensaios mostraram sinais TR-FRET robustos, amplas faixas dinâmicas, baixa variação entre os coeficientes entre poços e relações sinal-fundo aceitáveis. O tratamento de células com ativadores JAK, interferon alfa-2B e IL-4 e EGF mostrou o aumento antecipado dependente da concentração na fosforilação STAT em resíduos específicos de tyrosina, enquanto as proteínas STAT totais correspondentes permaneceram estáveis. Tanto o inibidor jak quanto o erlotinib inibiram os níveis correspondentes de fosfo-STAT de forma dependente da concentração.
Os resultados da estimulação fosfo-STAT4 por interferon alfa-2B em uma linha celular de suspensão ou estimulação fosfo-STAT6 por IL-4 em uma linha celular de adesão usando o protocolo de uma placa foram consistentes com aqueles obtidos usando o protocolo de duas placas, mostrando assim a adaptabilidade bem sucedida de um protocolo de transferência de duas placas para um protocolo de poço all-in-one de uma placa. Os resultados do estudo de variabilidade intra-placa para o ensaio fosfo-STAT1 usando uma linha celular de suspensão e o ensaio phospho-STAT3 usando uma linha celular de adesão demonstram a robustez desses ensaios fosfo-STAT para aplicações HTS. É essencial complementar o tampão de lise com o coquetel inibidor de fosfatase para evitar a desfosforilação das proteínas fosfoiladas de fosfartase ativa presente em todo o extrato celular.
